曹新志，趙迎慶，楊建剛，劉佳，任林生

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.山東潤牧生物科技有限公司，山東臨沂276600）

姬松茸發(fā)酵種齡篩選及發(fā)酵動力學分析

曹新志1，趙迎慶2，楊建剛1，劉佳1，任林生1

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.山東潤牧生物科技有限公司，山東臨沂276600）

研究了不同種齡對姬松茸液體發(fā)酵過程中菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量、蔗糖利用率的影響，并運用動力學分析的方法對姬松茸菌體發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量、蔗糖利用率、溶氧進行相關(guān)分析。結(jié)果表明，4 d種齡的姬松茸發(fā)酵液的菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量和蔗糖利用率均優(yōu)于其他種齡的姬松茸發(fā)酵液，且通過5 L發(fā)酵罐放大試驗菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量、蔗糖利用率分別為1.417 g/100 mL、6.967 g/L、82.5%，較搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)分別提高了45.37%、20.41%、5.87%。通過各發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性分析表明，姬松茸液體深層發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量同蔗糖利用率、溶氧之間存在一定的相關(guān)性。

姬松茸；液體發(fā)酵種齡；胞外多糖；蔗糖利用率；動力學分析

姬松茸（Agaricus blazeiMurill）又稱巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇[1-3]，是一種珍稀的食藥兼用真菌[4-5]。其所含的生物活性物質(zhì)（如糖類、多肽、甾醇、食用纖維等），具有明顯的抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血糖、降血壓、抗輻射、調(diào)節(jié)機體代謝、保護腎臟、抗疲勞、改善骨質(zhì)疏松等作用[6-8]。據(jù)報道姬松茸多糖、蛋白具有抑制腫瘤、抗誘變、增強機體免疫功能、保護肝臟、抗毒素及抗氧化等保健功能[9-10]，因此姬松茸的開發(fā)利用越來越受到人們的關(guān)注。以前多采用姬松茸子實體進行研究和工業(yè)生產(chǎn)，近年來，隨著對食藥用真菌研究的深入及其商品化程度的深入，早已不再僅利用其子實體作為食品和藥品，而是利用液體發(fā)酵技術(shù)對其進行發(fā)酵培養(yǎng)為其商品化提供了更為簡便、快捷、有效的途徑。

食藥用真菌的液體培養(yǎng)已成為發(fā)酵工程技術(shù)中重要的一部分，利用該技術(shù)生產(chǎn)菌絲體，充分顯示出生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、成本低、質(zhì)量可控的優(yōu)勢。此外，目前姬松茸的很多研究集中在其搖瓶發(fā)酵的影響因素，如培養(yǎng)基篩選、培養(yǎng)條件、多糖提取工藝、多糖活性研究等方面[11]。目前國內(nèi)外對姬松茸液體發(fā)酵種齡展開工作研究的甚少，董秀萍等[12]研究了姬松茸種齡對胞外多糖、胞外酶的影響，結(jié)果表明，發(fā)酵期間菌種生長的快慢和產(chǎn)物合成的多少在很大程度上取決于種子的質(zhì)量。種子質(zhì)量一般是指接種種齡和接種量的選擇，最適的發(fā)酵接種種齡對姬松茸增殖、胞外產(chǎn)物的積累影響很大。一般種齡選擇對數(shù)生長的中后期，此時菌種其遺傳特性穩(wěn)定，并對其所處的環(huán)境條件已經(jīng)適應，因此合適種齡對姬松茸生長及代謝都有顯著的影響。本試驗研究了種齡對姬松茸液體發(fā)酵過程中生物量、殘?zhí)橇?、胞外多糖含量的影響，并采? L發(fā)酵罐對最適種齡姬松茸菌種進行發(fā)酵動力學分析，以期對姬松茸液體發(fā)酵、產(chǎn)品分離及降低生產(chǎn)成本、姬松茸產(chǎn)品的開發(fā)、工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

姬松茸菌種（菌種編號ABM-3）：華中農(nóng)業(yè)大學菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硝酸鉀、硫酸銨、尿素、間苯二酚（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博基生物技術(shù)有限責任公司；工業(yè)玉米漿：天津利發(fā)隆化工科技有限公司；蔗糖、馬鈴薯、麩皮、玉米粉、黃豆粉：購于自貢農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·5H2O 0.2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·5H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖57.5 g/L，工業(yè)玉米漿2.05 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·5H2O 0.2 g/L，維生素B10.01 g/L，pH自然。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IB型超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；G2-250-S型恒溫培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設備有限公司；YX-280B型手提式蒸汽壓力滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設備廠；SKY-2102C型全溫型恒溫振動搖床：上海滬粵明科學儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；722型分光光度計分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 液體種子的培養(yǎng)

