王俊文，張鳳花，付 強(qiáng)，楊丹鶴，叢麗莉

（1．大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116001；2．連云港市婦幼保健院，江蘇 連云港 222000）

重度痛經(jīng)的彌漫性子宮腺肌病子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)神經(jīng)病理改變初步探討

王俊文，張鳳花，付 強(qiáng)，楊丹鶴，叢麗莉

（1．大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116001；2．連云港市婦幼保健院，江蘇 連云港 222000）

目的探討子宮腺肌病的子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（EMI）蠕動(dòng)異常是否導(dǎo)致神經(jīng)損傷或異常增殖。方法選擇2013年10月至2015年10月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦科病房行全子宮切除術(shù)患者50例。其中彌漫性子宮腺肌病子宮標(biāo)本25例為觀察組，同期行子宮切除的CINⅢ及子宮肌瘤標(biāo)本25例為對(duì)照組。分別于標(biāo)本宮底及宮體EMI取材，石蠟切片HE染色確診后免疫組化檢測(cè)宮底及宮體EMI中NGF表達(dá)，了解神經(jīng)損傷情況。免疫熒光檢測(cè)宮底及宮體EMI中PGP 9.5表達(dá)，了解神經(jīng)密度改變。并分析子宮腺肌病患者宮底及宮體EMI中NGF的表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5密度的相關(guān)性。結(jié)果（1）觀察組宮底EMI中NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度（7.11±1.08），（16.36±1.76）條/mm2，高于宮體（4.80±0.74），（11.04±2.18）條/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）對(duì)照組宮底EMI中NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度1.67，（11.04±2.18）條/mm2與宮體部1.33，（6.87±1.42）條/m2比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（3）觀察組宮底及宮體NGF的表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度均高于對(duì)照組相應(yīng)部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（4）觀察組宮底及宮體EMI處NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度呈正相關(guān)（分別為r=0.760，P＜0.05；r=0.763，P＜0.05）。結(jié)論EMI神經(jīng)異?？赡軈⑴c子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展，采用手術(shù)或藥物減少EMI可能治療子宮腺肌病。

子宮腺肌?。粌?nèi)膜-肌層交界區(qū)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；神經(jīng)纖維植入

子宮腺肌?。╝denomyosis，AM）[1]是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入子宮內(nèi)膜下肌層3 mm以上，異位內(nèi)膜引起局部出血，繼發(fā)局部組織增生，形成彌漫性或局灶性病變?；颊哂捎诮?jīng)量增多、繼發(fā)性痛經(jīng)、不孕等癥狀嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。由于生育年齡延遲，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。因發(fā)病機(jī)制尚不清楚，診治均較困難。Leyendecker 等人[2]于2009年提出創(chuàng)傷修復(fù)（tissue injury and repair，TIAR）理論，認(rèn)為宮底部EMI蠕動(dòng)異常是導(dǎo)致子宮腺肌病的原因。有研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病病灶及內(nèi)膜存在神經(jīng)異常，但對(duì)EMI神經(jīng)仍無(wú)相關(guān)系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)分別采用免疫組化和免疫熒光的方法測(cè)定子宮腺肌病組和對(duì)照組子宮EMI的NGF和PGP9.5表達(dá)強(qiáng)度，探討其神經(jīng)損傷與分布特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年10月至2015年10月，在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦科病房行全子宮切除術(shù)的患者50例。其中彌漫性子宮腺肌病子宮標(biāo)本（25例）為觀察組，同期行子宮切除的CINⅢ及子宮肌瘤標(biāo)本（25例）為對(duì)照組。觀察組VAS評(píng)分≥7分，對(duì)照組VAS評(píng)分＜3分。所有病例術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)確診。兩組患者均處于月經(jīng)周期的增殖期，年齡為29～45歲，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未服用過(guò)性激素類藥物，亦無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌或免疫系統(tǒng)疾病史，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。

