劉 莎，彭曉珊，丁 煌，石國民，唐映紅*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 4008；.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙 4008）

益肺通絡(luò)顆粒體外抗結(jié)核及止咳止血作用研究

劉 莎1，彭曉珊1，丁 煌1，石國民2，唐映紅1*
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙 410018）

目的 研究益肺通絡(luò)顆粒體外抗結(jié)核、止血、止咳作用及對非特異免疫功能的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 用人型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（H37Rv）和臨床分離的結(jié)核分枝桿菌敏感菌株和耐藥菌株，接種于含有不同濃度益肺通絡(luò)顆粒的培養(yǎng)基中，觀察結(jié)核桿菌的生長情況；應(yīng)用剪尾法、毛細(xì)管法測定小鼠的出血時(shí)間、凝血時(shí)間，觀察益肺通絡(luò)顆粒的止血作用；用氨水引咳，觀察其止咳作用；通過巨噬細(xì)胞碳粒廓清試驗(yàn)，觀察其對非特異性免疫功能(廓清指數(shù)和校正廓清指數(shù))的影響。結(jié)果 益肺通絡(luò)顆粒在高濃度（0.01～0.2 g/mL）時(shí)對結(jié)核分枝桿菌有顯著的抑菌作用，但隨著濃度降低，其抑菌效果也顯著減弱，濃度減低至0.025 g/mL以下時(shí)抑菌作用不明顯；與對照組小鼠出血時(shí)間 （321.2±34.3）s、凝血時(shí)間（135.8±5.1）s比較，益肺通絡(luò)高劑量組小鼠出血時(shí)間（169.5±23.0）s、凝血時(shí)間（97.5±3.3）s均顯著縮短（P＜0.01）；與對照組小鼠氨水引咳的潛伏期（36.4±1.9）s、5 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)（45.9±3.1）次比較，益肺通絡(luò)高劑量組小鼠氨水引咳的潛伏期（54.1±1.4）s顯著延長、5 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)（22.7±2.2）次顯著減少（P＜0.01）；且小鼠廓清指數(shù)和校正廓清指數(shù)較對照組均有顯著提高（P＜0.01）。結(jié)論 益肺通絡(luò)顆粒具有體外抗結(jié)核作用，具有止血止咳和增強(qiáng)非特異性免疫功能的作用。

益肺通絡(luò)顆粒；抗結(jié)核；止咳；止血；碳粒廓清指數(shù)；結(jié)核分枝桿菌

益肺通絡(luò)顆粒由黃精、白及、太子參、百部、矮地茶、紫花地丁、大薊等11味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)、去腐生新的功效，主治氣陰兩虛夾瘀型耐多藥肺結(jié)核[1]。本文對益肺通絡(luò)顆粒進(jìn)行了體外抗結(jié)核、出血、凝血、止咳及增強(qiáng)免疫等方面的研究，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

益肺通絡(luò)顆粒（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥劑室提供，批號20131110，每克浸膏干粉含4.3 g生藥）；云南白藥（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：ZEA1406）；鹽酸噴托維寧片（25 mg/片，吉林省東方制藥有限公司，批號：20130903）；十全大補(bǔ)丸（九芝堂股份有限公司，批號：201306024，每8丸相當(dāng)于原生藥3 g）；阿米卡星（西格瑪公司，批號：WXBB6431V）；氨水（湖南匯虹試劑有限公司，批號：2014061607）；印度墨汁（Salarbio公司，Cat.NO.18060）；碳酸氫鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：2014050306）；硫酸鎂、谷氨酸鈉、檸檬酸鎂等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物

昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，SPF級，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004.

1.3 菌株來源

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由國家CDC結(jié)核病控制中心提供；結(jié)核分枝菌臨床分離株（結(jié)核分枝桿菌耐藥株22株、敏感菌17株）由長沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.4 儀器

756型紫外分光光度儀，上海光譜有限公司；HH·B11·600-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；ZHN-6型蒸汽恒溫凝固器，中國原子能科學(xué)研究所；DEN-1型電子濁度計(jì)，英國GRANT公司；SI-234電子天平，丹佛儀器（北京）有限公司；EPPENDORF-GERMANY移液槍。

2 方法

2.1 體外對結(jié)核分枝桿菌的生長抑制作用

方法[2]，用羅氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基直接稀釋含藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基藥液，配制成1:1、1:2、1:4、1:8四個(gè)不同稀釋度的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中相應(yīng)的含藥量：益肺通絡(luò)四個(gè)濃度生藥量含量分別是 0.2 g/mL、0.1 g/mL、0.05 g/mL、0.025 g/mL），分裝每試管7 mL，擺斜面滅菌后備用。臨床分離結(jié)核分枝桿菌的新鮮培養(yǎng)物 （初生長2周）無需二次傳代即可做藥敏試驗(yàn)，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，即配? mg/mL的菌懸液。將1 mg/mL的菌懸液10倍稀釋至10～2 mg/mL，以滅菌吸管準(zhǔn)確吸取菌液0.1 mL分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為10～3 mg。置于37℃培養(yǎng)。分別在接種后的第3天、第1、2、3、4周周末觀察各培養(yǎng)基上結(jié)核分枝桿菌生長情況，同時(shí)記錄觀察結(jié)果，至第四周止。根據(jù)培養(yǎng)基上細(xì)菌生長情況進(jìn)行判斷，羅氏對照培養(yǎng)基中的結(jié)核分枝桿菌生長情況良好，如果培養(yǎng)基上無菌生長或菌落數(shù)少于20個(gè)，結(jié)果報(bào)告為對藥物敏感，如果培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長且菌落數(shù)大于20個(gè)，結(jié)果報(bào)告為對藥物耐藥 （本次實(shí)驗(yàn)中對于含藥培養(yǎng)基上有菌生長，但明顯少于對照培養(yǎng)基生長菌落數(shù)的，判斷為有一定抑菌作用，表述為中度敏感）。對39株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和2株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的藥敏試驗(yàn)進(jìn)行觀察記錄。

