姜振富，李 梅，韋 鴻

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 科研中心，遼寧 大連 116027；3.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116011)

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論 著

腦膠質(zhì)瘤EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表達及臨床意義

姜振富1，李 梅2，韋 鴻3

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 科研中心，遼寧 大連 116027；3.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116011)

目的 研究膠質(zhì)瘤表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、原癌基因KRAS蛋白以及與細胞增殖有關的核抗原Ki67蛋白的表達情況，為膠質(zhì)瘤的靶向TKI治療提供依據(jù)。方法 選取大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科2001-2010年間手術切除的膠質(zhì)瘤標本81例，按照患者臨床病理特點及腫瘤WHO(World Health Organization)分級予以分組，用免疫組織化學方法檢測組織的EGFR、KRAS和Ki67在膠質(zhì)瘤中的表達情況，通過統(tǒng)計學分析這些蛋白表達與臨床病理參數(shù)之間的關系及這些蛋白表達之間的相關性。結(jié)果 EGFR蛋白表達陽性率在年齡≤42歲與>42歲患者組分別為57.5%與80.5%，兩者差異顯著(P<0.05)；在低級別與高級別患者組分別為56.3%與77.6%，兩者差異顯著(P<0.05)。KRAS蛋白表達陽性率與患者性別，年齡及腫瘤分級無明顯關系(P>0.05)。Ki67蛋白表達陽性率在低級別與高級別患者組間表達的差異具有顯著性意義(P=0.001)。膠質(zhì)瘤EGFR蛋白表達與KRAS及Ki67蛋白表達亦無顯著相關關系(P>0.05)。膠質(zhì)瘤Ki67蛋白表達與KRAS蛋白表達亦無顯著相關關系(P>0.05)。結(jié)論 膠質(zhì)瘤EGFR、KRAS蛋白的表達為相互獨立的分子事件的發(fā)現(xiàn)提示膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的多樣性；EGFR， Ki67蛋白的表達可用于輔助判定腫瘤的病理級別。

膠質(zhì)瘤；EGFR；KRAS；Ki67

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，呈侵襲性生長，術后復發(fā)率高，且對放療化療不敏感。因此有效控制其生長及復發(fā)是該腫瘤治療成功的關鍵。近年來，人們發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號轉(zhuǎn)導通路異常激活可能是一部分膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因。目前，針對EGFR為作用靶點的分子靶向藥表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)在治療EGFR表達異常的非小細胞肺癌中取得了很大的成功[1-2]，那么EGFR-TKI是否也可以用于治療EGFR表達異常的膠質(zhì)瘤值得探討。KRAS為EGFR轉(zhuǎn)導通路中的下游信號蛋白，它異常表達?？沙霈F(xiàn)于多種惡性腫瘤當中，同時也是腫瘤細胞產(chǎn)生TKI類藥物耐藥性的分子基礎。Ki67抗原是存在于增殖細胞核的一種非組蛋白性核內(nèi)蛋白。病理學上常用它的表達狀況來反映腫瘤細胞的增殖狀況。前期工作中我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤WHO分級越高，Ki67蛋白陽性表達率越高。并且Ki67蛋白表達與KRAS蛋白表達存在著正相關發(fā)展的趨勢，這提示EGFR信號轉(zhuǎn)導通路在膠質(zhì)瘤腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用[3]。本研究檢測膠質(zhì)瘤EGFR蛋白表達狀況，并將其與膠質(zhì)瘤KRAS和Ki67蛋白的表達情況相結(jié)合，分析這些蛋白表達與臨床病理參數(shù)之間的關系及這些蛋白表達之間的相關關系，以進一步了解膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機制，為膠質(zhì)瘤的靶向TKI治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科2001-2010年間手術切除的膠質(zhì)瘤標本81例，其中男性39例，女性42例；年齡3～75歲，其中年齡≤42歲者40例，>42歲者41例；WHO分級：Ⅰ級5例，Ⅱ級27例，Ⅲ級26例，Ⅳ級23例，將WHOⅠ～Ⅱ級定義為低級別組，WHOⅢ～Ⅳ級定義為高級別組，即低級別組32例，高級別組49例。依照上述患者臨床病理特征及腫瘤WHO分級進行分組，通過免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表達情況。

1.2 實驗方法

通過免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表達情況。EGFR、KRAS及Ki67蛋白。免疫組織化學SP法，操作步驟按照試劑盒說明進行，微波修復、DAB顯色、沖洗、蘇木復染、封片。取已知肺的陽性組織作陽性對照，以PBS替代一抗作陰性對照。

1.3 判斷標準

EGFR、KRAS判斷標準：在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野。陽性細胞百分比≤25%記為1分、25%～50%記為2分、51%～75%記為3分、>75%記為4分；細胞漿無色記為0分、淡黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分；最后二者相乘，乘積≤3分為陰性，>3分為陽性。

