鄧麗玲，羅 佩，侯麗瑩，楊正望*，余曦明（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 40007）

丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢大鼠高雄激素血癥雄激素、瘦素及其受體表達(dá)的影響

鄧麗玲1，羅 佩1，侯麗瑩1，楊正望2*，余曦明1
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

目的 觀察丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢綜合征伴高雄激素血癥大鼠雄激素、瘦素及其受體的影響。方法 利用脫氫表雄酮誘導(dǎo)建立多囊卵巢大鼠高雄激素血癥模型，隨機(jī)設(shè)立丹梔逍遙組、達(dá)英組、模型組、空白對(duì)照組，予以相應(yīng)藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化；酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清雄激素水平；ELISA法檢測(cè)血清瘦素；免疫組化測(cè)定卵巢瘦素受體的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，丹梔逍遙散可顯著降低大鼠血清瘦素、睪酮、游離睪酮水平值，減少卵巢瘦素受體陽(yáng)性表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 丹梔逍遙散可降低多囊卵巢高雄激素血癥大鼠血清瘦素、雄激素水平值，減少卵巢瘦素受體陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)而降低瘦素生物利用度及雄激素活性，從而改善多囊卵巢綜合征高雄激素血癥和排卵障礙。

丹梔逍遙散；多囊卵巢綜合征；高雄激素血癥；瘦素；瘦素受體

多囊卵巢綜合征 (polycystic ovarian syndrome, PCOS)是生育年齡女性常見的、多發(fā)的生殖功能障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不僅與生殖、脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗有關(guān)，還與雄激素、瘦素及其受體密切相關(guān)[1-2]，其最重要的內(nèi)分泌特征是高雄激素血癥，它也是早期預(yù)示PCOS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。高雄激素血癥臨床上泛指血清雄激素如睪酮(testosterone,T)、游離睪酮 (free testosterone,FT)和雄烯二酮(androstenedione,DTA)含量增高，生成和活力增強(qiáng)狀態(tài)，以血清高雄激素、高瘦素血癥、排卵障礙和糖脂代謝異常為主要臨床特征，其對(duì)女性患者的子宮內(nèi)膜、心血管系統(tǒng)、糖脂代謝等有較危險(xiǎn)的遠(yuǎn)期影響[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[5],下丘腦-垂體-卵巢軸的功能紊亂是多囊患者最主要的病理生理變化，而瘦素(leptin，LP)作為脂肪細(xì)胞分泌的一種循環(huán)激素，參與機(jī)體生殖功能、能量代謝和體質(zhì)量平衡的調(diào)節(jié)，可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的功能,與瘦素受體 （leptin receptor,LEPR）一并參與了PCOS發(fā)病的各個(gè)環(huán)節(jié)。目前有關(guān)瘦素及其受體與PCOS高雄激素血癥之間的相關(guān)機(jī)制關(guān)系研究還較少，近年來也成了研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。因此，本研究旨在觀察丹梔逍遙散對(duì)由脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）建立的多囊卵巢伴高雄激素血癥大鼠卵巢組織形態(tài)、血清雄激素、瘦素及其受體的影響，初步探討雄激素、瘦素及其受體在PCOS高雄激素血癥中的作用和關(guān)系，為臨床治療該病提供治療思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也對(duì)提高育齡女性生活質(zhì)量具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用21日齡斷乳未成年SPF級(jí)雌性SD大鼠60只（體質(zhì)量50～100 g），由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(湘2015-0005),飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和蒸餾水，適應(yīng)性喂養(yǎng)至23 d。

