孫志高，黃巧娟，盛冉，郝靜梅

(西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 北碚，400712)

β-隱黃素納米乳的制備及其穩(wěn)定性研究

孫志高*，黃巧娟，盛冉，郝靜梅

(西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 北碚，400712)

以D-檸檬烯為油相，采用低能乳化法制備β-隱黃素納米乳。對(duì)比研究了溫度、光照對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液的影響，以及酸、堿、氧化劑和還原劑對(duì)β-隱黃素納米乳的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所制備的β-隱黃素納米乳平均粒徑為12.14 nm；β-隱黃素納米乳比β-隱黃素油溶液更耐熱、耐光；短時(shí)間強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境對(duì)β-隱黃素納米乳穩(wěn)定性影響較小，但長(zhǎng)時(shí)間的強(qiáng)酸條件會(huì)加速β-隱黃素的降解，而強(qiáng)堿條件會(huì)使β-隱黃素納米乳變渾濁；高濃度的氧化劑會(huì)使β-隱黃素納米乳有輕微降解，而還原劑對(duì)β-隱黃素納米乳具有一定的保護(hù)作用。因此，β-隱黃素納米乳比β-隱黃素油溶液具有更好的穩(wěn)定性，但仍需避免長(zhǎng)時(shí)間處于強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境。

β-隱黃素；納米乳；制備；穩(wěn)定性

β-隱黃素為類胡蘿卜素的一種，具有抗癌、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、降低關(guān)節(jié)炎、改善脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)化為VA等生理功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。在結(jié)構(gòu)上，β-隱黃素為聚異戊二烯復(fù)合物，含有多烯雙鍵及羥基等氧代基團(tuán)，對(duì)光、熱、氧及其他加工條件敏感，容易分解，難于穩(wěn)定存在于產(chǎn)品之中[2]。此外，β-隱黃素為脂溶性色素，不溶于水，極大地限制了β-隱黃素的應(yīng)用。如何提高β-隱黃素的生物利用度及其在各類產(chǎn)品中的穩(wěn)定性、增加其水溶性等是拓寬β-隱黃素應(yīng)用范圍亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

納米乳是指平均粒徑為10～100 nm的乳狀液，具有粒徑小、高透明度且動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等特點(diǎn)，常被應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[3]。納米乳能負(fù)載類胡蘿卜素類色素，如β-胡蘿卜素[4]、番茄紅素[5-6]、辣椒紅素[7]等，且所制備的類胡蘿卜素納米乳能有效地提高類胡蘿卜素的生物利用度及穩(wěn)定性[8-9]。然而，目前制備色素納米乳時(shí)多采用有機(jī)溶劑溶解色素，所制備的納米乳可能存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題。因此，若能找到有機(jī)溶劑替代劑，并將其運(yùn)用于納米乳的制備中，對(duì)色素納米乳的制備具有重要意義。D-檸檬烯是柑桔精油的主要成分，為一種單環(huán)單萜烯，具有抗癌、抗氧化等多種生理功能[10]。此外，D-檸檬烯具有較強(qiáng)的溶解能力，可以作為烷烴等有機(jī)溶劑的綠色替代劑，且具有安全性高、溶解效果好等優(yōu)點(diǎn)[11-14]。研究表明，D-檸檬烯還可以作為油相，運(yùn)用于納米乳的制備中，制備出粒徑小，且穩(wěn)定性好的納米乳[15]。本試驗(yàn)嘗試以D-檸檬烯替代烷烴類試劑作為油相，溶解β-隱黃素，采用低能乳化法制備出安全性高、穩(wěn)定性好的β-隱黃素納米乳，以拓寬β-隱黃素的使用范圍。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

β-隱黃素(純度>90%)、D-檸檬烯(純度>90%)、吐溫-80、吐溫-60、司班-20、司班-60、恒溫水浴鍋、雙束可見(jiàn)-紫外分光光計(jì)、冷凍離心機(jī)、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、雙氧水、激光粒度儀(馬爾文 Zetasizer Nano-ZS90)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表面活性劑的篩選

將吐溫-60、吐溫-80、司班-60和司班-20按照一定的比例配制成不同親水親油平衡(HLB)值的混合乳化劑，加入固定的油相(D-檸檬烯)，將乳化劑和油相按一定比例混合后，用恒溫磁力攪拌器使乳化劑和油相充分混合，并同時(shí)勻速滴加蒸餾水，觀察納米乳的形成情況。

