吳世婷，劉麗芳*，熊家青，丁 玲，曾 葉，肖 灑(.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，湖南 長沙 40007；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 4008；.湖南航天醫(yī)院，湖南 長沙 4005)

黃芪解毒湯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡及對(duì)β-catenin、C-myc基因表達(dá)影響的研究

吳世婷1，劉麗芳1*，熊家青2，丁 玲3，曾 葉2，肖 灑2
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；3.湖南航天醫(yī)院，湖南 長沙 410205)

目的 探討黃芪解毒湯體外干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡及對(duì)β-catenin、C-myc基因表達(dá)的影響，及該方抑制乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。方法 培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并將其分為黃芪解毒湯組、阿霉素組及空白對(duì)照組。以黃芪解毒湯濃縮液、阿霉素液及細(xì)胞培養(yǎng)液分別干預(yù)各組MCF-7細(xì)胞24 h后，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其對(duì)β-catenin,C-myc基因表達(dá)的影響。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，黃芪解毒湯組、阿霉素組可明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡（P＜0.01）；黃芪解毒湯組及阿霉素組β-catenin、C-myc表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論黃芪解毒可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡，顯著降低β-catenin、C-myc基因表達(dá)，該結(jié)果為黃芪解毒湯在乳腺癌術(shù)后治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

MCF-7；β-catenin，C-myc；細(xì)胞凋亡；黃芪解毒湯

乳腺癌在中醫(yī)學(xué)中稱為“乳巖”，其特點(diǎn)是乳房腫塊質(zhì)地堅(jiān)硬、凹凸不平、邊界不清、推之不移、按之不痛等，是女性最常見的惡性腫瘤之一。它的發(fā)生和發(fā)展與Wnt信號(hào)通路功能的失調(diào)有密切的關(guān)系，其中β-catenin是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，當(dāng)β-catenin與E-cadherin形成的粘附復(fù)合體中脫離，喪失了介導(dǎo)同種細(xì)胞之間的粘附作用,并進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中,通過與淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(LEF)、轉(zhuǎn)運(yùn)因子T細(xì)胞因子(TCF)及協(xié)同激活因子相結(jié)合激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活[1]。同時(shí)，在多種人類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)β-catenin異常表達(dá)和 β-catenin基因突變。C-myc是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常重要的靶基因，研究顯示，抑癌基因失活和癌基因的激活可異常激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，β-catenin降解障礙，可導(dǎo)致C-myc等靶基因激活，細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生［2］。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)前期艾萍等[3]證實(shí)IC50黃芪解毒湯濃縮液為生藥量1.467 g/mL，阿霉素液為 0.316 μg/mL。 故本實(shí)驗(yàn)以生藥量1.467 g/mL黃芪解毒湯濃縮液、0.316 μg/mL阿霉素液干預(yù)MCF-7細(xì)胞。并以流式細(xì)胞儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的手段，從分子生物學(xué)角度研究黃芪解毒湯對(duì)誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞凋亡及 β-catenin和C-myc基因表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物

黃芪解毒湯：黃芪、太子參、茯苓、白術(shù)、薏苡仁、女貞子、半枝蓮、白花蛇舌草、龍葵、浙貝母、山慈菇、玄參、麥冬、甘草等，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。常規(guī)煎煮,以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上定容至生藥量1.467 g/mL，將藥液以2 000轉(zhuǎn)/min離心,取上清液以微孔濾膜(0.22 μm)濾過，備用。阿霉素（10 mg/瓶）：深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1307E1,以雙蒸水配制為1 mg/mL。

1.3 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（500 mL）：美國Hyclone公司；PBS磷酸緩沖鹽溶液：北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（500 mL）：美國Gibco公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection試劑套裝：美國BD公司；0.25%胰蛋白酶消化液 （100 mL）及雙抗（100 mL）：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；Trizol： Invitrogen; RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit：Fermentas；Deoxyribonuclease I (DNase I)：Fermentas；RiboLockTMRibonuclease Inhibitor:Fermentas；SYBR Green-PCR Master Mix：ABI，批號(hào)：4309155。

1.4 儀器設(shè)備

1-13高速離心機(jī)：SIGMA；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；CO2培養(yǎng)箱：Heracell，德國賀利氏公司；XDS-1B倒置生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7900型 Realtime-PCR儀：ABI；JYSPC型水平電泳槽：北京君意東方儀器公司；DG-Ⅲ雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀：北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

