徐帆，朱一翔，盧艷花*

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

煙曲霉酸的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和反應(yīng)器放大研究

徐帆，朱一翔，盧艷花*

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

煙曲霉酸是一種四環(huán)三萜類結(jié)構(gòu)的化合物，具有良好的抗菌活性和抗癌效果。該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)來(lái)源于海洋的煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）CY018發(fā)酵生產(chǎn)煙曲霉酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化及放大培養(yǎng)。結(jié)果表明，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基為甘露醇39.88 g/L，硝酸鈉2.25 g/L，牛肉膏3.54 g/L，丁二酸鈉8.4 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸二氫鉀0.67 g/L。初始pH值調(diào)至4.2，搖瓶裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速160 r/min，28℃培養(yǎng)9 d。在此優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件下，煙曲霉酸的產(chǎn)量達(dá)到68.49 mg/L，為優(yōu)化之前的4.1倍。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了5 L反應(yīng)器的放大研究，在發(fā)酵第7天得到了煙曲霉酸的最大產(chǎn)量為54.81 mg/L。該實(shí)驗(yàn)為HA生產(chǎn)的放大制備與應(yīng)用推廣打下了基礎(chǔ)。

煙曲霉酸；煙曲霉；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化；反應(yīng)器放大

煙曲霉酸（helvolic acid，HA）是煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）次級(jí)代謝得到的四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)類化合物，有著良好的抗菌活性。通過(guò)與青霉素、紅霉素、四環(huán)素共同使用，能夠?qū)瘘S色葡萄球菌等多藥物抵抗的強(qiáng)力細(xì)菌展現(xiàn)有效的抑菌活性[1-4]。另一方面，HA對(duì)于癌細(xì)胞HeLa和HepG2的生長(zhǎng)也展現(xiàn)出了抑制效果。這種抗菌和抗癌的生物活性使HA有著很高的藥用潛力[5]。但是，較低的HA產(chǎn)量限制了它的研究和應(yīng)用推廣。根據(jù)之前的文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)煙曲霉菌CY018液態(tài)發(fā)酵得到的HA最高產(chǎn)量?jī)H為16.88 mg/L[6]。因此，需要通過(guò)優(yōu)化HA的發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)提高產(chǎn)量，并進(jìn)行工藝的放大探索。

根據(jù)目前提高HA產(chǎn)量的研究報(bào)道，WUQ等[6]通過(guò)一株來(lái)源于海洋的海蟹共生菌煙曲霉菌CY018，研究產(chǎn)HA和煙曲霉文丙的共同發(fā)酵條件優(yōu)化。但是，這兩種次級(jí)代謝產(chǎn)物在代謝途徑中有一部分相同的代謝步驟，這表明這兩種產(chǎn)物的合成是存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的。并且，之前的研究只在搖瓶水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但HA的規(guī)?；苽涫墙⒃诜磻?yīng)器放大研究的基礎(chǔ)上的。因此，目前缺少針對(duì)HA的發(fā)酵條件優(yōu)化與反應(yīng)器放大研究。

在發(fā)酵的過(guò)程中，發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)于優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)量很重要。傳統(tǒng)的研究方法僅通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基，但是這種方法并不高效，并且無(wú)法考慮多因素優(yōu)化過(guò)程中各因素之間的相互作用[7]。數(shù)理統(tǒng)計(jì)法（statistic methods）在處理多因素優(yōu)化時(shí)非常高效[8]。通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，能快速?gòu)拇罅恳蛩刂泻Y選出顯著性的因素[9]。通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)（path of steepest ascent）找出各關(guān)鍵因素最適合的濃度范圍[10]。但是這兩種方法僅考慮了一階效應(yīng)，并沒(méi)有涉及各因素的相互作用。為了克服這些限制，采用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM），研究各因素及其交互作用，進(jìn)行回歸分析優(yōu)化工藝過(guò)程參數(shù)，進(jìn)而反映出關(guān)鍵變量的貢獻(xiàn)度并預(yù)測(cè)相應(yīng)的影響規(guī)律[11]。