將姬松茸菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中活化12 h。在無菌條件下，從已經(jīng)活化的斜面菌種中，挑取4～5塊約0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊，接種到裝液量為100 mL/200 mL的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種的菌苔要薄，這樣可使接種的菌苔漂浮在培養(yǎng)基液面上，靜置培養(yǎng)48 h[13]，然后在25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)4 d。

1.3.2 姬松茸液體發(fā)酵曲線的繪制

無菌條件下，用移液管吸取10 mL種子液，接種到裝液量為90 mL/200 mL的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，編號1～14，每組做5組平行試驗，置于25℃、150 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)，按照編號每隔12 h測定發(fā)酵液中菌體干質(zhì)量，繪制姬松茸液體發(fā)酵曲線。

1.3.3 種齡對姬松茸液體發(fā)酵的影響

依據(jù)姬松茸液體發(fā)酵曲線，無菌條件下，分別取10 mL 3～7 d種齡的種子液接種到裝液量為90 mL/200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組做3組平行試驗，置于25℃、150 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)，按照編號每隔24 h測定發(fā)酵液中菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量、蔗糖利用率。

1.3.4 檢測方法

姬松茸發(fā)酵液菌絲體干質(zhì)量的測定：參照周選圍[14]的方法進行測定，即為姬松茸發(fā)酵生物量。

胞外多糖的提取及其含量的測定：發(fā)酵結(jié)束后，2 500 r/min離心發(fā)酵液，收集上清液，于40℃減壓濃縮至原體積的1/3左右，取50 mL濃縮上清液，加入283 mL無水乙醇至乙醇體積分數(shù)為85%，4℃靜置過夜，2 500 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)恒溫干燥箱干燥至質(zhì)量恒定，最后用蒸餾水溶解粗多糖至50 mL，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[15]測定其還原糖含量，苯酚-硫酸法測定總糖[16]。獲得還原糖含量的標準曲線回歸方程為y=0.880 2x-0.024 4；R2=0.998 3；總糖含量的標準曲線回歸方程為y=0.189 3x+0.000 4；R2=0.999 4。姬松茸胞外多糖含量的計算公式如下：

式中：P為姬松茸胞外多糖含量，g/L；T為總糖含量，g/L；R為

還原糖含量，g/L；S為蔗糖含量，g/L。

蔗糖利用率的測定：采用Roe比色法[17]測定姬松茸發(fā)酵液中蔗糖含量，計算蔗糖利用率。蔗糖利用率計算公式如下：

式中：R為蔗糖利用率，%；C1為發(fā)酵液中蔗糖初始含量，g/L；C2為發(fā)酵過程中蔗糖測定量，g/L。

溶氧（dissolvedoxygen，DO）消耗的測定：發(fā)酵液溶氧采用溶氧電極進行測定，其溶氧值在發(fā)酵罐控制屏中直接顯示。培養(yǎng)基滅菌結(jié)束循環(huán)水浴降溫至發(fā)酵溫度，向培養(yǎng)基通風攪拌至溶解氧達到飽和，此時溶氧電極讀數(shù)定義為100.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸液體發(fā)酵曲線

依次收集編號1～14號姬松茸發(fā)酵液，繪制姬松茸液體發(fā)酵曲線如圖1所示。由圖1可知，姬松茸初始加入量為0.07 g/100 mL，培養(yǎng)時間0～0.5 d時，菌絲體干質(zhì)量緩慢增加，培養(yǎng)時間0.5～3d時，菌絲體干重增加迅速，當培養(yǎng)時間為3 d時，菌絲體干質(zhì)量增長趨向平穩(wěn)，此時菌絲體干質(zhì)量為0.643 g/100 mL，3～6 d菌絲體干質(zhì)量平穩(wěn)增加，6 d過后菌絲體干質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢，因此根據(jù)姬松茸液體發(fā)酵曲線選擇種齡為3～6 d的姬松茸菌體進行下一步試驗。

