袁洪威，陳湖芳，高東民，劉學策，郭博愷，李祝*

（1.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽550025）

分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的研究

袁洪威1，陳湖芳1，高東民1，劉學策1，郭博愷2，李祝1*

（1.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽550025）

采用分光光度計測定黑曲霉（Aspergillus niger）xj在不同生長期、不同稀釋倍數下孢子懸液的OD600nm值，對比血球板計數法得到的孢子懸液濃度，研究在對數期和穩(wěn)定期OD600nm值與孢子濃度之間的關系；采用微電影拍攝法觀察黑曲霉xj產孢結構形成過程，并繪制固體發(fā)酵條件下的生長曲線。結果表明，在10～20倍稀釋區(qū)間內，稀釋倍數與OD600nm值之間呈現良好線性關系（對數期R2=0.984 8、穩(wěn)定期R2=0.991 3），且OD600nm值與孢子濃度之間也保持良好的線性關系（對數期R2=0.995 3、穩(wěn)定期R2=0.993 6）；通過微電影拍攝法觀察到黑曲霉xj產孢結構形成是分階段進行的過程；在固體發(fā)酵過程中，孢子濃度呈現“S”型增長趨勢。該研究為測定絲狀真菌孢子濃度提供另一種可借鑒的方法。

分光光度法；黑曲霉；孢子濃度；產孢結構；生長曲線

黑曲霉（Aspergillus niger）屬于半知菌類曲霉屬[1]，是曲霉屬真菌中的一個常見種。黑曲霉作為一種潛在的生防菌劑，對于由齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起的超過500種植物（如大麥、豇豆、辣椒、花生和大豆[2-6]等）病害有良好的抑制效果。此外，黑曲霉作為一種優(yōu)良的工業(yè)菌株，在食品加工和代謝物（如有機酸和抗菌素）提取方面有廣泛應用[7-10]。目前，在黑曲霉的開發(fā)和利用方面取得了顯著的成果，吳鵬等[12]利用Plackett-Burman（PB）試驗和Box-Behnken（BB）試驗對黑曲霉HS-5產β-葡萄糖酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，使β-葡萄糖酶產率提高了5.91倍。這就要求對其生長過程中菌體的生長變化，產孢結構的形成狀況以及孢子量積累規(guī)律等要有更加清楚的了解，以便指導工業(yè)發(fā)酵和基礎研究。生長曲線反映了培養(yǎng)過程中生長和繁殖的規(guī)律，同一種黑曲霉在不同的生長條件下生長曲線也不盡相同，通過生長曲線了解菌體的生長繁殖情況，對于根據不同的需求有效地利用黑曲霉具有重要的意義。

為更好地開發(fā)這種生防菌劑，為工業(yè)生產提取大量原料，需要大量黑曲霉孢子來支持生產和研發(fā)工作。測定孢子數量的方法主要有直接血球板計數法和間接平板菌落計數法[11]，這些方法均較復雜，耗時，精確度低，所以在實際應用中需要尋找更加便捷且精確度高的測定方法。在釀酒酵母的開發(fā)利用中，苑偉等[13]采用分光光度法，以菌懸液OD值來衡量釀酒酵母對乙醇的耐受性，ANDREW W等[14]利用OD值作為衡量高產菌株基因與環(huán)境相互作用的指標。

以分光光度法測定細胞濃度的研究已有報道[11，17]，但黑曲霉xj作為一種絲狀真菌，分光光度法在該類真菌中的應用還少見報道。通過測定黑曲霉不同生長時期、不同稀釋條件下OD600nm值，對比血球板計數法測得的孢子濃度，尋找OD600nm值與孢子濃度之間的關系，探究用分光光度法測定黑曲霉孢子懸液濃度的可行性。此外，采用微電影拍攝法對黑曲霉xj產孢結構形成過程進行研究，在固體發(fā)酵條件下繪制出孢子濃度增長曲線，驗證分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的實用性，為測定絲狀真菌孢子濃度提供另一種可借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存（No：M206021）；麥麩：汝州市華豫面業(yè)有限公司；土豆：市售；葡萄糖：成都金山化學試劑有限公司；瓊脂粉：上海微生物科技有限公司；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，自來水1 L，pH自然。121℃滅菌20 min。