本實(shí)驗(yàn)以高產(chǎn)HA的菌株海蟹共生菌煙曲霉（Aspergillus fumigatus）CY018為研究對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳氮源，得到合適的培養(yǎng)基組分后，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)找出顯著性因素，通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)找出最優(yōu)濃度范圍，再運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化HA的發(fā)酵培養(yǎng)基。在完成搖瓶水平的優(yōu)化之后，在5 L反應(yīng)器中進(jìn)行了HA規(guī)?；l(fā)酵過(guò)程的初步探索，為今后HA的放大制備與應(yīng)用推廣打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

甲醇、乙酸乙酯（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)TEDIA有限公司；Antifoam 204消泡劑：美國(guó)Sigma有限公司；HA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）：南京大學(xué)譚仁祥教授提供；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株

本研究所采用的HA高產(chǎn)菌株為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）CY018，由南京大學(xué)課題組篩選并提供，菌種的保藏號(hào)為CGMCC No.1371。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，粉碎后加水煮沸30min，用八層紗布過(guò)濾后收集濾液，加10 g葡萄糖，1.5 g硫酸鎂，3 g磷酸二氫鉀，0.05 g維生素B1，加水補(bǔ)足至1 000 mL，分裝后加入2%的瓊脂，121℃滅菌15 min，備用。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏2.5g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，維生素B10.05 g/L。分裝后121℃滅菌15 min，備用。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：甘露醇50 g/L，丁二酸鈉5.4 g/L，硝酸鈉2 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸二氫鉀0.67 g/L。pH調(diào)至4.2，分裝后121℃滅菌15 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SHJ-JP超凈工作臺(tái)：上海凈化設(shè)備廠；SCL-10AVP高效液相色譜（highperformance liquidchromatography，HPLC）：日本島津公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：美國(guó)安捷倫科技公司；ZD-9556水平搖床：太倉(cāng)市教科器材廠；Centrifuge 5415R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)與發(fā)酵條件

將煙曲霉菌（A.fumigatus）CY018接到活化培養(yǎng)基，在28℃的條件下培養(yǎng)5 d，加入50 mL種子培養(yǎng)基和約15顆無(wú)菌小玻璃珠，輕微振蕩，讓菌體懸浮均勻，把2 mL的懸浮液移入到裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，在28℃的條件下培養(yǎng)36 h。將種子液以10%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，28℃條件下發(fā)酵9 d。

1.3.2 建立HA的HPLC檢測(cè)方法

樣品預(yù)處理：將發(fā)酵液抽濾，收集菌體和發(fā)酵液。將菌體置于60℃烘箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量后加入研缽碾磨以破碎細(xì)胞，加入發(fā)酵液中，用等體積的乙酸乙酯萃取2遍，將有機(jī)相收集于離心管中。將萃取液裝入250mL圓底燒中，在45℃的條件下減壓蒸發(fā)，然后加入10 mL的甲醇超聲溶解，取2 mL溶解液于EP管中，在轉(zhuǎn)速13 000 r/min條件下離心，取上清液至2mLEP管中，保存于4℃冰箱待測(cè)。

HA標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：用天秤準(zhǔn)確稱量HA標(biāo)準(zhǔn)品1.3 mg，加入1 mL甲醇溶解，然后稀釋10倍，用微孔濾膜過(guò)濾，測(cè)定制作HA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

洗脫條件：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸水溶液，B相為純乙腈。采用梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures of mobile phase

檢測(cè)條件：紫外檢測(cè)檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫箱溫度：30℃，流速：1 mL/min。

1.3.3 發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定菌體干質(zhì)量（dry cell weight，DCW）來(lái)判斷煙曲霉菌CY018的生長(zhǎng)狀態(tài)，通過(guò)比色法測(cè)定殘?zhí)橇浚ǜ事洞迹12]，以了解發(fā)酵過(guò)程中碳源的消耗水平。通過(guò)pH電極測(cè)定發(fā)酵液的pH。通過(guò)溶氧電極測(cè)定發(fā)酵液的溶氧量（dissolved oxygen，DO）。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

氮源的確定：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了4種有機(jī)氮源（添加量均為3 g/L的蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、玉米粉），在種子培養(yǎng)36 h之后，以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床的轉(zhuǎn)速為160 r/min，pH調(diào)整為4.2，在28℃的條件下發(fā)酵9 d，測(cè)定發(fā)酵液中HA的產(chǎn)量。

