徐艷

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

黑曲霉利用紅薯粉生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵條件研究

徐艷

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

對黑曲霉利用紅薯粉生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。采用單因素試驗考察發(fā)酵時間、培養(yǎng)基紅薯粉含量、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH對檸檬酸產(chǎn)量的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用正交試驗確定黑曲霉利用紅薯粉生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間60 h、培養(yǎng)基紅薯粉含量40 g/L，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，初始pH值6.0。在此條件下，檸檬酸產(chǎn)量達4.81 g/L。

黑曲霉；檸檬酸；發(fā)酵條件

檸檬酸被稱為第一食用酸味劑，在食品工業(yè)上極廣泛地用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、除腥脫臭劑、螯合劑等[1]。檸檬酸的生產(chǎn)方法主要有三大類，一是用萃取、吸附、膜分離、工業(yè)色譜等分離純化的方法從檸檬、橙等水果中提??；二是以草酰乙酸與乙烯酮為原料的合成；三是發(fā)酵法。提取法單元操作繁瑣、提取效率普遍偏低，且需要大量的輔料，還存在廢水排放等問題[2-3]?；瘜W(xué)合成方法工藝流程復(fù)雜，設(shè)備和成本要求高，且安全性又很低，因而并不是主流的生產(chǎn)檸檬酸方法。發(fā)酵法工藝簡單，生產(chǎn)效率高，成本低，無污染，是目前國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)采用的方法[4-6]。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一類在自然界廣泛存在的腐生真菌，多見于土壤、糧食、藥材、蟲體、枯枝落葉、動物糞便、霉腐物等中。黑曲霉是重要的工業(yè)微生物，可以發(fā)酵生產(chǎn)有機酸、淀粉酶、纖維素酶等[7]。黑曲霉對發(fā)酵條件要求較低，生長迅速，對培養(yǎng)基原料適應(yīng)性強，并且產(chǎn)量穩(wěn)定，當前99%的檸檬酸產(chǎn)出于黑曲霉發(fā)酵[8]。紅薯大約含有20%的淀粉，制成干粉的紅薯可直接進行深層發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸[9-11]。李忠英[12]對產(chǎn)檸檬酸黑曲霉初始含糖量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、起始pH、轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件進行了優(yōu)化試驗。

目前，我國是世界上最大的檸檬酸生產(chǎn)國和出口國，檸檬酸的發(fā)酵技術(shù)也處在世界先進水平，用于食品加工的檸檬酸接近70%，在國內(nèi)，由于不含酒精飲料對檸檬酸的需求較大，市場需求每年以3%～5%的速度增長。我國種植紅薯面積廣泛，薯類資源豐富，加之黑曲霉菌種適應(yīng)性很好，對原料的要求低，生產(chǎn)產(chǎn)量相對比較穩(wěn)定，薯類發(fā)酵的條件要求比較低，不需額外添加含氮化合物、無機鹽以及其他促進產(chǎn)酸的試劑即可進行。將紅薯制成干粉后發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，一方面可以減少固體物料的處理量，使之易于操作，另一方面還可以綜合利用這些作物的其他組分。紅薯相較于其他薯類，在產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率方面有一定的優(yōu)勢。

本研究在分析單因素對紅薯粉發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸影響的基礎(chǔ)上，進行正交試驗，研究各因素綜合對產(chǎn)生檸檬酸的影響，以期為檸檬酸的生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003：中國食品藥品檢定研究院。

紅薯粉：興化市綠咖園食品有限公司。

1.1.2 試劑

α-高溫淀粉酶（5萬U/mL）：湖南省新鴻鷹生物工程有限公司；葡萄糖（純度99.5%）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、亞硝酸鈉（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀（分析純）：河南焦作市化工三廠；硫酸鎂（分析純）：天津化學(xué)試劑一廠；氯化銨（分析純）：天津市泰興試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡糖糖30.0 g，NH4Cl 3.0 g，KH2PO41.0 g，瓊脂15.0 g，加入1 L超純水中煮至微沸，待完全溶解后冷卻至50℃左右分裝，備用。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g，NaNO33.0 g，KH2PO41.0 g，加入1 L超純水中煮至微沸，待完全溶解后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至6.0分裝，冷藏備用。

紅薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基：紅薯粉50 g（過20目篩），葡萄糖50 g，NH4Cl 5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加超純水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.0，按10 U/g原料加入α-高溫淀粉酶，攪拌至均勻，加熱至微沸，保持15 min，待冷卻后用0.1%碘液檢測不顯藍色即為糖化完全。四層紗布過濾后于立式滅菌鍋徹底滅菌，冷藏備用。