麥麩（wheat bran）培養(yǎng)基：麥麩與自來水按照料液比1∶1（g∶mL）混合，拌勻，pH 7.5。121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

UV757CRT型紫外分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；CX31型數碼生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司；PHS-3D型pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

挑取斜面黑曲霉菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)5 d，備用。

1.3.2 孢子懸液的制備

無菌條件下以0.1%（V/V）吐溫-80溶液沖洗培養(yǎng)基表面，制成孢子懸液并在4℃條件下保存，孢子懸液濃度采用血球板計數法得到。

1.3.3 固體發(fā)酵方法

麥麩培養(yǎng)基在121℃滅菌20 min后，無菌條件下接入黑曲霉xj孢子懸液2 mL（1×105～2×105個/mL），混勻后置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)。

1.3.4 分光光度法測孢子懸液OD值

取制備好的孢子懸液，在波長λ=600 nm處測定光密度值（OD600nm），使OD600nm值在0.1～0.8[15-16]，并分別利用血球板計數法測定孢子濃度。

1.3.5 OD600nm值與稀釋倍數回歸方程的建立

分別取對數期和穩(wěn)定期的孢子懸液，記錄稀釋倍數與具體的OD600nm值，以稀釋倍數為自變量，OD600nm值為因變量建立回歸方程。

1.3.6 OD600nm值與孢子濃度回歸曲線的繪制

分別取對數期和穩(wěn)定期的孢子懸液，控制OD600nm在 0.1～0.8之間，以OD600nm為橫坐標，孢子濃度為縱坐標繪制回歸曲線。

1.3.7 黑曲霉產孢結構的觀察

取孢子懸液2mL（1×105～2×105個/mL）接種于麥麩培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)，分別于2 h、6 h、8 h、22 h、27 h、32 h、35 h、37 h時用粘片法[11]觀察黑曲霉產孢結構的形成動態(tài)。

1.3.8 黑曲霉生長曲線的繪制

取孢子懸液2 mL（1×105～2×105個/mL）接種于麥麩培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)，分別于0、40 h、64 h、88 h、112 h、120 h、144 h、168 h、192 h時隨機取樣以分光光度法測孢子濃度，繪制黑曲霉生長曲線。

1.3.9 數據處理

每組實驗均在相同條件下重復3次，所有實驗均以平均值±標準偏差（±s）形式表示，所有圖像由Minitab17.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 OD600nm值與稀釋倍數回歸方程的建立

黑曲霉在不同生長時期下，隨機取一定質量樣品制成孢子懸液，利用分光光度法測定不同稀釋倍數下λ=600 nm時的OD值，以OD600nm表示。用直接血球板計數法測定對應時間點的孢子懸液濃度，結果如表1所示。

表1 黑曲霉xj不同生長期、不同稀釋條件下孢子懸液的OD600nm值和孢子濃度的關系Table 1 Relationship of OD600nmvalue and spore concentration of A.nigerxj spore suspension under different growth stages and dilution ratios

利用OD600nm值來衡量細胞濃度時必須把OD600nm值回歸到統(tǒng)一的標準上才可以比較[17]。由表1研究發(fā)現，無論處于對數期還是穩(wěn)定期，不同的稀釋倍數范圍下，稀釋倍數與OD600nm值之間有不同的線性關系，數據的穩(wěn)定性（即標準差）不同。將稀釋倍數為2～10倍、10～20倍、20～30倍作為三個區(qū)間，然后在相應區(qū)間內對OD600nm值進行分段線性回歸，結果如表2所示。由表2可知，在10～20倍稀釋區(qū)間內，對數期時稀釋倍數與OD600nm值相關系數R2=0.984 8，穩(wěn)定期時二者間相關系數R2=0.9913，無論對數期還是穩(wěn)定期均表現出較其他稀釋區(qū)間更明顯的線性關系，且在此稀釋區(qū)間內標準差較小，數據的穩(wěn)定性和可靠性較高，分段回歸方程可以用于OD600nm回歸值的計算。

表2 黑曲霉xj孢子懸液不同稀釋區(qū)間OD600nm值分段回歸方程Table 2 Piecewise regression equations of OD600nmofA.nigerxj spore suspension in different dilution range