依據(jù)文獻(xiàn)[4-7],取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7，以1.25× 105mL/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞瓶中細(xì)胞長滿單層時(shí)，分為3組：黃芪解毒湯組、阿霉素組及空白對(duì)照組，在鏡下觀察取處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7，以1.25× 105mL/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。待細(xì)胞貼壁后，吸棄舊液，空白對(duì)照組加入4 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)，黃芪解毒湯組加入黃芪解毒湯含藥培養(yǎng)基（1.467 g/mL），阿霉素組加入阿霉素含藥培養(yǎng)基 （0.316 μg/mL）,置于培養(yǎng)箱中孵育24 h 后,常規(guī)收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡

取藥物干預(yù)24 h后的細(xì)胞懸液1 mL，于室溫下2 000 r/min離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞。加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩，于室溫2 000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)兩次。將100 μL細(xì)胞懸液移入5 mL試管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕震蕩混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入400 μL Binding Buffer緩沖液，并于1 h內(nèi)以流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)β-catenin及C-myc基因表達(dá)

提取細(xì)胞樣本RNA：加入0.8 mLTrizol試劑消化。室溫下靜置5 min、加入0.2倍體積的三氯甲烷，劇烈搖動(dòng)15 s。12 000 r/min于4℃下離心10 min。吸上層無色水相，轉(zhuǎn)移至干凈的試管，加入0.5倍體積的異丙醇，-20℃下靜置10 min，于4℃下12000 r/min離心10 min。棄上清，將下層RNA沉淀用1 mL 75%乙醇洗滌，在震蕩器上混勻后4℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清。用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min，將沉淀加入適量無RNase的水，完全溶解RNA。以2 000 r/min，離心20 s。以A260/A280法檢測(cè)RNA純度及濃度示無嚴(yán)重DNA污染；RNA純度較高；28 S與18 S IOD比值約為2∶1；樣本沒有出現(xiàn)嚴(yán)重RNA降解，滿足試驗(yàn)要求；瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性并去除基因組DNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序,其結(jié)果以目的基因mRNA相對(duì)含量為2-ΔΔCt（RQ），2-△△CT值越大，說明基因相對(duì)含量越高。引物由primer3.0軟件設(shè)計(jì),并由遠(yuǎn)泰生物協(xié)助合成,GAPDH內(nèi)參：上游-CAATGACCCCTTCATTG ACC，下游-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG；β-catenin上游-ATGAC TCGAGCTCAGAGGGT，下游-ATTG CACGTGTGGCAAGTTC；C-myc：上游-CGTCCTCGGATTCTCTGCTC，下游-GCTGCGTAGTTGTGCTGATG。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡

藥物干預(yù)24 h后的細(xì)胞見圖1，黃芪解毒湯及阿霉素組與空白對(duì)照組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），黃芪解毒湯組與阿霉素組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。由數(shù)據(jù)分析得出，在未藥物干預(yù)的MCF-7中凋亡細(xì)胞較少，而經(jīng)過藥物干預(yù)后的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞凋亡率有不同程度的增高。

表1 不同藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用 (±s,n=3)

表1 不同藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用 (±s,n=3)

注：與空白對(duì)照組比較△P＜0.01。

組別空白對(duì)照組黃芪解毒湯組阿霉素組F P凋亡率（% ）2 2 .2 ± 0 .9 6 5 1 .1 ± 1 .1 5△5 3 .0 ± 4 .1 4△1 1 2 0 .0 0 0

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡圖

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)β-catenin及C-myc基因表達(dá)

圖2為β-catenin及C-myc基因熔點(diǎn)曲線圖，結(jié)果所有圖片均顯示只有一個(gè)峰值，沒有出現(xiàn)雜峰，提示無非特異性熒光信號(hào)，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物單一，有利于結(jié)果分析。表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，被藥物組干預(yù)的細(xì)胞中β-catenin及C-myc基因表達(dá)明顯降低且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或P＜ 0.01）；且阿霉素組表達(dá)最低，其次為黃芪解毒湯組，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖 2 β-catenin及C-myc基因熔點(diǎn)曲線圖

表2 不同藥物組中β-catenin及C-myc的相對(duì)含量 (±s，n=3)

表2 不同藥物組中β-catenin及C-myc的相對(duì)含量 (±s，n=3)

注：與空白對(duì)照組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與阿霉素組比較，*P＜0.01。

分組空白對(duì)照組黃芪解毒湯組阿霉素組F P mRNA（β-catenin）4.088±0.2805 3.344±0.1897△* 1.091±0.0917△△178.2 0.000 mRNA（C-myc）4.262±0.1635 2.501±0.2947△* 1.123±0.1849△△673.7 0.000

