孟丹，王麗群，謝國(guó)梁，劉曉艷，于純淼，國(guó)立東*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱150086）

一株乳酸乳球菌產(chǎn)γ-氨基丁酸能力及其安全性評(píng)價(jià)

孟丹1，王麗群2，謝國(guó)梁1，劉曉艷1，于純淼1，國(guó)立東1*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱150086）

探討了乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力，并初步評(píng)價(jià)了其安全性。以γ-氨基丁酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸的發(fā)酵條件，即接種量為4%、初始pH值6.5，發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時(shí)間60 h，其發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度可達(dá)218.7 μg/mL。通過(guò)硝基還原酶活性檢測(cè)、生物胺產(chǎn)生能力分析、吲哚試驗(yàn)和溶血性試驗(yàn)，初步評(píng)價(jià)了菌株HUCM 201的安全性，發(fā)現(xiàn)其硝基還原酶陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，無(wú)溶血，不能產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺和腐胺生物胺類物質(zhì)，可初步認(rèn)為是一株安全的益生菌。

乳酸菌；γ-氨基丁酸；生物胺；安全性

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱[1]，其作為工業(yè)微生物應(yīng)用具有悠久的歷史，廣泛用于酸奶、開(kāi)菲爾、泡菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)。繼“酸奶長(zhǎng)壽說(shuō)”提出之后，乳酸菌對(duì)人體健康的有益作用一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，目前公認(rèn)的益生功能主要包括：調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、降膽固醇[4]、降血壓[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7-8]、抗過(guò)敏[9]等。然而，這些益生功能并不是所有乳酸菌的共性，不同種屬的乳酸菌甚至是同一種屬的不同株之間益生功能也不盡相同，但也有集兩種以上益生功能于一身的乳酸菌菌株，如鼠李糖乳桿菌GG株（LGG）[10-11]。課題組先前從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品—開(kāi)菲爾發(fā)酵乳中分離到一株乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株，益生特性良好[12]且體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)了其降膽固醇作用[13-14]。菌株HUCM 201是否還具有其他益生功能仍不清楚，另外，盡管乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的，但仍有個(gè)別關(guān)于乳酸菌引起感染事件的報(bào)道[15-17]。鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)乳酸乳球菌乳亞種菌株HUCM 201產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的能力進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，包括硝基還原酶活性、生物胺產(chǎn)生能力、吲哚生成以及溶血性試驗(yàn)，旨在為其作為益生菌應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）HUCM 201菌株：來(lái)源于開(kāi)菲爾發(fā)酵乳，實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定并保存。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS（mMRS）培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[18]的方法配制：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，葡萄糖20.0g，吐溫-801.0g，乙酸鈉5.0g，七水硫酸鎂0.58g，四水硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，蒸餾水加至1 L，用HCl調(diào)至pH 6.2，121℃濕熱滅菌15 min。

LB培養(yǎng)（基用于培養(yǎng)大腸桿菌）：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水加至1 L，調(diào)pH值至7.4，121℃濕熱滅菌15 min。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptonesoybroth，TSB）培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌）：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨3.0g，葡萄糖2.5 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，蒸餾水加至1 L，調(diào)pH值至pH 7.2±0.2，121℃濕熱滅菌15 min。

胰蛋白胨酵母膏葡萄糖（tryptone yeast glucose，TYG）液體培養(yǎng)基（用于發(fā)酵培養(yǎng)）參照文獻(xiàn)[19]配制：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，丁二酸鈉5.0 g，蒸餾水加至1 L，HCl調(diào)至pH 6.8，121℃濕熱滅菌15 min。

硝基還原酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基（用于檢測(cè)乳酸菌的硝基還原酶活性）：蛋白胨10.0 g，硝酸鉀1.0 g，加蒸餾水至1 L，pH值調(diào)至pH 7.4，121℃滅菌15 min。

氨基酸脫羧酶檢測(cè)培養(yǎng)基（用于檢測(cè)乳酸菌是否產(chǎn)生生物胺）：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉0.25 g，葡萄糖0.5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳2.0 g，硫酸亞鐵0.04 g，檸檬酸銨2 g，維生素B1 0.01g，磷酸氫二鉀2.0 g，碳酸鈣0.1 g，磷酸吡哆醛0.05 g，吐溫-80 0.06 g，溴甲酚紫0.06 g，蒸餾水加至1 L，調(diào)至pH 5.8～6.0，121℃濕熱滅菌15 min。