1.2.2 β-隱黃素納米乳的制備

參考李婭男[16]和KOMAIKO[17]等的制備方法，并稍作改進(jìn)，制備空白納米乳。將一定量的乳化劑及D-檸檬烯在小燒杯中混合均勻，并用滴管緩慢逐滴滴加蒸餾水，且確保每滴蒸餾水被充分?jǐn)嚢韬头稚ⅲ麴s水滴加完成后，再將制備的乳狀液于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢柚敝良{米乳形成。

將一定量的β-隱黃素加入40 ℃水浴的D-檸檬烯中，攪拌均勻即得β-隱黃素油溶液。參照空白納米乳的制備方法及合適配方制備β-隱黃素納米乳。

1.2.3β-隱黃素納米乳最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

吸取一定量制備好的β-隱黃素納米乳(或空白納米乳)于1 cm比色皿中，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行波長(zhǎng)300～600 nm范圍掃描，經(jīng)圖譜比較確定β-隱黃素納米乳的最大吸收峰。

1.2.4 β-隱黃素納米乳粒度測(cè)定

利用馬爾文 Zetasizer Nano-ZS 90 激光粒度儀在 25℃下測(cè)量納米乳粒徑，設(shè)定平衡時(shí)間為 60 s、間隔時(shí)間為10 s、每次掃描 3 次，測(cè)平均值。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)[5,18-19]

(1)離心試驗(yàn)：取乳狀液10 mL于離心管中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，離心20 min，觀察是否有色素上浮，若色素上浮則表明該乳狀液并非是納米乳，其穩(wěn)定性較差。

(2)稀釋穩(wěn)定性試驗(yàn)：用蒸餾水與β-隱黃素納米乳按一定比例稀釋，觀察稀釋后的納米乳溶液是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象，若出現(xiàn)分層，則表明所制備的納米乳稀釋穩(wěn)定性較差。

(3)溫度的影響：制備同濃度的β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液各100 mL，立即測(cè)其吸光度。取7份10 mL的納米乳(或油溶液)分別置于50 mL錐形瓶中，將錐形瓶置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃的水浴鍋中，每隔一段時(shí)間，測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算β-隱黃素的殘存率，其計(jì)算公式如下：

(1)

(4)光照的影響：制備2份50 mL相同濃度的β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液，立即測(cè)其吸光度。取3份15 mL的納米乳(或油溶液)分別置于50 mL錐形瓶中，將錐形瓶分別置于暗室、日光燈室、紫外燈室，每隔一段時(shí)間測(cè)定樣品的吸光度，并計(jì)算β-隱黃素的殘存率。

(5)酸堿的影響：制備β-隱黃素納米乳，并將其分為5份，每份為9.5 mL，再向每份樣品中滴加質(zhì)量濃度分別為1.00%、2.00%、3.00%、4.00%和5.00%的HCl溶液0.5 mL，使得最終溶液中HCL質(zhì)量濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%；然后置于暗處，每隔2 h測(cè)定其吸光度。同時(shí)，用同樣方法研究NaOH對(duì)β-隱黃素納米乳的影響。

(6)氧化劑及還原劑的影響：選用H2O2作為氧化劑、Vc作為還原劑，將其配置成一定濃度，并加入到β-隱黃素納米乳中，使氧化劑及還原劑的最終濃度為0.10%、0.50%、1.00%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 表面活性劑的篩選

表1為不同表面活性劑制備空白納米乳的情況。制備D-檸檬烯納米乳較為理想的表面活性劑為吐溫60/吐溫80系列。在乳化的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)滴加一定量水相后會(huì)出現(xiàn)液晶相，若液晶相為無(wú)色透明狀則表明該乳化劑易于形成納米乳，反之若液晶相為白色(凝膠)則表明該乳化劑較難甚至不能形成納米乳，故納米乳的形成與該液晶相有較大的關(guān)聯(lián)度。因從初步篩選表面活性劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，用較多的吐溫80更有利于納米乳的形成，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用100%的吐溫80作為表面活性劑。