圖1 姬松茸菌體液體發(fā)酵曲線Fig.1 Liquid fermentation curve ofAgaricus blazeiMuril

2.2 不同種齡姬松茸對發(fā)酵液生物量的影響

考察不同種齡姬松茸對發(fā)酵液生物量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，不同種齡姬松茸菌體發(fā)酵液中生物量均呈先增加后減少的趨勢，當發(fā)酵4 d時，各種齡的發(fā)酵液中生物量均達到最大值，其中種齡為4d的姬松茸發(fā)酵液中生物量最大，為0.774 g/100 mL，優(yōu)于其他種齡的姬松茸發(fā)酵液生物量，原因可能是種齡為4 d的姬松茸菌體生長達到了平穩(wěn)期，這時菌體活性強，接種到新的培養(yǎng)環(huán)境中能夠很快的適應環(huán)境，菌體迅速增長。因此，確定4 d為姬松茸發(fā)酵接種最適種齡。

圖2 不同種齡姬松茸對發(fā)酵液菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different inoculum ages ofAgaricus blazeiMurill on mycelia dry mass

2.3 不同種齡姬松茸對發(fā)酵液蔗糖利用率的差異

考察不同種齡姬松茸對蔗糖利用率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，蔗糖利用率總體呈上升趨勢。其中種齡為4 d的姬松茸液體母液的蔗糖利用率要優(yōu)于其他種齡姬松茸液體母液，蔗糖利用率可達到77.71%，主要是因為種齡為4 d的姬松茸液體母液菌體生長旺盛，能夠很好地利用培養(yǎng)基中的蔗糖，因此4 d種齡的姬松茸液體母液蔗糖利用率最高。

圖3 不同種齡姬松茸對蔗糖利用率的影響Fig.3 Effect of different inoculum ages ofAgaricus blazeiMurill on sucrose utilization ratio

2.4 不同種齡姬松茸對發(fā)酵液胞外多糖含量的影響

分別將3～6 d種齡的姬松茸發(fā)酵液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔24 h取樣檢測胞外多糖含量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在菌體發(fā)酵初期胞外多糖含量增長總體呈現(xiàn)平緩態(tài)勢，當培養(yǎng)到第3天時，發(fā)酵液中胞外多糖含量增長速度開始增加；當培養(yǎng)到第6天時，胞外多糖含量增長速度趨于平緩，最終達到5.545 g/L；4 d種齡的姬松茸液體發(fā)酵液中胞外多糖含量高于其他種齡姬松茸發(fā)酵，因此，4 d種齡姬松茸液體母液胞外多糖含量最高。

圖4 不同種齡姬松茸對胞外多糖含量的影響Fig.4 Effect of different inoculum ages ofAgaricus blazeiMurill on extracellular polysaccharide content

2.5 姬松茸5 L發(fā)酵罐發(fā)酵曲線及其動力學分析

通過不同種齡對姬松茸發(fā)酵影響的研究，4 d種齡姬松茸的生物量、蔗糖利用率、胞外多糖含量均優(yōu)于其他種齡姬松茸，因此選擇4 d種齡為宜。為了進一步了解最適發(fā)酵種齡的發(fā)酵情況，本研究采用5 L發(fā)酵罐進行放大實驗，研究發(fā)酵過程中姬松茸菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量、蔗糖利用率、溶氧量的變化，并對姬松茸液體發(fā)酵曲線進行動力學分析，闡述姬松茸菌體發(fā)酵生長狀況，結(jié)果見圖5。對各發(fā)酵參數(shù)利用SPSS20進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