1.2 儀器與設(shè)備

AB145-S電子天平：上海上天精密儀器有限公司；DH-600恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；YXQ-LS-50SII立式滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RH-QW恒溫搖床：金壇市天竟實驗儀器廠；SW-CJ-JF單人雙面凈化工作臺：蘇州金凈科技有限公司；SHZ-DIII真空抽濾泵：上海予華儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與擴大培養(yǎng)

將黑曲霉在無菌條件下用接種環(huán)挑取少許，均勻接種在斜面培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)3 d，至斜面長滿黑色孢子從而制得斜面菌種，4℃冷藏備用。

無菌條件下挑取少許活化的黑曲霉菌種于液體種子培養(yǎng)基，35℃恒溫搖床培養(yǎng)，直至長出分布均勻的球狀菌落（不宜過大，否則后期發(fā)酵菌種分布不均），4℃冷藏備用[12]。

1.3.2 紅薯粉糖化

配制1 L培養(yǎng)基：稱取紅薯粉50 g過20目篩，用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.0，按10 U/g原料加入α-高溫淀粉酶，攪拌均勻后加熱至微沸，保持15 min，冷卻后用0.1%碘液檢測，不顯藍色即為糖化完全。過濾后徹底滅菌，4℃冷藏備用[13]。

1.3.3 檸檬酸產(chǎn)量測定

將發(fā)酵后的發(fā)酵液過濾，棄去濾渣，取5 mL發(fā)酵液于50mL錐形瓶中，加入2滴酚酞指示劑后搖勻，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，至溶液剛好變色，且半分鐘紅色不褪去。記下消耗的NaOH溶液的體積，重復(fù)進行3次試驗，取平均值[12-13]。檸檬酸產(chǎn)量計算公式如下：

式中：n為檸檬酸產(chǎn)量，g/L；c為NaOH溶液的濃度，mol/L；M為檸檬酸的分子質(zhì)量，g/mol；V為消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；1 000為體積換算倍數(shù)；3為滴定時一分子檸檬酸消耗3分子NaOH。

1.3.4 單因素試驗

選取黑曲霉發(fā)酵條件過程中4個關(guān)鍵因素，即發(fā)酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h）、培養(yǎng)基紅薯粉含量（35g/L、40g/L，45g/L、50g/L、55g/L和60g/L）、初始pH（5.2、5.6、6.0、6.4、6.8和7.2）和搖床轉(zhuǎn)速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min和500 r/min）進行單因素試驗，考察這4個因素對檸檬酸產(chǎn)量的影響。

1.3.5 正交試驗[14-15]

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以檸檬酸產(chǎn)量為評價指標，進行L9（34）正交試驗設(shè)計，從而優(yōu)化黑曲霉利用紅薯粉生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of citric acid produced byAspergillus niger

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對黑曲霉利用紅薯粉產(chǎn)檸檬酸的影響

圖1 發(fā)酵時間對檸檬素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of fermentation time on citric acid yield

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，檸檬酸產(chǎn)量呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢，在48 h之前，黑曲霉處于調(diào)整期與對數(shù)生長期主要表現(xiàn)為適應(yīng)環(huán)境，大量繁殖，檸檬酸產(chǎn)量較少；當黑曲霉發(fā)酵48 h后，檸檬酸產(chǎn)量上升的趨勢明顯減緩，說明黑曲霉在48 h左右達到平穩(wěn)期。而48 h左右黑曲霉達到平穩(wěn)期，開始大量積累檸檬酸。在48 h之后，檸檬酸的產(chǎn)量雖然一直維持穩(wěn)定，但是由于菌種的大量繁殖，消耗的營養(yǎng)物質(zhì)也會迅速增加，發(fā)酵周期也過長，因此，選擇48 h為最佳的發(fā)酵時間。

2.2 培養(yǎng)基紅薯粉含量對黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的影響

圖2 培養(yǎng)基紅薯粉含量對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of medium sweet potato powder contents on citric acid yield

由圖2可知，隨著培養(yǎng)基紅薯粉含量的增加，檸檬酸的產(chǎn)量先上升后稍有下降，再逐漸趨于平穩(wěn)。當紅薯粉含量＜40 g/L時，黑曲霉生長受到抑制，不能繁殖足夠多的菌體，菌體濃度偏低，導(dǎo)致產(chǎn)酸量偏低；當紅薯粉含量＞40 g/L，黑曲霉菌體濃度過大，產(chǎn)物合成受到抑制，生產(chǎn)速率反而下降。因此，選擇培養(yǎng)基紅薯粉含量40 g/L為宜。