酪胺、組胺、尸胺或腐胺檢測(cè)培養(yǎng)基，是在上述培養(yǎng)基中分別添加10.0g的酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸。

1.1.3 試劑

γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；L-谷氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基：貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三乙胺、正己烷、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)Merck公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀：安捷倫（中國(guó)）科技有限公司；AE200分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DM2500顯微鏡：上海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BXM-30R全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；TGL-20bR離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株，在37℃條件下培養(yǎng)于mMRS培養(yǎng)基中。試驗(yàn)前用mMRS液體培養(yǎng)基至少活化3次。大腸桿菌培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)在TSB培養(yǎng)基中，均采用37℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵液的制備

將活化后的乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株按1%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液離心后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后得無(wú)菌上清液，供HPLC檢測(cè)分析。

（1）單因素試驗(yàn)條件優(yōu)化

分別考察不同發(fā)酵時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、初始pH值（pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、發(fā)酵溫度（28℃、31℃、34℃、37℃、40℃）以及接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)乳酸菌發(fā)酵液中GABA積累量的影響。

（2）正交試驗(yàn)條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH值和接種量為影響因素，以GABA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵液γ-氨基丁酸的檢測(cè)

（1）高效液相色譜條件

色譜柱采用Syncronis-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為50 mmol/L醋酸鈉（pH 6.5）-5%乙腈溶液，流動(dòng)相B為80%乙腈溶液，流速1.0 mL/min，柱溫為35℃進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度程序見(jiàn)表2；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表2 分離γ-氨基丁酸梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for γ-aminobutyric acid separation

（2）衍生化處理

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液或供試無(wú)菌上清液200 μL，加入3 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL、0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h，加入400 μL正己烷充分混勻，靜置10 min，取下層溶液，再次加入400 μL正己烷，充分混勻，靜置10 min。吸取下層溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取20 μL樣品進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。

1.3.4 硝基還原酶活性檢測(cè)

供試菌株按1%接種量接種于硝基還原酶檢測(cè)培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)72 h，依次向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入α-萘胺溶液和對(duì)氨基苯甲磺酸溶液，觀察培養(yǎng)基顏色的變化。大腸桿菌ATCC 25922為陽(yáng)性對(duì)照菌株。未接種細(xì)菌的硝基還原酶檢測(cè)培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.5 生物胺產(chǎn)生能力檢測(cè)

供試菌株接種于含0.1%氨基酸（酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸）和0.005%的5′-磷酸吡哆醛的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，分別劃線于酪胺、組胺、尸胺、腐胺檢測(cè)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h后觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化。同空白培養(yǎng)基相比，若培養(yǎng)基呈黃色則為陰性結(jié)果；若培養(yǎng)基呈紅色或紫色則為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.6 吲哚試驗(yàn)

供試菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)72 h，加入吲哚試劑8～10滴觀察顏色變化。若液面出現(xiàn)玫瑰紅色則為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性結(jié)果。大腸桿菌ATCC 25922為陽(yáng)性對(duì)照菌株。未接種細(xì)菌的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.7 溶血試驗(yàn)

供試菌株劃線接種于含質(zhì)量濃度5 g/100 mL人體血液的哥倫比亞瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍變化情況。若菌落周圍形成透明圈則為β-溶血；若出現(xiàn)綠色圈，則為α-溶血；若無(wú)溶血環(huán)，則為γ-溶血，也稱無(wú)溶血。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為陽(yáng)性參照菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HUCM 201發(fā)酵液中GABA的定量分析

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株培養(yǎng)于含1%谷氨酸的TYG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后，采用柱前衍生化高效液相色譜方法對(duì)發(fā)酵液中GABA含量進(jìn)行測(cè)定，GABA標(biāo)準(zhǔn)品及菌株發(fā)酵液的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）以及發(fā)酵液（B）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of γ-aminobutyric acid standard(A)and fermentation broth(B)