Ki67判斷標準：在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野。陽性細胞百分比≤20%記為陰性，>20%記為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行Chi-square檢驗和Spearman相關分析，結(jié)果均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表達

EGFR蛋白表達陽性率為69.1%，其中男性與女性組分別為74.4%和64.3%，兩者無顯著性差異(P=0.327)；在年齡≤42歲與>42歲組分別為57.5%與80.5%，兩者差異顯著(P=0.025)；在低級別與高級別患者組分別為56.3%與77.6%，兩者差異顯著(P=0.042)。見表1、圖1。

KRAS蛋白表達陽性率為53.1%，其與患者的性別、年齡及腫瘤WHO分級無明顯關系(P>0.05)。見表1、圖2。

Ki67蛋白表達陽性率為54.3%，其在低級別與高級別組間表達的差異具有顯著性意義(P=0.001)。而與患者性別，年齡無明顯關系(P>0.05)。見表1、圖3。

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的EGFR、KRAS和Ki67蛋白表達之間的相關性

經(jīng)相關性檢驗，膠質(zhì)瘤EGFR蛋白表達與KRAS蛋白表達無顯著相關關系(r=0.282，P=0.106)；EGFR蛋白表達與Ki67蛋白表達無顯著相關關系(r=0.192，P=0.110)。見表2。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的Ki67蛋白表達與KRAS蛋白表達無顯著相關關系(r=0.082，P=0.111)。見表3。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表達情況及與臨床病理參數(shù)的關系

A：膠質(zhì)瘤EGFR蛋白陰性表達(SP ×200)；B：膠質(zhì)瘤EGFR蛋白陽性表達(SP ×200)；C：膠質(zhì)瘤EGFR蛋白陽性表達(SP ×400)圖1 膠質(zhì)瘤EGFR蛋白表達情況Fig 1 Expression of EGFR protein in gliomas

A：膠質(zhì)瘤KRAS蛋白陰性表達(SP ×200)；B：膠質(zhì)瘤KRAS蛋白陽性表達(SP ×200)；C：膠質(zhì)瘤KRAS蛋白陽性表達(SP ×400)圖2 膠質(zhì)瘤KRAS蛋白表達情況Fig 2 Expression of KRAS protein in gliomas

A：膠質(zhì)瘤Ki67蛋白陰性表達(SP ×200)；B：膠質(zhì)瘤Ki67蛋白陽性表達(SP ×200)；C：膠質(zhì)瘤Ki67蛋白陽性表達(SP ×400)圖3 膠質(zhì)瘤Ki67蛋白表達情況Fig 3 Expression of Ki67 protein in gliomas

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的EGFR蛋白表達與KRAS、Ki67蛋白表達的相關性Tab 2 Correlations between the expressions of KRAS, Ki67 protein and that of EGFR protein in gliomas

表3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的Ki67蛋白表達與KRAS蛋白表達的相關性Tab 3 Correlations between the expressions of KRAS protein and that of Ki67 protein in gliomas

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，呈侵襲性生長，術后易復發(fā)，尤其是惡性膠質(zhì)瘤，一般從確診到死亡，平均生存期為1年。對于膠質(zhì)瘤的治療臨床上首選手術切除，然而手術無法將一些生長在腦干或重要功能區(qū)的惡性腫瘤細胞全部清除，需輔以術后放化療。由于放化療會使組織細胞水腫，細胞體積增大，而顱內(nèi)空間相對固定，容易形成腦疝，加速患者死亡。另外，由于神經(jīng)系統(tǒng)中血腦屏障/血腫瘤屏障的存在，化療藥物很難達到腫瘤細胞所在的部位，因而化療的效果不佳。針對每個患者的腫瘤特點，制定出特定的治療方案，即腫瘤的個體化治療，近年來逐漸被采用，已經(jīng)成為腫瘤治療的趨勢。隨著現(xiàn)代分子生物學和病理學的發(fā)展，對腫瘤發(fā)生的分子機制有了進一步的了解，因而提出了分子靶向治療，即針對已經(jīng)明確的致癌位點設計相應的治療藥物，其代表藥物為EGFR-TKI,該藥的作用機制為通過競爭性結(jié)合細胞表面表皮生長因子受體酪氨酸激酶催化域的結(jié)合位點，阻斷EGFR活化，這樣就阻斷了其下游一系列轉(zhuǎn)導通路的傳導，從而抑制腫瘤細胞的增殖，起到抗腫瘤的作用[4]。