表1 表面活性劑的篩選

2.2 β-隱黃素納米乳的制備

圖1為利用馬爾文激光粒度儀對(duì)制備好的β-隱黃素納米乳進(jìn)行粒度測(cè)定的情況。從圖1中可以看出，β-隱黃素納米乳粒徑主要集中在10 nm左右，平均粒徑為12.14 nm，測(cè)定結(jié)果表明平均粒徑符合納米乳要求。此外，制備的β-隱黃素納米乳外觀為透明狀，黏度極低，符合納米乳的表觀特征。

圖1 β-隱黃素納米乳的平均粒徑Fig.1 Average particle size of β-cryptoxanthin nanoemulsion

2.3 β-隱黃素納米乳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 離心實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)制備的β-隱黃素納米乳經(jīng)離心后，未觀察到分層及絮凝現(xiàn)象，這表明所制備的β-隱黃素納米乳較為穩(wěn)定。

2.3.2 稀釋穩(wěn)定性

制備的β-隱黃素納米乳能以任意比例與水混溶，未觀察到油水分層現(xiàn)象，這證明所制備的β-隱黃素納米乳具有良好的稀釋穩(wěn)定性。

2.3.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

圖2為β-隱黃素納米乳及空白納米乳的紫外掃描吸收峰。由圖2可見(jiàn)，β-隱黃素納米乳的最大吸收峰均為451 nm，與β-隱黃素標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰相同，且在此波長(zhǎng)處空白納米乳無(wú)吸收，這表明β-隱黃素納米乳在此波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)無(wú)吸收干擾，故選擇451 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖2 納米乳光譜掃描曲線Fig.2 spectral scanning curves of nanoemulsion

2.3.4 溫度對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液的影響

圖3為β-隱黃素納米乳在不同溫度下的變化。

圖3 溫度對(duì)β-隱黃素納米乳的影響Fig.4 Effect of temperature on β-cryptoxanthinnanoemulsion

從圖3中可以看出，低溫對(duì)β-隱黃素納米乳的影響較小，在溫度低于70 ℃時(shí)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)β-隱黃素納米乳中的β-隱黃素幾乎不會(huì)降解；溫度為80 ℃時(shí)長(zhǎng)時(shí)間加熱β-隱黃素會(huì)有少量降解；當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí)，受熱時(shí)間越長(zhǎng)其β-隱黃素降解越快。溫度對(duì)β-隱黃素油溶液的影響很大，且出現(xiàn)溶液變渾濁的現(xiàn)象，這可能是高溫使得油相D-檸檬烯揮發(fā)、β-隱黃素發(fā)生降解造成的。如表2所示，在90 ℃加熱1 h后，β-隱黃素油溶液中β-隱黃素降解很明顯，在加熱2 h后，β-隱黃素幾乎完全降解。在80 ℃加熱3 h、70 ℃加熱4 h后，β-隱黃素油溶液中β-隱黃素也幾乎完全降解。此實(shí)驗(yàn)表明，β-隱黃素不耐高溫，在長(zhǎng)時(shí)間的高溫條件下容易降解；β-隱黃素納米乳的耐熱性強(qiáng)于β-隱黃素油溶液。

表2 溫度對(duì)β-隱黃素納米乳及油溶液的影響

2.3.5 光照對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液的影響

從圖4與圖5可以看出，日光燈照射對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液的影響很小，在放置65 h后β-隱黃素幾乎沒(méi)有降解；但紫外燈照射對(duì)β-隱黃素納米乳及其油溶液的影響較大，納米乳置于紫外光20 h后β-隱黃素開(kāi)始降解，在65 h后β-隱黃素殘存率約為58%。從圖5可以看出，紫外燈光對(duì)β-隱黃素油溶液的影響很大，在紫外燈下暴露6 h后，β-隱黃素油溶液中β-隱黃素開(kāi)始降解，降解速度非?？欤诒┞?0 h后β-隱黃素幾乎完全降解。由此可看出：日光燈對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液的影響較小，紫外燈光對(duì)兩者影響較大，但納米乳對(duì)β-隱黃素具有一定的保護(hù)作用。