1.2 藥品及試劑

DHEA（購(gòu)自湖北芳通藥業(yè)有限公司）；注射大豆用油（蘇州捷易龍貿(mào)易有限公司）；達(dá)英-35（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，規(guī)格：醋酸環(huán)丙孕酮2 mg+炔雌醇0.035 mg，批號(hào) H20140240）；性激素放射免疫試劑盒：北京華英生物技術(shù)研究所；ELISA瘦素試劑盒、瘦素受體免疫組化試劑盒、SABC二抗試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。丹梔逍遙散（白術(shù)10 g，柴胡6 g，當(dāng)歸10 g，茯苓15 g，牡丹皮15 g，山梔10 g，薄荷5 g，煨姜5 g，芍藥10 g，甘草5 g）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供并煎煮成湯劑置于冰箱貯存?zhèn)溆茫? mL含生藥0.91 g。將1片達(dá)英-35溶于100 mL蒸餾水中。

1.3 動(dòng)物造模

大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組40只，空白對(duì)照組20只。參照李燕等[6]造模方法：①模型組每天定時(shí)行頸背部皮下注射DHEA 6 mg/(100 g·d)+注射大豆用油0.2 mL，即用酒精燈將DHEA與注射大豆用油混合加熱至成清亮黃色，稍冷卻后注射。②空白組每天同時(shí)間行頸背部皮下注射0.2 mL大豆油劑。兩組均連續(xù)注射20 d。注射第10天起每日觀察陰道涂片，模型組大鼠陰道脫落細(xì)胞僅見大量白細(xì)胞和少量角化細(xì)胞，提示其始終處于動(dòng)情間期，無規(guī)律動(dòng)情周期變化，即無排卵；注射第20天當(dāng)晚禁食水，次日兩組各隨機(jī)抽取10只大鼠，眼球摘除取血，血清雄激素顯示模型組T、FT明顯高于空白組；處死大鼠取雙側(cè)卵巢稱質(zhì)量，HE染色光鏡下觀察卵巢形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢內(nèi)卵泡明顯高于空白組，成多囊樣發(fā)育，可見小卵泡和閉鎖卵泡及多個(gè)明顯囊狀擴(kuò)張卵泡，無成熟卵泡，由此判定造模成功。

1.4 分組干預(yù)

判定造模成功后，將模型組大鼠30只完全隨機(jī)分為：丹梔逍遙散組、達(dá)英組、模型組，每組10只，加上空白對(duì)照組10只，共4組。從第21天開始，給藥劑量按成人女性平均體質(zhì)量60 kg體表面積換算，丹梔逍遙散組每日定時(shí)予以等效劑量9.2 g/(kg·d）灌胃；達(dá)英組每日同時(shí)段給予等效劑量達(dá)英-35[0.21 g/(kg·d)]灌胃；模型組和空白對(duì)照組每日同時(shí)段以同容積蒸餾水灌胃。1次/d，均連續(xù)灌胃21 d，停藥7 d，28 d為1個(gè)周期，共給藥3個(gè)周期。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 標(biāo)本采集 最后一天灌胃后所有大鼠禁食水12 h后稱質(zhì)量，并全部斷頸取血，靜置離心，分離血清，低溫保存（-20℃），用于測(cè)定血清雄激素及血清瘦素；精確摘取大鼠雙側(cè)卵巢，除去表層脂肪結(jié)締組織，稱質(zhì)量記錄。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè)及方法 卵巢組織用4%多聚甲醛固定,脫水后常規(guī)石蠟包埋并切片染色，一側(cè)卵巢組織HE染色后觀察卵巢形態(tài)學(xué)改變。采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清T、FT；ELISA方法檢測(cè)血清LP；采用免疫組化SABC法測(cè)定另一側(cè)卵巢組織LEPR的表達(dá)，應(yīng)用平均光密度法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析，即在切片染色后，選擇染色良好區(qū)域，其表達(dá)情況根據(jù)顯微鏡下（40×10）下測(cè)定單位面積陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的光密度值判斷，取5個(gè)視野的平均光密度值作為該蛋白在一只大鼠卵巢組織中的表達(dá)結(jié)果。結(jié)果判定：顯色呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 23.0軟件處理分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，全部計(jì)量資料采用“±s”表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法（方差齊性者）和Dunnet's T3檢驗(yàn)（方差不齊者），計(jì)數(shù)資料采用χ2（卡方）檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