碳源的確定：把基礎(chǔ)培養(yǎng)基的甘露醇替換為不同的碳源（添加量均為34 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖），在種子培養(yǎng)36 h之后，以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床的轉(zhuǎn)速為160 r/min，pH調(diào)整為4.2，在28℃的條件下發(fā)酵9 d，測(cè)定發(fā)酵液中HA的產(chǎn)量。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

（1）Plackett-Burman試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 8設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)來(lái)篩選能影響HA產(chǎn)量的顯著性因素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素包括甘露醇（A）、硝酸鈉（B）、硫酸鎂（C）、硫酸亞鐵（D）、磷酸二氫鉀（E）、丁二酸鈉（F）和牛肉浸膏（G）添加量。分別對(duì)各個(gè)因素設(shè)置高水平和低水平添加量，以發(fā)酵結(jié)束后HA的產(chǎn)量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design g/L

（2）最陡爬坡試驗(yàn)

通過(guò)Placket-Burman試驗(yàn)找出的顯著性因素后，采用最陡爬坡試驗(yàn)找出HA產(chǎn)量最高的數(shù)據(jù)作為之后優(yōu)化的最優(yōu)范圍。

（3）Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)所選出的最優(yōu)中心范圍，通過(guò)Design Expert8軟件，以最陡爬坡試驗(yàn)確定的中心點(diǎn)為中間水平，對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)因素設(shè)置3個(gè)水平進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化HA的產(chǎn)量。

1.3.6 反應(yīng)器放大研究

在完成了數(shù)理統(tǒng)計(jì)優(yōu)化后，進(jìn)行5L反應(yīng)器的發(fā)酵試驗(yàn)，初步探索工藝放大。在5 L反應(yīng)器中填裝3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，加入0.5%（V/V）的Antifoam 204消泡劑。將種子液以10%（V/V）的接種量接入，初始pH值調(diào)整為4.2，通氣量為6L/min，攪拌速率設(shè)定為300 r/min，發(fā)酵溫度設(shè)置為28℃。在5 L反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程中觀察發(fā)酵液的pH、菌體干質(zhì)量（DCW）、殘?zhí)橇?、溶氧量（DO）。同時(shí)，也進(jìn)行了搖瓶水平的代謝曲線研究，以比較反應(yīng)器放大發(fā)酵過(guò)程與搖瓶發(fā)酵的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源與碳源對(duì)HA產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)研究了4種有機(jī)氮源及6種碳源對(duì)煙曲霉菌CY018發(fā)酵產(chǎn)HA的影響，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，與其他氮源相比，牛肉膏對(duì)于煙曲霉菌的生物量積累和HA的產(chǎn)量效果最好。這可能是由于相比于其他氮源，牛肉膏這類復(fù)雜氮源能提供更多的營(yíng)養(yǎng)元素[13]，適合菌體的生長(zhǎng)和代謝[14]。除了氮源以外，碳源也參與到細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞組分形成，提供能量與合成代謝物[15]。由圖1B可知，與其他碳源相比，添加甘露醇的培養(yǎng)基得到了最高的HA產(chǎn)量。這可能是由于甘露醇是一種緩釋碳源，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累[16]。可溶性淀粉不利于菌體生長(zhǎng)和HA的積累，這可能是由于真菌較難分解利用大分子質(zhì)量的碳水化合物[17]。

圖1 不同氮源(A)及碳源(B)對(duì)煙曲霉酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources(A)and carbon sources(B) on helvolic acid production

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，采用方差分析來(lái)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見表4。由表4可知，該模型的F值為17.17且P值為0.007 7＜0.01，表明該模型極顯著，且決定系數(shù)R2為0.967 8，校正決定系數(shù)R2adj為0.911 4，表示該響應(yīng)方程可以為Plackett-Burman試驗(yàn)的提供合適的模型。試驗(yàn)的精確度以變異系數(shù)（variation coefficient，CV），CV值越低，表明試驗(yàn)的可靠性越高，設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的CV=2.75%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信[18]。甘露醇及牛肉浸膏對(duì)HA的合成顯示了極顯著的影響（P＜0.01），硝酸鈉對(duì)HA的合成顯示了顯著的影響（P＜0.05），其他因素對(duì)HA的合成無(wú)顯著的影響。該結(jié)果證實(shí)氮源與碳源對(duì)煙曲霉菌CY018發(fā)酵制備HA起到了很大的作用[19]。在測(cè)試的7種因素中，Na2C2O4對(duì)HA的產(chǎn)量呈現(xiàn)了正效應(yīng)，甘露醇、硝酸鈉與牛肉浸膏等其他因素呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)。根據(jù)這一結(jié)果，選擇甘露醇，硝酸鈉與牛肉膏這三種因素進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