圖5 姬松茸發(fā)酵動力學曲線Fig.5 Fermentation dynamics curve ofAgaricus blazeiMurill

由圖5可知，在發(fā)酵第3天時，姬松茸菌體干質(zhì)量已經(jīng)達到了最大值，主要原因可能是發(fā)酵罐的高溶氧通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速造成的。較搖床培養(yǎng)姬松茸發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量提前1 d到達發(fā)酵最高點，此時姬松茸菌絲體干質(zhì)量為1.417 g/100 mL，較搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)提高了45.37%，由溶氧曲線可知，發(fā)酵過程前期（0～1.5 d）的溶氧變化很小，這是由于發(fā)酵初期菌體生長速度緩慢造成的，隨著發(fā)酵的進行，溶氧開始明顯的下降，姬松茸菌絲體經(jīng)過適應期發(fā)酵后，進入對數(shù)生長期，菌體的大量增殖快速消耗培養(yǎng)基中的氧氣。由表1相關(guān)性分析可知，姬松茸菌絲體干質(zhì)量與溶氧相關(guān)系數(shù)為-0.986（P＜0.01），菌絲體干質(zhì)量與蔗糖利用率相關(guān)系數(shù)0.915（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，同時也印證了圖5中姬松茸菌體干質(zhì)量、溶氧變化曲線、蔗糖利用率曲線。發(fā)酵液中胞外多糖含量和蔗糖利用率與菌絲體干質(zhì)量相關(guān)系數(shù)為-0.947（P＜0.01），胞外多糖含量與溶氧相關(guān)系數(shù)為-0.929（P＜0.01），說明姬松茸分泌的胞外多糖含量與蔗糖利用率和溶氧量有著密切的關(guān)系。隨著菌體的快速生長，當發(fā)酵進入平穩(wěn)期后，產(chǎn)生大量的胞外多糖，發(fā)酵液中蔗糖利用率隨菌體的生長不斷增加，當發(fā)酵到第7天時，菌體生長速度減慢，胞外多糖的產(chǎn)量漸趨達到最大值，此時胞外多糖含量為6.967 g/L，蔗糖利用率為82.5%，較搖床發(fā)酵培養(yǎng)分別提高了20.41%、5.87%。發(fā)酵到第7天以后，由于菌體的自溶和發(fā)酵液中各種酶的存在，多糖被酶降解，發(fā)酵液的胞外多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢度；而蔗糖利用率增長速率也開始減緩。

表1 姬松茸發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of fermentation parameters of Agaricus blazeiMurill

通過5 L發(fā)酵罐放大試驗及動力學分析，結(jié)果表明，姬松茸菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量同溶氧和蔗糖利用率之間存在一定相關(guān)性，通過與搖床發(fā)酵培養(yǎng)對比，5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)在菌絲體干質(zhì)量、胞外多糖含量、蔗糖利用率方面均優(yōu)于搖床發(fā)酵培養(yǎng)。

3 結(jié)論

本試驗通過測定不同種齡對姬松茸發(fā)酵液中生物量、蔗糖利用率和胞外多糖含量，研究了種齡對姬松茸液體發(fā)酵的影響，并對姬松茸發(fā)酵動力學進行了分析。結(jié)果表明，4d種齡的姬松茸發(fā)酵液的生物量、蔗糖利用率和胞外多糖含量均優(yōu)于其他種齡的姬松茸發(fā)酵液。通過對4 d種齡姬松茸進行5L發(fā)酵罐放大試驗結(jié)果表明，菌絲體干質(zhì)量為1.417 g/100 mL、胞外多糖含量6.967 g/L和蔗糖利用率為82.5%，較搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)分別提高了45.37%、20.41%和5.87%；通過各發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性分析表明，姬松茸液體深層發(fā)酵姬松茸菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量同溶氧和蔗糖利用率之間存在一定相關(guān)性，為姬松茸液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論支持和技術(shù)支持。

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Screening of inoculum age and fermentation dynamics analysis ofAgaricus blazeiMurill

CAO Xinzhi1,ZHAO Yingqing2,YANG Jiangang1,LIU Jia1,REN Linshen1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Shandong Runmu Bio-technology Co.,Ltd.,Linyi 276017,China)

The effects of inoculum age ofAgaricus blazeiMurill on mycelia dry mass,extracellular polysaccharide content and sucrose utilization ratio during liquid fermentation were researched.And the correlation of mycelia dry mass,extracellular polysaccharide content,sucrose utilization ratio and dissolved oxygen(DO)were analyzed by dynamics analysis method.The results showed that mycelia dry mass,extracellular polysaccharide content and sucrose utilization ratio ofAgaricus blazeiMurill with inoculum age 4 d were all better than that of other inoculum age,and were 1.417 g/100 ml,6.967 g/L and 82.5%,respectively,by 5 L fermenter tests,which was 45.37%,20.41%and 5.87%higher than that of shake flask fermentation culture.The correlation analysis of fermentation parameters showed that the mycelia dry mass and extracellular polysaccharide content ofAgaricus blazeiMurill in submerged fermentation had a certain correlation with sucrose utilization ratio and dissolved oxygen DO.

Agaricus blazeiMurill;inoculums age of the fermentation;exopolysaccharides;sucrose utilization;dynamics analysis

TS201.1

0254-5071（2017）04-0114-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.024

2016-07-25

四川省省屬高?？蒲袆?chuàng)新團隊項目（16TD0026）

曹新志（1965-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。