2.2 不同生長期孢子濃度與OD600nm值的關系

在10～20倍稀釋區(qū)間內，OD600nm值穩(wěn)定在0.1～0.8之間，數據可靠度高；OD600nm值標準差小，數據的穩(wěn)定性好。為了探究OD600nm值與孢子濃度之間的關系，在10～20倍稀釋區(qū)間內，選取了對數期和穩(wěn)定期的孢子懸液來研究黑曲霉xj不同生長期OD600nm值與血球計數板計數所得的孢子濃度之間的關系，結果見圖1。

由圖1A可知，在對數期OD600nm值與孢子數量之間存在良好的線性關系，回歸方程和為y=6.663 71x+0.096 50，相關系數R2=0.995 3，當OD600nm為0.618時，孢子數量為4.20×106個/mL。在對數期，OD600nm值和孢子濃度之間呈現良好的線性關系，說明在這一時期，菌體細胞生長旺盛，產孢結構成熟并穩(wěn)定產生孢子，衰老或死亡很少發(fā)生，可以用OD600nm值較為準確地反映孢子濃度。

同樣，由圖1B可知，在穩(wěn)定期OD600nm值與孢子濃度之間仍存在良好的線性關系，回歸方程為y=6.8755x+0.1372，相關系數R2=0.993 6，當OD600nm值為0.618時，孢子數量為4.39×109個/mL。穩(wěn)定期OD600nm值和孢子濃度之間呈現良好的線性關系表明，即使菌體生長進入穩(wěn)定期，但孢子數量不受菌體的生長情況和營養(yǎng)環(huán)境的影響，而是保持相對恒定的數量水平，所以在穩(wěn)定期仍可以用OD600nm值較為準確地反映孢子濃度。

圖1 對數期（A）及穩(wěn)定期（B）OD600nm值與孢子濃度的關系Fig.1 Relationship between OD600nmvalue and spore concentration in log phase(A)and stable phase(B)

對比對數期和穩(wěn)定期OD600nm值和孢子濃度之間的回歸方程可知，孢子濃度的大小僅與OD600nm值存在唯一線性關系，不同的生長期對于二者之間的線性關系沒有影響。當OD600nm=0.618時，二者的孢子濃度分別為4.20×106個/mL和4.39×106個/mL，標準差S=1.34×105。在科學研究中，很多情況下對于微生物孢子濃度有明確要求，利用血球計數板測定孢子濃度比較繁瑣且主觀因素影響較大，故利用OD600nm與孢子濃度之間的關系，可以及時準確地了解孢子濃度，而且兩者之間的線性關系不受微生物生長期的影響，具有很好的普適性。

2.3 黑曲霉產孢結構的動態(tài)觀察和孢子濃度增長曲線的

繪制

采用微電影拍攝的方法研究黑曲霉xj從孢子萌發(fā)到產孢結構成熟并開始散落孢子的整個過程，結果如圖2所示。

由圖2可知，黑曲霉xj產孢結構的形成分階段進行，產孢結構的形成開始于營養(yǎng)菌絲充分生長、形成菌絲網之后。培養(yǎng)2 h時，孢子萌發(fā)產生芽管，開始營養(yǎng)生長；培養(yǎng)6 h時，隨著營養(yǎng)菌絲不斷進行頂端生長，菌絲直徑增加，菌絲開始分支；培養(yǎng)22 h時，菌絲不斷分支，分支的菌絲交織形成復雜的菌絲網，在菌絲網上開始分化產生生殖菌絲，產孢結構初見雛形，頂囊已經形成；培養(yǎng)27 h時，在成熟的頂囊上開始產生一輪小梗；培養(yǎng)32 h時，一輪小梗生長成熟，開始產生二輪小梗；培養(yǎng)35 h時，二輪小梗生長完成，至此產孢結構完全形成，開始產生孢子；培養(yǎng)37 h時，孢子成熟，從二輪小梗上散落下來，孢子數量開始增加。