1.2 方法

兩組均在宮底及宮體EMI區(qū)域內(nèi)取材。切除新鮮子宮標(biāo)本，于宮頸前壁向?qū)m底至雙側(cè)宮角Y型切開(kāi)，取雙側(cè)宮角連線的中點(diǎn)處，長(zhǎng)、寬各1 cm，深度達(dá)肌層1 cm組織標(biāo)本。另于宮底至雙側(cè)宮角連線的中點(diǎn)處至宮頸口連線1/2處，取同樣大小組織標(biāo)本。標(biāo)本立即置4%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片。

1.2.1 NGF測(cè)定：采用免疫組織化學(xué)SP法。切片脫蠟、水化后后經(jīng)0.3 %過(guò)氧化氫溶液滅活組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原，依次滴加10%羊血清、兔抗人NGFⅠ抗（1:200 稀釋，武漢博士德）、生物素化羊抗兔Ⅱ抗和SP復(fù)合物（SP試劑盒，北京中杉），經(jīng)二氨基聯(lián)苯氨（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片備檢。

光學(xué)顯微鏡下觀察。由2人采用雙盲法閱片，NGF表達(dá)強(qiáng)度采用Remmele和Stegner提出的免疫反應(yīng)積分（Immunity Response Score，IRS）法表示，即IRS＝染色強(qiáng)度（Stain Intensity，SI）×陽(yáng)性細(xì)胞百分比（PP）。SI共分為4個(gè)等級(jí)，0級(jí)與背景顏色一致，視為陰性；1級(jí)呈淡黃色，為弱陽(yáng)性；2級(jí)呈棕黃色，為中等陽(yáng)性；3級(jí)呈棕褐色，為強(qiáng)陽(yáng)性。PP共分為5個(gè)等級(jí)，0級(jí)為陰性即無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%，2級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占11%～50%，3級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占51%～80%，4級(jí)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞80%。當(dāng)IRS＞3表示免疫反應(yīng)陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)不同視野，以IRS的平均值作為NGF的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2 PGP9.5測(cè)定：采用FITC-間接免疫熒光法。除滴加的Ⅰ抗為抗人神經(jīng)細(xì)胞胞漿蛋白9.5（PGG9.5）抗體（1:400稀釋，北京博奧森）、Ⅱ抗為FITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（1:500稀釋，北京博奧森）外，余步驟同1.2.1免疫組化SP法。

共聚焦顯微鏡下觀察。每張切片在低倍鏡下選取PGP9.5陽(yáng)性高表達(dá)區(qū)后轉(zhuǎn)換成高倍鏡，計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野作為有效單位面積觀察，觀察記錄神經(jīng)總數(shù)，取平均值作為該切片神經(jīng)密度。用單位面積（mm2）內(nèi)的神經(jīng)條數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡下NGF在EMI中的陽(yáng)性表達(dá)情況

觀察組及對(duì)照組均可見(jiàn)NGF表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞位于EMI內(nèi)膜層的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)與EMI肌層的腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)中。

NGF陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度：觀察組NGF在宮底EMI中的表達(dá)強(qiáng)度（7.11±1.08）高于宮體部（4.80±0.74），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組NGF在宮底EMI的表達(dá)（1.67）與宮體部（1.33）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組宮底及宮體EMI中NGF的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、2、3。

表1 NGF在觀察組EMI的表達(dá)情況（±s）

表1 NGF在觀察組EMI的表達(dá)情況（±s）

注：觀察組宮底與宮體比較，*P＜0.05

部位例數(shù)NGF表達(dá)強(qiáng)度（IRS）宮底EMI257.11±1.08*宮體EMI254.80±0.74

表2 NGF在對(duì)照組EMI中的表達(dá)（IRS，M）

表3 NGF在EMI中的表達(dá)（IRS，M）

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光染色子宮腺肌病不同部位EMI神經(jīng)密度

50例患者中術(shù)后病理標(biāo)本檢出為子宮腺肌病及子宮肌瘤、CINⅢ患者均各25例。PGP9.5免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)纖維在觀察組及對(duì)照組EMI均有表達(dá)。見(jiàn)表4。