藥物干預(yù)結(jié)束后，模型組大鼠卵巢肉眼觀察體積較大，形態(tài)不規(guī)則，表面凹凸不平，色蒼白，HE染色光鏡下觀察其卵巢包膜增厚，呈多囊樣發(fā)育，可見多個(gè)小卵泡和閉鎖卵泡及囊狀擴(kuò)張卵泡，未見成熟卵泡或排卵征；丹梔逍遙組、達(dá)英組大鼠卵巢外觀色澤稍紅潤(rùn)，偶有表面不規(guī)則，包膜稍厚，偶可見多囊樣發(fā)育，內(nèi)可見竇狀卵泡；丹梔逍遙組部分可見成熟卵泡或排卵征；空白對(duì)照組卵巢外表形態(tài)規(guī)則，表面光滑，內(nèi)可見竇狀卵泡發(fā)育及成熟卵泡，少量可見排卵征。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)改變光鏡圖（HE染色，×400）

2.2 血清雄激素變化

藥物干預(yù)周期結(jié)束后，與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、丹梔逍遙組、達(dá)英-35組血清T、FT水平值均升高（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，丹梔逍遙組、達(dá)英組血清T、FT值均顯著降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠組間血清雄激素值水平比較 （±s，n=10）

表1 大鼠組間血清雄激素值水平比較 （±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.01。

?

2.3 血清LP水平比較

藥物干預(yù)周期結(jié)束后，與空白對(duì)照組比較，模型組、丹梔逍遙組、達(dá)英組大鼠血清LP水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，丹梔逍遙組、達(dá)英組LP水平顯著降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.4 卵巢組織LEPR表達(dá)觀察

觀察各組大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞，顯色呈棕黃色或棕褐色顆粒為L(zhǎng)EPR陽(yáng)性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組可見LEPR極少量表達(dá)；與空白對(duì)照組相比，模型組可見LEPR高表達(dá)（棕黃色和棕褐色顆粒最多），LEPR平均光密度值顯著增高 （P＜0.01）；藥物干預(yù)后，與模型組比較，丹梔逍遙組、達(dá)英組LEPR表達(dá)均明顯減少，LEPR平均光密度值較模型組明顯降低（P＜0.01）。見圖2、表2。

表2 大鼠組間血清雄激素值水平比較 （±s，n=10）

表2 大鼠組間血清雄激素值水平比較 （±s，n=10）

注：與空白組比較*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05。

?

圖2 各組大鼠卵巢組織LEPR蛋白表達(dá)光鏡圖（DAB顯色，×400）

3 討論

PCOS高雄激素血癥是一種涉及生殖、內(nèi)分泌、糖脂代謝及卵巢局部調(diào)控因素等多系統(tǒng)多態(tài)性的疾患，與LP及LEPR異常密切相關(guān)，其導(dǎo)致的閉經(jīng)和不孕可引起子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的機(jī)率升高[7]。LP在體內(nèi)濃度受LEPR調(diào)節(jié)，LEPR將LP轉(zhuǎn)運(yùn)到作用靶點(diǎn)，并與LP結(jié)合后進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、實(shí)現(xiàn)生物效應(yīng)。LP與LEPR一起在PCOS發(fā)生發(fā)展中參與卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的作用，促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞合成雄激素，雄激素升高又可促抗苗勒管激素水平 （anti-mulerian hormone,AMH）的產(chǎn)生，AMH增高可抑制芳香化酶的活性，阻礙雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，造成局部卵巢高雄激素的微環(huán)境改變，引起PCOS高雄激素血癥，進(jìn)而影響人體生殖功能[8-9]。