EGFR是原癌基因c-erB-1(HER-1)的表達產(chǎn)物，編碼基因位于7號染色體短臂(7p11-13)，分子量約為170 kDa，屬于表皮生長因子家族(erbB家族)中的一員，其在調(diào)控細胞生長、分化及增殖活性等方面起重要作用[5-6]。多位學者研究證明原發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤存在EGFR擴增(<40%)和EGFR過表達(>60%)[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤EGFR蛋白陽性表達率是69.1%，與文獻報道的基本一致。這提示，EGFR異?；罨c膠質(zhì)瘤的發(fā)病關系密切，可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子途徑之一，那么EGFR-TKI類藥物可能為治療膠質(zhì)瘤提供幫助。本研究還發(fā)現(xiàn)，在年齡>42歲的患者組EGFR表達顯著高于年齡≤42歲的患者組，由于蛋白表達主要是由基因調(diào)控的，而文獻報道在年齡<35歲的膠質(zhì)瘤患者組織中沒有發(fā)現(xiàn)EGFR的基因擴增，因此這可能是低年齡組EGFR蛋白表達較低的原因。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在低級別患者組EGFR蛋白表達顯著低于高級別患者組，與大多數(shù)文獻報道一致。這一現(xiàn)象提示了EGFR可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性增殖的生物學特性關系密切，為膠質(zhì)瘤的病理分級提供了新的依據(jù)，同時也為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供了新的敏感指標。

KRAS基因編碼了包含188個氨基酸殘基，分子量為21.6 kDa的鳥苷酸結(jié)合蛋白，是鳥苷酸結(jié)合蛋白超家族成員之一，可以作為分子開關，調(diào)控EGFR-KRAS信號通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡[10-11]。許多腫瘤的發(fā)生都與KRAS異?；罨嘘P。文獻報道，一些攜帶EGFR基因和蛋白異常表達的患者對EGFR-TKI類藥物產(chǎn)生耐藥，我們分析認為這是由于EGFR信號轉(zhuǎn)導通路下游信號分子的基因或蛋白異常而引起的。KRAS作為其下游信號分子之一，其功能異常經(jīng)常與腫瘤的TKI耐藥有關。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤KRAS蛋白陽性表達率為53.1%，并且膠質(zhì)瘤EGFR和KRAS蛋白表達是相互獨立發(fā)生的分子事件，這提示KRAS蛋白的異?；罨⒉灰欢ㄊ怯蒃GFR的持續(xù)激活而引起的。一般認為蛋白表達是由基因調(diào)控的，有報道在膠質(zhì)瘤中KRAS基因突變僅是偶然發(fā)生，突變率很低[12-13]，我們推斷在膠質(zhì)瘤中KRAS蛋白的高表達也并不一定是由KRAS基因突變引起的，也可以是由基因擴增等其他原因所導致自發(fā)激活。因此，在對膠質(zhì)瘤進行靶向TKI治療之前，必須檢測其下游的分子變化情況，以篩選出對TKI類藥物治療的受益人群。

Ki67抗原是由兩條多肽鏈組成的存在于增殖細胞核的一種非組蛋白性核內(nèi)蛋白，它的表達能用來有效的反映惡性腫瘤細胞的增殖效率，與惡性腫瘤的演進和預后密切相關[14-15]。我們前期工作發(fā)現(xiàn)Ki67蛋白表達與腫瘤的惡性程度密切相關，即隨著Ki67蛋白的表達陽性率的增高，膠質(zhì)瘤的WHO分級也會增高。同時，我們也發(fā)現(xiàn)Ki67蛋白表達狀況與EGFR和KRAS蛋白表達狀況均存在著正相關趨勢。因此我們認為EGFR-KRAS信號轉(zhuǎn)導通路的活化能夠促進膠質(zhì)瘤腫瘤細胞的生長、分化，與腫瘤惡性增殖密切相關，這為EGFR-TKI藥物應用于膠質(zhì)瘤的治療提供了分子依據(jù)。

[1] Schiller JH, Harrington D, Belani CP, et al. Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med，2002, 346(2): 92-98.

[2] Fang S, Wang ZH. EGFR mutations as a prognostic and predictive marker in non-small-cell lung cancerr[J]. Drug Des Devel Ther，2014, 8: 1595-1611.

[3] Jiang ZF, Li M, Wei H, et al. Clinical significance of Ki-67, KRAS and Braf protein expressions in gliomas[J]. Modern Oncol， 2013，21(3): 507-510.

[4] 陳允碩. 腫瘤標志物的臨床應用價值[J]. 中華醫(yī)學檢驗雜志， 2000, 23(1): 52-55.

[5] Robert MJ, David RS. Advances in molecular-based personalized non-small-cell lung cancer therapy: targeting epidermal growth factor receptor and mechanisms of resistance[J]. Orig Res，2015, 4(11):1621-1632.

[6] Riely GJ, Yu HA. The Paradigm of an Oncogene-Driven Lung Cancer[J].Clin Cancer Res， 2015, 21(10):2221-2226.