表3Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的3個(gè)顯著性因素（甘露醇，硝酸鈉與牛肉浸膏），通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)尋找合成HA的培養(yǎng)基各因素的最優(yōu)范圍。由于甘露醇，硝酸鈉以及牛肉浸膏均對(duì)HA的合成呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)，因此將3種因素的添加量按照遞減的順序設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

由表5可知，在第2組爬坡梯度中（甘露醇42.5 g/L，硝酸鈉2.5 g/L，牛肉浸膏3.75 g/L）得到了最高的HA產(chǎn)量65.8mg/L，說(shuō)明這一組添加水平已經(jīng)最接近于HA合成曲面的最高值。因此，將這一組添加水平作為之后Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)找到的最優(yōu)中心范圍，用軟件Design Expert 8設(shè)計(jì)了3種顯著性因素的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，因素編碼水平見表6，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表6Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 6 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表7Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

采用Design Expert 8軟件對(duì)表7試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重回歸分析，得到了關(guān)于HA產(chǎn)量（Y）的擬合二次多項(xiàng)式模型方程如下：

Y=+61.21-2.71×A-2.12×B+2.05×G-2.63×A×B+1.34×A× G+1.94×B×G-4.51×A2+2.75×B2-0.63×G2

根據(jù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用F-test來(lái)評(píng)估了方差分析模型的數(shù)據(jù)顯著性，得到的F值為8.91，P值為0.004 4＜0.05，表示方程具有顯著性。甘露醇、NaNO3、牛肉浸膏這三個(gè)因素的P值分別為的0.012 6，0.013 8，0.016 2，均＜0.05，說(shuō)明該試驗(yàn)研究的因素均已經(jīng)達(dá)到了顯著差異水平。試驗(yàn)的信噪比為11.231＞4，表示該模型具有足夠的信號(hào)[20]。模型決定系數(shù)R2為0.919 7，表示在該響應(yīng)面內(nèi)有91.97%的變異性可以用此多項(xiàng)式方程進(jìn)行描述[21]，說(shuō)明該模型可以用來(lái)分析預(yù)測(cè)煙曲霉菌CY018發(fā)酵產(chǎn)HA的量。

為了更直觀的理解各因素對(duì)HA產(chǎn)量的影響，并獲得最優(yōu)的培養(yǎng)基組合，使用DesignExpert8軟件獲得了二次方程的三維響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖2。

圖2 甘露醇、硝酸鈉及牛肉浸膏添加量交互作用對(duì)煙曲霉酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between mannitol,sodium nitrate and beef extract addition on helvolic acid production

根據(jù)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，當(dāng)培養(yǎng)基中3種因素添加量分別為甘露醇39.88 g/L，硝酸鈉2.25 g/L，牛肉膏3.54 g/L時(shí)，預(yù)測(cè)的HA最高產(chǎn)量能達(dá)到67.53 mg/L。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證HA產(chǎn)量擬合方程的最優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行了3次發(fā)酵，得到的HA平均產(chǎn)量為68.49 mg/L，與67.53 mg/L的預(yù)測(cè)值僅相差1.42%，證明了Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效性，該數(shù)據(jù)模型能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)HA的產(chǎn)量。相比于最初的發(fā)酵水平，培養(yǎng)基優(yōu)化后HA產(chǎn)量達(dá)到了原先的4.1倍。

2.6 反應(yīng)器放大

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了搖瓶水平和5 L反應(yīng)器水平的發(fā)酵，以比較兩種培養(yǎng)條件下菌體發(fā)酵的差異。在發(fā)酵的過(guò)程中記錄兩者的發(fā)酵參數(shù)。搖瓶及5 L反應(yīng)器水平的代謝曲線見圖3。

圖3 搖瓶(A)及5 L反應(yīng)器(B)水平煙曲霉菌發(fā)酵生產(chǎn)煙曲霉酸的代謝曲線Fig.3 Metabolism curves ofAspergillus fumigatusfermentation for helvolic acid production in shake flask(A)and 5 L bioreactor(B)