表4 檢出PGP9.5（+）神經(jīng)纖維條數(shù)及密度的比較（±s）

表4 檢出PGP9.5（+）神經(jīng)纖維條數(shù)及密度的比較（±s）

組別例數(shù)部位條數(shù)密度（條/mm2）觀察組25宮底EMI40916.36±1.76*△宮體EMI27611.04±2.18▲對(duì)照組25宮底EMI1827.29±1.61#宮體EMI1716.87±1.42

2.3 子宮腺肌病患者E M I中N G F表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5（+）陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度關(guān)性分析

子宮腺肌病患者宮底EMI處NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度正相關(guān)（r=0.760，P＜0.05），兩者變化關(guān)系如圖1。

圖1 觀察組宮底EMI處NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度相關(guān)性散點(diǎn)圖

子宮腺肌病患者宮體EMI處NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度正相關(guān)（r＝0.763，P＜0.05），兩者變化關(guān)系如圖2所示。

圖2 觀察組宮體EMI處NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討 論

子宮腺肌病可引起月經(jīng)量過(guò)多、痛經(jīng)、不孕等癥狀，是婦科常見(jiàn)病之一。嚴(yán)重影響婦女的生活質(zhì)量?？赡茉斐勺訉m損傷的情況如剖宮產(chǎn)、人工流產(chǎn)等可能是該病的誘因，但本研究觀察組與對(duì)照組生育史與子宮手術(shù)史無(wú)顯著性差異。因此，與部分文獻(xiàn)報(bào)道該病發(fā)病與子宮手術(shù)無(wú)相關(guān)性一致。

子宮內(nèi)膜和子宮肌層的交界區(qū)域，即為E M I （endometrial-myometrial interface）。NGF屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，對(duì)受損神經(jīng)元有促再生和保護(hù)作用，在神經(jīng)受損時(shí)表達(dá)異常增多。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，子宮NGF蛋白表達(dá)強(qiáng)度與腺肌病病程進(jìn)展相關(guān)，因此NGF可能參與了子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制。本研究中觀察組無(wú)論宮底和宮體NGF表達(dá)水平與對(duì)照組比較均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道相同即子宮腺肌病存在神經(jīng)損傷。本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明子宮腺肌病宮底部EMI神經(jīng)損傷最為嚴(yán)重，而宮體相對(duì)較輕。說(shuō)明子宮腺肌病的神經(jīng)損傷與宮底EMI蠕動(dòng)異常相關(guān)，其神經(jīng)病理改變同樣以宮底為中心向?qū)m頸方向蔓延。

蛋白基因產(chǎn)物9.5（Protein gene product 9.5，PGP 9.5）是一種存在于神經(jīng)纖維中的特異性神經(jīng)水解酶，可作為神經(jīng)軸突的標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組EMI中PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度明顯高于對(duì)照組，結(jié)果與以往對(duì)子宮腺肌病病灶及異位內(nèi)膜的研究報(bào)道相同。但本研究發(fā)現(xiàn)在觀察組宮底部PGP 9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度明顯高于宮體部，再次證明子宮腺肌病發(fā)病來(lái)源于宮底EMI“蠕動(dòng)泵”的假設(shè)。本研究結(jié)果表明，子宮腺肌病EMI的高神經(jīng)增殖狀態(tài)與該部位病變程度相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組NGF強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維植入密度正相關(guān)，進(jìn)一步證明子宮腺肌病宮底EMI神經(jīng)纖維密度增高可能與NGF分泌增加有相關(guān)性。文獻(xiàn)報(bào)道PGP 9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度與痛經(jīng)的程度相關(guān)[3]。在本研究中發(fā)現(xiàn)宮底EMI中NGF與PGP 9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維同樣存在高表達(dá)。