圖2 黑曲霉xj產孢結構Fig.2 Conidial fructification ofA.nigerxj

在麥麩培養(yǎng)基中隨機取一定質量樣品制成孢子懸液，用分光光度法測得孢子懸液濃度，繪制黑曲霉xj生長曲線見圖3。

圖3 黑曲霉xj生長曲線Fig.3 Growth curve ofA.nigerxj

由圖3可知，孢子濃度的增長呈S形曲線。發(fā)酵時間0～40 h為生長遲緩期，該時期孢子數量基本不增加，主要是營養(yǎng)菌絲的快速生長和產孢結構的形成，此時還沒有成熟的孢子從產孢結構上散落，與圖2觀察到的結果相符；發(fā)酵時間50～100h為生長對數期，該時期孢子數量急劇上升，主要由于產孢結構已經發(fā)育成熟，大量的孢子從產孢結構上散落，營養(yǎng)環(huán)境優(yōu)越，有足夠的營養(yǎng)物質供其持續(xù)、大量地產孢；發(fā)酵時間100～168 h為生長穩(wěn)定期，該時期孢子數量維持在一個相對恒定的水平不再增加，推測主要是營養(yǎng)物質的制約，發(fā)酵過程中各種有害物質的積累以及菌絲的衰老、死亡，產孢結構的退化無法繼續(xù)產孢；發(fā)酵時間168～192 h出現衰亡的趨勢，孢子濃度未出現明顯的下降（P＞0.05），主要由于發(fā)酵時間較短，還未檢測到明顯的衰亡期。

3 結論

本研究采用分光光度法測定黑曲霉xj在不同生長期、不同稀釋條件下的OD600nm值，研究不同生長期OD600nm值與稀釋倍數、OD600nm值與孢子濃度之間的關系。結果表明，無論對數期還是穩(wěn)定期，在10～20倍稀釋區(qū)間內，OD600nm值與稀釋倍數之間保持良好的線性關系，在此稀釋區(qū)間內，OD600nm值介于0.1～0.8之間，可以很好地滿足分光光度計的測定要求，數據可信度高，OD600nm值標準差小，數據波動小，可重復性好；同時，OD600nm值與孢子濃度之間也保持有良好的線性關系。

此外，通過微電影拍攝法記錄黑曲霉xj產孢結構形成的動態(tài)過程，對于黑曲霉xj產孢結構形成過程中的動態(tài)變化有了較為清楚地認識。繪制固體發(fā)酵過程中孢子濃度增長曲線，驗證了分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的實用性。本研究用OD值來反映培養(yǎng)體系中孢子濃度，為絲狀真菌的生產以及基礎研究中有關孢子濃度的測定提供了理論指導，為測定絲狀真菌孢子濃度提供另一種可借鑒的方法。

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Determination ofAspergillus nigerspores concentration by spectrophotometry

YUAN Hongwei1,CHEN Hufang1,GAO Dongmin1,LIU Xuece1,GUO Bokai2,LI Zhu1*
(1.College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Provincial People's Hospital,Guiyang 550025,China)

OD600nmvalues ofAspergillus nigerxj spore suspension was determined by spectrophotometer under different growth stages and dilution ratios,comparing to the spore suspension concentration which was determined by the blood bat counting method,the relationship between OD600nmvalue and spore concentration in log phase and stable phase were investigated.The micro film shooting method was used to observe the forming process ofA.nigerxj conidial fructification and the growth curve of spore under a solid-state fermentation condition was drawn.The results showed that in the 10-20 times dilution range,it showed a good linear relationship between dilution ratio and OD600nmvalue(log phaseR2=0.984 8,stable phaseR2=0.991 3),and there also had a good linear relationship between OD600nmvalue and spore concentration(log phaseR2=0.995 3,stable phase R2=0.993 6).Moreover,it could be observed that the formation ofA.nigerxj conidial fructification was a stage process through the micro film shooting method,and spore concentration showed a"S"type growth trend during a solid-state fermentation.The study provided another referential method for the determination of filamentous fungal spore concentration.

spectrophotometry;Aspergillus niger;spore concentration;conidial fructification;growth curve

Q939.96

0254-5071（2017）04-0122-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.026

2016-10-24

貴州省社發(fā)公關[SY（2014）3053];國家自然科學基金項目（31460486）；貴州省農業(yè)公關[NY（2014）3033]；國家級大學生創(chuàng)新訓練項目[2015（006）]；畢節(jié)煙草公司自然科學基金項目[2011（06）]

袁洪威（1996-），男，本科生，研究方向為微生物農藥。

*通訊作者：李祝（1978-），女，教授，博士，研究方向為微生物農藥。