2.3 初始pH對黑曲霉利用紅薯粉產(chǎn)檸檬酸的影響

圖3 初始pH對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of initial pH on citric acid yield

由圖3可知，隨著培養(yǎng)基中初始pH增大，檸檬酸產(chǎn)量先上升后下降。當初始pH值為5.2～6.4時，檸檬酸產(chǎn)量逐漸增加；當初始pH值為6.4時，黑曲霉利用紅薯粉產(chǎn)檸檬酸量達到最大，為4.02 g/L；當初始pH值＞6.4時，檸檬酸產(chǎn)量開始下降。培養(yǎng)基中初始pH值過高或過低時，菌體內(nèi)的酶活性普遍受到抑制，酶活力活力下降導(dǎo)致其催化的反應(yīng)速率下降；高的H+或OH-濃度還會改變基質(zhì)或中間產(chǎn)物的解離度，改變膜的通透性，使代謝的速率減緩。因此選擇初始pH6.4為宜。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對黑曲霉產(chǎn)利用紅薯粉檸檬酸的影響

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of shaking rotate speed on citric acid yield

由圖4可知，檸檬酸的產(chǎn)量隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而迅速變大，當搖床轉(zhuǎn)速＞200 r/min時；黑曲霉的產(chǎn)檸檬酸量趨于穩(wěn)定，無明顯增加。說明培養(yǎng)基達到一定轉(zhuǎn)速后，滿足了黑曲霉生長所需的氧氣量。因此選擇搖床轉(zhuǎn)速200 r/min為宜。

2.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行黑曲霉利用紅薯粉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of citric acid produced byAspergillus niger

由表2可知，RA＞RC＞RB＞RD，4種因素對檸檬酸產(chǎn)量影響大小依次為發(fā)酵時間（A）＞初始pH（C）＞培養(yǎng)基紅薯粉含量（B）＞搖床轉(zhuǎn)速（D）。

根據(jù)K值可知，最佳因素組合為A2B1C2D1，即發(fā)酵時間60 h，發(fā)酵培養(yǎng)基紅薯粉含量為40 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，在此發(fā)酵條件下進行3次驗證試驗，檸檬酸的產(chǎn)量平均值為4.81 g/L，高于正交試驗各組的產(chǎn)量。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，4個因素都對黑曲霉利用紅薯粉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸有極顯著的影響（P＜0.01），4個因素影響的主次順序為發(fā)酵時間（A）＞初始pH（C）＞培養(yǎng)基紅薯粉含量（B）＞搖床轉(zhuǎn)速（D），與極差分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗以紅薯粉為原料，采取黑曲霉發(fā)酵法制取檸檬酸。對紅薯粉利用紅薯粉產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵條件進行了研究。通過單因素試驗和正交設(shè)計試驗，得出黑曲霉利用紅薯粉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的最佳條件為發(fā)酵時間60 h、發(fā)酵培養(yǎng)基紅薯粉含量40 g/L，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 6.0。在此條件下，檸檬酸產(chǎn)酸量可達4.81 g/L。

目前國內(nèi)市場對檸檬酸的需求較大，而我國紅薯產(chǎn)量高，本研究將紅薯制成干粉后發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，能夠?qū)r(nóng)產(chǎn)品利用提供新的途徑，為檸檬酸的生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

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Fermentation conditions of citric acid production byAspergillus nigerusing sweet potato powder

XU Yan
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

The fermentation conditions of citric acid production byAspergillus nigerusing sweet potato powder were optimized.The effects of fermentation time,sweet potato powder content in medium,shaking rotate speed and initial pH on citric acid yield were investigated by single factor experiments.On the basis of single factor experiments,the fermentation conditions were determined as time 60 h,sweet potato powder content 40 g/L, shaking rotate speed 200 r/min and initial pH 6.0 by orthogonal experiments.Under the conditions,the citric acid yield was up to 4.81 g/L.

Aspergillus niger;critic acid;fermentation conditions

TS261.12

0254-5071（2017）04-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.027

2016-11-25

荊楚理工學(xué)院新農(nóng)村研究項目（2016Z002）

徐艷（1981-）女，講師，碩士，研究方向為植物資源開發(fā)與利用。