本文通過(guò)觀察子宮腺肌病子宮不同部位EMI的神經(jīng)密度改變，證實(shí)子宮腺肌病EMI異常蠕動(dòng)導(dǎo)致神經(jīng)異常植入并促進(jìn)了子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展。在臨床上，我們根據(jù)TIAR假說(shuō)設(shè)計(jì)了子宮腺肌病組織減滅術(shù)這一術(shù)式，在保留子宮的前提下，在明顯地緩解痛經(jīng)、減少經(jīng)量方面取得良好療效[4]。

[1]Struble J, Reid S, Bedaiwy MA. Adenomyosis: A Clinical Review of a Challenging Gynecologic Condition. J Minim Invasive Gynecol (Journal of Minimally Invasive Gynecology),2016,23(2):164-185.

[2]Leyendecker G, Wildt L, Mall G. The pathophysiology of endometriosis and adenomyosis:tissue injury and repair [J]. Arch Gynecol Obstet,2009,280(4):529-538.

[3]王文莉,段 華,張 穎,等.子宮腺肌病PGP9.5、NGF的表達(dá)及其與痛經(jīng)的關(guān)系[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,33(1):11-15.

[4]徐瀟萌,付強(qiáng).子宮腺肌病組織減滅術(shù)治療彌漫性,子宮腺肌病的臨床分析.中國(guó)醫(yī)藥指南[J].2015.13(4):141-142.

本文編輯：劉帥帥

Severe dysmenorrhea diffuse pathological adenomyosis endometrial myometrial junction to investigate neural changes

WANG Jun-wen1, ZHANG Feng-hua2, FU Qiang1, YANG Dan-he1, CONG Li-li1
(1.Department of Obstetrics and Gynecology; Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University,Liaoning Dalian 116001;2.Lianyungang Maternal and Child Health-Care Center,Jiangsu Lianyungang 222000,China)

ObjectiveTo investigate whether the abnormal activity of the uterine myometrial junction (EMI) in adenomyosis leads to nerve damage or abnormal proliferation.MethodsFrom October 2013 to October 2015 in Zhongshan Hospital Affiliated to the gynecological ward for 50 patients with resection of the uterus in Dalian University. The diffuse adenomyosis of uterus specimens of 25 cases of the observation group, underwent hysterectomy CIN III and hysteromyoma specimens of 25 cases as control group. Specimens were respectively obtained from the fundus and uterine EMI, paraffin HE staining confirmed after immunohistochemical detection of uterine fundus and uterine EMI NGF expression, to understand the situation of nerve injury. Immunofluorescence and uterine fundus EMI PGP 9.5 expression, understand the nerve density change. And analysis of patients with adenomyosisThe correlation between the expression intensity and PGP9.5 density of fundus and uterine body in EMI NGF.Results(1)Observation group EMI in the palace at the end of the expression of NGF and PGP9.5 positive nerve fiber density (7.11+1.08), (16.36+1.76) /mm2, higher than the palace body (4.80+0.74), (11.04+2.18) /mm2, the difference was statistically significant (P＜0.05). (2) the control group Palace at the end of the EMI NGF expression and PGP9.5 positive nerve fiber density of 1.67 (11.04+2.18) /mm2and the palace body 1.33, (6.87+1.42) /m2comparison, the difference was not statistically significant (P＞0.05). (3) the expression intensity and density of PGP9.5 positive nerve fibers in the observation group and the uterine fundus NGF were higher than the corresponding control group site, the difference was statistically significant (P＜0.05). The observation group (4) and uterine EMI fundus NGF expression intensity and PGP9.5 positive nerve positive fiber density (r=0.760,P＜0.05; r=0.763,P＜0.05).Conclusion EMI neural abnormalities may be involved in the occurrence and development of uterine adenomyosis, using surgery or drug EMI may reduce the treatment of uterine adenomyosis.

Adenomyosis;Endometrial junction;Nerve growth factor;Nerve fiber implantation

R711.74

B

ISSN.2095-8803.2017.01.126.02