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從分子生物學(xué)角度探討黃芪解毒湯治療乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以黃芪解毒濃縮液及阿霉素液干預(yù)MCF-7細(xì)胞，并以流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物干預(yù)后MCF-7細(xì)胞的凋亡率、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)β-catenin、C-myc基因的表達(dá)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，黃芪解毒湯組及阿霉素組中MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯升高，且黃芪解毒湯組及阿霉素組中β-catenin、C-myc基因的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。

黃芪解毒湯是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺科經(jīng)驗(yàn)方，黃芪為方中君藥，取其主健脾補(bǔ)中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、托毒生肌之功效；臣以太子參補(bǔ)氣健脾、生津潤肺，兩者相輔相成，共奏益氣健脾養(yǎng)陰之功，主扶正；白術(shù)取其溫補(bǔ)脾氣，茯苓滲濕健脾，苓術(shù)同用，加強(qiáng)益氣健脾除濕，另外茯苓可補(bǔ)益心神、寧心安神；佐以薏苡仁利水消腫、滲濕健脾，玄參甘苦咸微寒，可清熱涼血、瀉火解毒、滋陰，麥冬甘微苦寒，養(yǎng)陰生津、潤肺清心，用于方中有益氣養(yǎng)陰，白花蛇舌草與半枝蓮清熱解毒、利濕通淋消腫效優(yōu)；女貞子甘苦涼，滋補(bǔ)肝腎、烏須明目；浙貝母清熱，龍葵利水，兩者均可散結(jié)，共奏清熱解毒抗癌功效;甘草為使藥以養(yǎng)胃和中。全方主益氣養(yǎng)陰解毒。本方主治乳腺癌術(shù)后放化療后正氣不足，體質(zhì)虛弱，以防止其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移為組方的宗旨。阿霉素為常用乳腺癌化療藥物，其作用早已得到臨床及實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。其治療乳腺癌的作用可能與黃芪解毒湯及阿霉素可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡及抑制β-catenin、C-myc基因的表達(dá)有關(guān)。但在臨床運(yùn)用中黃芪解毒湯作為傳統(tǒng)的中藥湯劑其毒副作用較小，而阿霉素為常見的細(xì)胞毒性藥物有很大的毒副作用，故在乳腺癌的抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中黃芪解毒湯值得推廣運(yùn)用。但是黃芪解毒湯作為一種中藥煎劑其本身藥物組成及成分較多，故還需要更多的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探討其在防治乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，更好地指導(dǎo)中醫(yī)藥在臨床治療中的應(yīng)用。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Huangqi Jiedu Decoction on Inducing Apoptosis of Breast Cancer Cells and Gene Expression of β-catenin and C-myc

WU Shiting1，LIU Lifang1*，XIONG Jiaqing2，DING Ling3，ZENG Ye2，XIAO Sa2
(1.Department of Breast Cancer,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Hunan Aerospace Hospital,Changsha,Hunan 410205,China.)

Objective To observe the effects of Huangqi Jiedu decoction on the inducing apoptosis of MCF-7 and expression of β-catenin,C-myc of human breast cancer cells in vitro and to reveal its mechanism of inhibiting recurrence and metastasis of breast cancer.Methods The cultured MCF-7 cells were assigned into Huangqi Jiedu decoction group,doxorubicin group and control group.After intervention for 24 h by Huangqi Jiedu decoction,doxorubicin and cell cultured filed,the apoptosis of breast cancer cell MCF-7 was determined by flow cytometryt.The expression of β-catenin,C-myc genes was detected by Real Time Quantitative-PCR.Results Compared with the control group,Huangqi Jiedu decoction and doxorubicin groups had the more obvious effect on inducing the apoptosis of breast cancer cell MCF-7 (P＜0.01).The expressions of β-catenin and C-myc protein in Huangqi Jiedu decoction and doxorubicin groups were significantly lower than those in control group (P＜0.01).Conclusion Huangqi Jiedu decoction could induce the apoptosis of MCF-7breast cancer cell,and significantly prohibit the expression of β-catenin and C-myc genes,which provide the experimental evidence for Huangqijiedu decoction in the treatment for postoperation breast cancer.

MCF-7;β-catenin;C-myc;apoptosis;Huangqi Jiedu decoction

R285.5；R655.8

B

doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2017.04.003

2016-08-02

湖南省科技廳（2012SK3137），湖南省教育廳（13A071）。

吳世婷，女，在讀碩士研究生，從事乳腺病臨床研究。

*劉麗芳，女，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:282379223@qq.com。

本文引用：吳世婷，劉麗芳，熊家青，丁 玲，曾 葉，肖 灑.黃芪解毒湯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡及對(duì)β-catenin、C-myc基因表達(dá)影響的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（4）：357-360.