從圖1可知，發(fā)酵液中GABA與其他雜質(zhì)通過(guò)該方法可有效分開(kāi)，GABA的保留時(shí)間為16.0 min左右。通過(guò)外標(biāo)法以峰面積定量可知，菌株HUCM 201在含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中37℃發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度可達(dá)95.3 μg/mL。

2.2 菌株HUCM 201產(chǎn)GABA條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量的影響

菌株HUCM 201按1%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，于不同時(shí)間點(diǎn)取發(fā)酵液，并經(jīng)處理后供HPLC檢測(cè)GABA含量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，GABA含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，菌株HUCM201發(fā)酵60 h后，發(fā)酵液中GABA累積量趨于平穩(wěn)，60h時(shí)GABA含量為134.8μg/mL，72h時(shí)為138.7μg/mL，二者差異不顯著。故最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on γ-aminobutyric acid production

2.2.2 初始pH值對(duì)GABA產(chǎn)量的影響

菌株HUCM 201按1%接種量接種于不同初始pH值的含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)60 h，發(fā)酵液經(jīng)處理后供HPLC檢測(cè)GABA含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 初始pH值對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial pH on γ-aminobutyric acid production

由圖3可知，GABA含量隨初始pH值的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在初始pH值為6.0時(shí)，發(fā)酵液中GABA累積量最大，達(dá)到149.4 μg/mL，故最佳初始pH值為6.0。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)GABA產(chǎn)量的影響

菌株HUCM 201按1%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基（pH 6.0）中，不同溫度下靜置培養(yǎng)60 h，發(fā)酵液經(jīng)處理后供HPLC檢測(cè)GABA含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on γ-aminobutyric acid production

由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，GABA含量首先隨之升高，培養(yǎng)溫度為31℃時(shí)，菌株HUCM 201發(fā)酵液中GABA累積量最大，GABA含量達(dá)到191.2 μg/mL，發(fā)酵溫度超過(guò)31℃后GABA產(chǎn)量出現(xiàn)明顯下降。故最佳發(fā)酵溫度為31℃。

2.2.4 接種量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響

圖5 接種量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum on γ-aminobutyric acid production

菌株HUCM 201按不同接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基（pH 6.0）中，31℃靜置培養(yǎng)60 h，發(fā)酵液經(jīng)處理后供HPLC檢測(cè)GABA含量，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，接種量為3%時(shí)，菌株HUCM 201發(fā)酵液中GABA累積量最大，GABA含量達(dá)到213.4μg/mL，接種量超過(guò)3%后GABA產(chǎn)量無(wú)明顯變化。故最佳接種量為3%。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素條件優(yōu)化結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間、初始pH值、發(fā)酵溫度、接種量4個(gè)因素，以GABA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化結(jié)果如表3所示。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表3結(jié)果可知，對(duì)GABA產(chǎn)量影響大小依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞初始pH值，最佳組合為A2B3C2D3，以此為最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，即菌株HUCM 201按4%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基（pH 6.5）中，31℃培養(yǎng)60 h，GABA的產(chǎn)量達(dá)到218.7 μg/mL。

2.4 硝基還原酶活性檢測(cè)結(jié)果

圖6 硝基還原酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Determination results of nitroreductase activity

菌株的硝基還原酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，接種大腸桿菌ATCC 25922的培養(yǎng)基顏色變成了紅色，為陽(yáng)性結(jié)果；而接種HUCM 201菌株的培養(yǎng)基顏色并未發(fā)生變化，其硝基還原酶活性試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，說(shuō)明菌株HUCM 201不能產(chǎn)生硝基還原酶，不會(huì)將環(huán)境中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽進(jìn)而產(chǎn)生有害代謝物。

2.5 生物胺產(chǎn)生能力檢測(cè)結(jié)果

生物胺產(chǎn)生能力的檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株HUCM201連續(xù)轉(zhuǎn)接于含0.005%的5′-磷酸吡哆醛和0.1%酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸其中一種氨基酸的MRS液體培養(yǎng)基10代后，分別劃線接種于酪胺、組胺、尸胺或腐胺檢測(cè)培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，4種培養(yǎng)基均呈現(xiàn)為黃色，說(shuō)明該菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中并未產(chǎn)生堿性物質(zhì)而使培養(yǎng)基呈現(xiàn)紫色或紅色，均為陰性結(jié)果。由此說(shuō)明，菌株HUCM201在生長(zhǎng)過(guò)程中并不會(huì)產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺或腐胺的有害代謝產(chǎn)物。