由圖3可知，相比于搖瓶，5 L反應(yīng)器中菌體生長(zhǎng)更快，DCW在發(fā)酵的第72小時(shí)就達(dá)到了14.15 g/L。這可能是由于反應(yīng)器中更好的傳質(zhì)效果和供氧。搖瓶和反應(yīng)器中都在第144小時(shí)檢測(cè)到了HA，這表示煙曲霉菌在從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入到穩(wěn)定期時(shí)開始合成HA。反應(yīng)器中的HA產(chǎn)量在第168小時(shí)（第7天）達(dá)到了最高值54.81 mg/L。這可能是由于曲霉真菌次級(jí)代謝受到氧化應(yīng)激所調(diào)控[22]，而5 L反應(yīng)器中有更充足的供氧水平，抑制了HA的合成積累。

5 L反應(yīng)器與搖瓶水平發(fā)酵液中殘?zhí)堑南呐c菌體生長(zhǎng)曲線均呈現(xiàn)了一定的相關(guān)性。當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期，殘?zhí)堑南乃俣葴p緩，此時(shí)的殘?zhí)窍目赡苁怯糜诰S持菌體以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成積累。在第216小時(shí)，發(fā)酵液中的殘?zhí)腔鞠耐耆?，此時(shí)生物量下降，表明煙曲霉菌開始自溶。同時(shí)，發(fā)酵液中的HA濃度也開始降低，這可能是由于殘?zhí)呛谋M后菌體開始分解次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)維持菌體自身。

5 L反應(yīng)器與搖瓶水平的發(fā)酵液pH在發(fā)酵的過(guò)程中總體逐步提升，這可能是由于氮源的持續(xù)消耗和氨根離子的釋放[23]。DO值在發(fā)酵早期快速下降，利于菌體的快速生長(zhǎng)[24]。在菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌體只需要維持自身的生理需求，所以DO值達(dá)到穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了煙曲霉菌CY018發(fā)酵生產(chǎn)HA的培養(yǎng)基優(yōu)化和初步放大探索。通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法優(yōu)化培養(yǎng)基后，將HA的產(chǎn)量提高到了68.49 mg/L，為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的4.1倍。優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘露醇39.88 g/L，硝酸鈉2.25 g/L，牛肉膏3.54g/L，丁二酸鈉8.4g/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸二氫鉀0.67 g/L。將優(yōu)化后的培養(yǎng)基應(yīng)用于5 L反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵，得到了HA的最高產(chǎn)量為54.81 mg/L，為HA的放大制備進(jìn)行了初步的探索。

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Optimization of fermentation medium for helvolic acid production and reactor scale-up study

XU Fan,ZHU Yixiang,LU Yanhua*
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Department of Bioengineering,East China University of Science&Technology, Shanghai 200237,China)

Helvolic acid is a kind of tetracyclic triterpenoids,which shows effective antimicrobial activity and anticancer effect.On the basis of single factor experiment,the medium for marine derivedAspergillus fumigatusCY018 culture for helvolic acid production was optimized,and scale-up fermentation was studied.The optimal fermentation conditions were obtained as follows:mannitol 39.88 g/L,NaNO32.25 g/L,beef extract 3.54 g/L, Na2C2O48.4 g/L,MgSO40.3 g/L,FeSO40.01 g/L,KH2PO40.67 g/L.The optimal fermentation condition was initial pH 4.2,rotation liquid volume 50 ml/250 ml,shake speed 160 r/min,temperature 28℃for 9 d.Under the optimal condition,the yield of helvolic acid could achieve 68.49 mg/L, which was 4.1 times of the yield before optimization.The study of 5 L bio-reactor was conducted,and the maximum helvolic acid production of 54.81 mg/L was achieved in 7 d,which laid foundation for helvolic acid preparation and application.

helvolic acid;Aspergillus fumigatus;fermentation medium;optimization;reactor scale-up

TQ920.6

0254-5071（2017）04-0131-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.028

2017-02-13

國(guó)家‘863’計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA092901）；生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家重點(diǎn)基金（2060204）

徐帆（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锇l(fā)酵。

*通訊作者：盧艷花（1968-），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锕こ碳夹g(shù)在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用。