目前關(guān)于LP、LEPR和雄激素的相互關(guān)系在PCOS高雄激素血癥發(fā)病中的病理機(jī)制研究還較少,有研究認(rèn)為[10]，一方面可能因雄激素可增強(qiáng)體內(nèi)神經(jīng)肽Y的表達(dá),使促性腺激素釋放激素和促性腺激素的分泌減少,進(jìn)而促使LP分泌增加；另一方面高濃度的LP可抑制顆粒細(xì)胞芳香化酶活性,抑制雄烯二酮芳香化,使血清雄激素水平異常升高。但Chekhranova等[11]認(rèn)為其內(nèi)在聯(lián)系與LP及LEPR基因突變有關(guān)，基因突變會(huì)導(dǎo)致LP及LEPR功能降低,使下丘腦對(duì)LP的敏感性減弱,從而導(dǎo)致機(jī)體高瘦素血癥的發(fā)生。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[12]研究證實(shí)高劑量LP作用于受體可抑制排卵，PCOS大鼠卵巢中LEPR表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致LP對(duì)卵巢功能的抑制增強(qiáng)。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)PCOS高雄激素血癥不孕患者血清和卵泡液LP濃度異常升高，提示卵巢局部的高LP很可能是引起不孕的病理因素。本研究中模型組大鼠血清LP異常升高，其大鼠卵巢組織LEPR表達(dá)增強(qiáng)，提示二者可能參與了PCOS高雄激素血癥的發(fā)生發(fā)展。

總之，LP和LEPR在維持人體正常的生理功能方面起著巨大的作用，在與PCOS高雄激素血癥相關(guān)的高雄激素、排卵障礙、胰島素抵抗及肥胖中所起的作用也不盡相同，其二者與PCOS高雄激素血癥之間的具體機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,目前還未透徹了解,需行大樣本多中心的循證醫(yī)學(xué)研究以進(jìn)一步調(diào)查探討,闡明LP及LEPR的作用，從而為揭示PCOS相關(guān)疾病的病因及其診治開辟新途徑。

綜上所述并結(jié)合本研究結(jié)果提示，丹梔逍遙散可改善卵巢多囊樣變，降低PCOS高雄激素血癥大鼠血清雄激素、LP水平，減少LEPR在卵巢組織的陽(yáng)性表達(dá)，從而減少LP的生物利用度，進(jìn)而抑制雄激素分泌，降低雄激素活性，有助于卵泡正常生長(zhǎng)發(fā)育和優(yōu)勢(shì)卵泡的形成，促使卵巢正常排卵，改善大鼠高雄激素狀態(tài)和卵巢排卵障礙功能。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Danzhi Xiaoyao Powder on Androgen,Leptin and Leptin Receptor in Polycentric Ovary Hyperandrogenism Rats

DENG Liling1,LUO Pei1,HOU Liying1,YANG Zhengwang2*,YU Ximing1
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Gynecology and Obestrics,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effect of Danzhi Xiaoyao Powder (DZXYP)on the expression of androgen,leptin and leptin receptor(LEPR)in polycentric ovary(PCO)hyperandrogenism rats.Methods The PCO Hyperandrogenism model rats induced by dehydroepiandrosterone (DHEA)were randomly divided into DZXYP group,Diane group,model group and blank control group.The morphologic changes were observed after the experiment.The levels of androgen were determined by radioimmunity.Serum leptin was determined by ELISA.LEPR in the tissues of ovaries was assessed with immunohistochemistry method.Results Danzhi Xiaoyao Powder could reduce the values of leptin,testosterone,free testosterone,and the expression of LEPR obviously,the differences were statistically significant (P＜0.01).Conclusion DZXYP could reduce the levels of leptin,androgen and decrease the expression of LEPR of PCO hyperandrogenism rats.Then it could decrease the bioavailability of leptin and androgenic activities to improve high serum-T and ovulation barrier of polycentric ovary syndrome.

Danzhi Xiaoyao Powder;polycentric ovary syndrome；hyperandrogenism;leptin;leptin recepter

R285.5；R711.75

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.04.002

2016-07-12

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2014J504I)。

鄧麗玲，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)婦科生殖內(nèi)分泌研究。

*楊正望，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：435068288@qq.com。

本文引用：鄧麗玲，羅 佩，侯麗瑩，楊正望，余曦明.丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢大鼠高雄激素血癥雄激素、瘦素及其受體表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（4）：353-356.