圖7 菌株HUCM 201產(chǎn)生物胺的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Determination results of biogenic amines production by strain HUCM 201

2.6 吲哚試驗(yàn)結(jié)果

供試菌株于37℃培養(yǎng)于蛋白胨水培養(yǎng)基中72h后，加入吲哚試劑檢測(cè)吲哚產(chǎn)生情況，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，加入吲哚試劑后，大腸桿菌ATCC25922發(fā)酵液的液面出現(xiàn)玫瑰紅色，呈陽(yáng)性結(jié)果；而菌株HUCM 201發(fā)酵液的液面顏色未發(fā)生變化，為陰性結(jié)果。由此說(shuō)明，菌株HUCM201在生長(zhǎng)過(guò)程中不會(huì)代謝產(chǎn)生色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。

圖8 吲哚試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Results of indole experiments

2.7 溶血試驗(yàn)結(jié)果

溶血試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，供試菌株于哥倫比亞血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)48 h后，金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌落周圍出現(xiàn)了透明圈，發(fā)生了β-溶血，而菌株HUCM 201菌落周圍無(wú)溶血環(huán)出現(xiàn)，為γ-溶血，即不溶血。由此說(shuō)明，菌株HUCM 201無(wú)溶血能力，不會(huì)引起人體出現(xiàn)溶血。

圖9 溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Results of haemolysis experiments

由上述硝基還原酶試驗(yàn)、生物胺產(chǎn)生能力檢測(cè)、吲哚試驗(yàn)以及溶血試驗(yàn)的結(jié)果可知，菌株HUCM 201為硝基還原酶陰性、吲哚試驗(yàn)陰性、無(wú)溶血、不能產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺以及腐胺生物胺類有害代謝物，可初步判定其為一株安全的益生菌。

3 結(jié)論

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能產(chǎn)生重要的活性物質(zhì)—γ-氨基丁酸，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了其產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件，菌株HUCM 201按4%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG培養(yǎng)基（pH 6.5）中31℃發(fā)酵60 h，其發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度可達(dá)218.7 μg/mL，并且該菌株不能代謝產(chǎn)生硝基還原酶，不能產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺或腐胺生物胺類有害代謝物，也不能利用色氨酸產(chǎn)生吲哚有害代謝物，不會(huì)引起人體血液發(fā)生溶血，可初步認(rèn)為是一株較為安全的益生菌，但菌株HUCM 201作為益生菌應(yīng)用前仍需做更為全面系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)。

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γ-aminobutyric acid-producing ability and safety evaluation ofLactococcus lactis

MENG Dan1,WANG Liqun2,XIE Guoliang1,LIU Xiaoyan1,YU Chunmiao1,GUO Lidong1*
(1.College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Food Processing Institute,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

The γ-aminobutyric acid-producing ability ofLactococcus lactissubsp.lactisHUCM 201 was discussed and the strain safety was preliminarily evaluated.Using γ-aminobutyric acid concentration as evaluation index,the optimal fermentation condition of strain HUCM 201 was evaluated by orthogonal experiments.The optimal fermentation condition was inoculum 4%,initial pH 6.5,fermentation temperature 31℃and time 60 h.The γ-aminobutyric acid concentration was determined as 218.7 μg/ml based on the optimal fermentation condition.Moreover,the safety ofL.lactissubsp. lactisHUCM 201 was evaluated via nitroreductase activity determination,biogenic amines production analysis,indole experiments and haemolysis experiments.The results suggested that the strain HUCM 201 was a nitroreductase-negative,indole-negative,haemolysis-negative bacterium,and could not produce biogenic amines,such as tyramine,histamine,cadaverine,and putrescine.Thus,L.lactissubsp.lactisHUCM 201 was preliminarily considered as safe probiotic bacterium.

lactic acid bacteria;γ-aminobutyric acid;biogenic amine;safety

TS201.3

0254-5071（2017）04-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.016

2016-07-04

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2016052）；黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12531631）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校科研基金項(xiàng)目（201104）

孟丹（1978-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生。

*通訊作者：國(guó)立東（1982-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称放c食品生物技術(shù)。