[7] Ohgaki H, Dessen P, Jourde B, et al. Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study[J]. Cancer Res， 2004, 64(19):6892-6899.

[8] Dong L, Pu PY, Wang H, et al. The Relationships of the amplification and gene expression of EGFR with tumor proliferating activity[J]. Chin J Neuromed，2005, 4(12):1204-1207.

[9] Lin RT, Gao HZ, Lin YX.The relationship of the amplification and gene expression of EGFR with the clinical pathology of glioma and tumor apoptosis activity[J]. Chin J Cerebrovasc Dis， 2012, 6(6):324-329.

[10] Wei H, Lu W, Li M, et al. Concomitance of P-gp/LRP Expression with EGFR Mutations in Exons 19 and 21 in Non-Small Cell Lung Cancer[J]. Yonsei Med J，2016, 57(1): 50-57.

[11] Zhang Y, Fang W, Yan Y, et al. The efficacy of first-line chemotherapy is associated with KRAS mutation status in patients with advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. Med Oncol，2015,32(3):61.

[12] Jeuken J, van den Broecke C, Gijsen S, et al. RAS/RAF pathway activation in gliomas: the result of copy number gains rather than activating mutations[J]. Acta Neuropathol，2007, 114(2): 121-133.

[13] Basto D, Trovisco V, Lopes JM, et al. Mutation analysis of B-RAF gene in human gliomas[J]. Acta Neuropathol， 2005, 109(2): 207-210.

[14] Ji Y, Zheng M, Ye S, et al. PTEN and Ki67 expression is associated with clinicopathologic features of non-small cell lung cancer[J]. J Biomed Res，2014, 28(6): 462-467.

[15] Ciancio N, Galasso MG, Campisi R, et al. Prognostic value of p53 and Ki67 expression in fiberoptic bronchial biopsies of patients with non small cell lung cancer[J]. Multidiscip Respir Med，2012, 7(1):29.

醫(yī)學術語使用規(guī)范

醫(yī)學術語應全文統(tǒng)一，不要一義多詞或一詞多義。婦產(chǎn)科學、耳鼻咽喉科學、血液病學、呼吸病學、內(nèi)分泌學、眼科學和外科學的名詞已由醫(yī)學名詞審定委員會審定公布，應嚴格執(zhí)行。其他尚未審定者，目前以下列兩個主題詞索引為準：(1)《醫(yī)學主題詞注釋字順表(1992年版)中文索引》(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學信息研究所，1992)；(2)《中醫(yī)藥主題詞表》(中國中醫(yī)研究院圖書情報研究所，1987)。在這兩個主題詞表中找不到者，則以人民衛(wèi)生出版社出版的《英漢醫(yī)學詞匯》、化學工業(yè)出版社出版的《藥名詞匯》和科學出版社出版的各學科名詞審定本為準。國內(nèi)尚無統(tǒng)一譯名的，參考以上詞典慎重擬定，并在譯名后加括號標注外文；在醫(yī)學名詞審定委員會正式公布后，應立即嚴格遵照執(zhí)行。中文藥物名稱應使用其化學名，不用商品名。

Clinical significance of EGFR, KRAS and Ki67 protein expressions in gliomas

JIANG Zhenfu1, LI Mei2, WEI Hong3

(1.NeurosurgeryDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China; 2.LaboratoryCenter,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China; 3.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To study the clinical significance of EGFR, KRAS and Ki67 expressions in glioma. Methods The postoperative glioma tissues were collected and divided into groups according to the clinicopathological agents and the classification of the WHO(World Health Organization). EGFR, KRAS and Ki67 expressions in glioma were detected by immunohistochemistry. Results EGFR protein expression frequency were 57.5% and 80.5% in the below and over 42-year-old age groups (P<0.05); 56.3% and 77.6% in the low grade and high grade groups (P<0.05). KRAS protein expression was not correlated to the genders, ages of patients and the grades of glioma (P>0.05). Ki67 protein expression frequency were 31.3% and 69.4% in the low grade and high grade groups (P<0.05). EGFR expression was not correlated to the expression of KRAS or Ki67(P>0.05). Ki67 expression was not correlated to KRAS expression (P>0.05). Conclusion In gliomas, EGFR and KRAS expressions were independent, which would suggest that many molecular mechanisms involved in the carcinogenesis and development of gliomas.

Gliomas; EGFR; KRAS; Ki67

10.11724/jdmu.2017.02.05

姜振富(1984-)，男，主治醫(yī)師。E-mail：jzf-1001@163.com

韋 鴻，醫(yī)師。E-mail：whong_1985@163.com

R739.41

A

1671-7295(2017)02-0127-05

姜振富，李梅，韋鴻.腦膠質(zhì)瘤EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表達及臨床意義[J].大連醫(yī)科大學學報，2017,39(2)：127-131.

2016-12-04;

2017-01-02)