圖4 光照對(duì)β-隱黃素納米乳的影響Fig.4 Effect of light on β-cryptoxanthine nanoemulsion

圖5 光照對(duì)β-隱黃素油溶液的影響Fig.5 Effect of light on β-cryptoxanthine oil solution

2.3.6 酸、堿對(duì)β-隱黃素納米乳的影響

從圖6可以看出，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿對(duì)β-隱黃素納米乳均具有一定的影響。隨著酸濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，β-隱黃素逐漸降解，但降解速度較為緩慢，時(shí)間少于4 h時(shí)影響非常小。隨著堿濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，β-隱黃素納米乳發(fā)生一定的變化；在時(shí)間少于4 h時(shí)強(qiáng)堿對(duì)β-隱黃素幾乎沒(méi)有影響，但時(shí)間超過(guò)4 h后，加入濃度為0.10%以上強(qiáng)堿的納米乳液開(kāi)始出現(xiàn)輕微渾濁，可能是生成某種物質(zhì)所致。因此，β-隱黃素納米乳可以增強(qiáng)抗強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的性能，但仍不宜長(zhǎng)時(shí)間放置在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中。

圖6 酸堿對(duì)β-隱黃素納米乳的影響Fig.6 Effect of acid and alkali onβ-cryptoxanthine nanoemulsion

2.3.7 氧化劑及還原劑對(duì)β-隱黃素納米乳的影響

圖7與圖8為氧化劑和還原劑對(duì)β-隱黃素納米乳的影響。從圖7可以看出，氧化劑雙氧水對(duì)β-隱黃素納米乳具有一定的影響，隨著雙氧水濃度的增加，β-隱黃素會(huì)進(jìn)行緩慢降解，即表明β-隱黃素納米乳具有較強(qiáng)的耐氧化性。從圖8可以看出，還原劑Vc對(duì)β-隱黃素納米乳的穩(wěn)定性影響很小，不同濃度的Vc對(duì)β-隱黃素納米乳影響幾乎無(wú)差異。與對(duì)照組相比，加入Vc的納米乳β-隱黃素降解較低，即Vc對(duì)β-隱黃素納米乳的穩(wěn)定性起到增效作用，能減緩β-隱黃素的氧化。SASAKI等曾利用Vc來(lái)增加β-隱黃素水溶液的穩(wěn)定性，并將其運(yùn)用于食品和飲料中[20]。

圖7 氧化劑對(duì)β-隱黃素納米乳的影響Fig.7 Effect of oxidanton β-cryptoxanthine nanoemulsion

圖8 還原劑對(duì)β-隱黃素納米乳的影響Fig.8 Effect of reducer on β-cryptoxanthine nanoemulsion

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用D-檸檬烯溶解β-隱黃素制備了平均粒徑為12.14 nm的β-隱黃素納米乳，并對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)β-隱黃素納米乳及β-隱黃素油溶液均有一定影響，與油溶液相比納米乳對(duì)溫度的耐受性更強(qiáng)，且不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，增強(qiáng)了β-隱黃素的穩(wěn)定性。日光燈光對(duì)β-隱黃素納米乳及油溶液的影響均較小，而紫外燈光對(duì)兩者的影響均較大，且在30 h后β-隱黃素油溶液中色素幾乎全部降解，而納米乳對(duì)β-隱黃素具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。β-隱黃素納米乳能耐受一定的強(qiáng)酸強(qiáng)堿，且具有較強(qiáng)的耐氧化性。此外，還原劑Vc對(duì)β-β-隱黃素納米乳具有一定的保護(hù)作用，可使其更加穩(wěn)定。

因此，β-隱黃素納米乳較β-隱黃素油溶液具有更好的穩(wěn)定性；β-隱黃素納米乳能以任意比例與水混溶，大大增強(qiáng)了β-隱黃素的水溶性。此外，為了增強(qiáng)β-隱黃素納米乳的穩(wěn)定性可在制備納米乳時(shí)同時(shí)添加少量Vc；為了保持β-隱黃素的生物活性，β-隱黃素納米乳應(yīng)盡量避免長(zhǎng)時(shí)間與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，并避免長(zhǎng)時(shí)間處于高溫及紫外燈照射環(huán)境。

[1] BURRI B J. Beta-cryptoxanthin as a source of vitamin A.[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2015,95(9)：1 786-1 794.

[2] 李濤, 張慧, 張志忠,等. β-隱黃質(zhì)的特性及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2011(4):156-158.

[3] 陳風(fēng)平, 劉晨光. 納米乳研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2013(12):43-48.

[4] 王大紅. β-胡蘿卜素乳劑的性狀和穩(wěn)定性的影響因素研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[5] 孫瑩. 番茄紅素納米分散體的制備及穩(wěn)定性研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué),2008.

[6] KIM S O, HA T V A,CHOI Y J, et al. Optimization of homogenization-evaporation process for lycopene nanoemulsion production and its beverage applications[J]. Journal of Food Science, 2014, 79(8): 1 604-1 610.

[7] 胡江良. 辣椒紅色素提取脫辣及乳化研究[D].昆明:昆明理工大學(xué),2008.

[8] SALVIA-TRUJILLO L,MCCLEMENTS D J. Improvement of β-carotene bioaccessibility from dietary supplements using excipient nanoemulsions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016,64(22):4 639-4 647.

[9] HO N H,INBARAJ B S, CHEN B H. Utilization of microemulsions from rhinacanthus nasutus (L.) Kurz to improve carotenoid bioavailability[J]. Scientific Reports, 2016, 6:25426.

[10] 黃巧娟,孫志高,龍勇,等.D-檸檬烯抗癌機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2015,36(7):240-244.

[11] FAURE K, BOUJU E, SUCHET P, et al. Use of limonene in countercurrent chromatography: a greenalkane substitute[J].Analytical Chemistry, 2013, 85(9): 4 644-4 650.

[12] CHWMAT S, TOMAO V, CHEMAT F. Limonene as Green Solvent for Extraction of Natural Products[M]//Green Solvents I. Springer Netherlands, 2012: 175-186.

[13] DEJOYE TANZI C, ABERT VIAN M, CHEMAT F. New procedure for extraction of algal lipids from wet biomass: A green clean and scalable process[J].Bioresource Technology, 2013, 134: 271-275.

[14] 黃巧娟, 黃林華, 孫志高,等. 檸檬烯的安全性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2015, 36 (15) : 277-281.

[15] OSTERTAG F, WEISS J, MCCLEMENTS D J. Low-energy formation of edible nanoemulsions: Factors influencing droplet size produced by emulsion phase inversion[J]. Journal of Colloid & Interface Science, 2012, 388(1):95-102.

[16] 李婭男.D-檸檬烯納米乳的制備與應(yīng)用研究[D]. 北京：北京化工大學(xué), 2013.

[17] KOMAIKO J, MCCLEMENTS D J. Optimization of isothermal low-energy nanoemulsion formation: hydrocarbon oil, non-ionic surfactant, and water systems.[J]. Journal of Colloid & Interface Science, 2014, 425(7):59-66.

[18] 安紅麗. 原花青素納米乳的研制[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2007.

[19] 蔣國(guó)玲. 溫州蜜柑皮β-隱黃素的提取、純化及穩(wěn)定性研究[D]. 重慶：西南大學(xué), 2012.

[20] SASAKI T,TAKAYAMA K. Stabilized beta cryptoxanthin-containing water and the use thereof: US, US20120156333 A1[P]. 2012.

Preparation and stability of β-cryptoxanthin nanoemulsion

SUN Zhi-gao*，HUANG Qiao-juan，SHENG Ran，HAO Jing-mei

(Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China)

Nanoemulsion of β-cryptoxanthin was prepared byD-limonene as oil phase. The effect of temperature and light on β-cryptoxanthin nanoemulsion and β-cryptoxanthin oil solution were compared. The effect of acid, alkali, oxidant, reducer to β-cryptoxanthin nanoemulsion was also studied. The results are: average particle size of β-cryptoxanthin nanoemulsion 12.14nm; β-cryptoxanthin nanoemulsion has better resistance of heat and light; acid and alkali has a little effect of β-cryptoxanthin nanoemulsion in short time; however strong acid accelerated β-cryptoxanthin degradation and strong alkali made β-cryptoxanthin nanoemulsion solution cloudy at long time. High concentration oxidant can cause slightly degradation while reducing agent has certain protection to β-cryptoxanthin nanoemulsion. So, β-cryptoxanthin nanoemulsion has better stability, and needs to avoid in strong acid and alkali.

β-cryptoxanthin； nanoemulsion； preparation； stability

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703031

副研究員(本文通訊作者，E-mail:cpro@cric.cn)。

重慶市科技支撐示范工程項(xiàng)目(cstc2014fazktjcsf80034)

2016-06-28，改回日期：2016-08-19