2.2 對出血時(shí)間的影響

參考文獻(xiàn)方法[3]，選取健康小鼠60只，雌雄各半。適應(yīng)環(huán)境后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組12只：（1）正常對照組；（2）益肺通絡(luò)高劑量組（25.8 g/ kg）；（3）益肺通絡(luò)中劑量組（12.9 g/kg）；（4）益肺通絡(luò)低劑量組（6.4 g/kg）；（5）云南白藥組（0.26 g/kg），每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，對照組給予等體積的蒸餾水。末次給藥30 min后，分別以利剪將小鼠尾尖0.5 cm處橫斷，血液自行流出后計(jì)時(shí)，每隔15 s用濾紙吸去血滴1次，直至血液停止，計(jì)算從血液自行流出至血液自行停止的時(shí)間即為出血時(shí)間，比較組間差異。

2.3 對凝血時(shí)間的影響

參考文獻(xiàn)方法[4]，選取健康小鼠60只，雌雄各半。適應(yīng)環(huán)境后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組12只，前四組同“2.2”，第五組：云南白藥組（0.26 g/ kg），每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，對照組給予等體積的蒸餾水。末次給藥30 min后，用內(nèi)徑為1 mm毛細(xì)玻璃管經(jīng)眼眶插入內(nèi)眥球后靜脈叢取血至毛細(xì)管內(nèi)血柱達(dá)5 cm，每隔15 s折斷毛細(xì)管0.5 cm，并緩慢左右拉開，觀察折斷處有無血凝絲。計(jì)算從毛細(xì)玻璃管采血至出現(xiàn)血凝絲的時(shí)間即為凝血時(shí)間。

2.4 對小鼠氨水引咳試驗(yàn)的影響

參考文獻(xiàn)方法[5]424，選取健康小鼠60只，雌雄各半。適應(yīng)環(huán)境后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組12只，前四組同“2.2”，第五組：噴托維寧片組（0.013 g/ kg），每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，對照組給予等體積的蒸餾水。末次給藥30 min后，將動物置于1 000 mL燒杯中，上面加蓋篩網(wǎng)，向棉球中注入0.4 mL氨水（25%），迅速將燒杯倒置，刺激小鼠引發(fā)咳嗽，以小鼠腹肌強(qiáng)烈收縮，同時(shí)張嘴呼氣為準(zhǔn)。觀察并記錄各組小鼠咳嗽潛伏期 （從倒置燒杯至發(fā)生咳嗽的時(shí)間），以及小鼠5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

2.5 對非特異性免疫功能的影響

參考文獻(xiàn)方法[5]155，選取健康小鼠60只，雌雄各半。適應(yīng)環(huán)境后，按體重隨機(jī)分為5組，每組12只,前四組同“2.2”，第五組：十全大補(bǔ)丸組（1.5 g/kg），每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，對照組給予等體積的蒸餾水。末次給藥30 min后，稱取體質(zhì)量，尾靜脈注射印度墨汁0.1 mL/10 g，注射后2 min（t2 min）、20 min(t20 min)分別從眼眶后靜脈叢采血 20 μL，溶于 2 mL，0.1% Na2CO3溶液中搖勻，在波長610 nm下比色，測定光密度（以下分別用OD2 min和 OD20 min來表示2 min和20 min所取血樣的光密度）。取血完畢，用頸椎脫臼法處死小鼠，取其肝臟、脾臟，稱質(zhì)量。按公式對廓清指數(shù)（K）及校正廓清指數(shù)（α）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料用“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益肺通絡(luò)顆粒體外抗結(jié)核分枝桿菌作用

結(jié)果表明，益肺通絡(luò)顆粒在高濃度（0.1～0.2 g/mL以上）時(shí)對結(jié)核分枝桿菌都有顯著的抑菌作用，但隨著濃度降低，其抑菌效果也顯著減弱，濃度減低至0.025 g/mL以下時(shí)抑菌作用不明顯。見表1。

3.2 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠出血、凝血時(shí)間的影響

結(jié)果表明，益肺通絡(luò)顆粒組小鼠的出血、凝血時(shí)間均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表1 益肺通絡(luò)顆粒體外對結(jié)核分枝桿菌的生長抑制作用 （株，%）

表2 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠出血、凝血時(shí)間的影響 （±s，n=12）

表2 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠出血、凝血時(shí)間的影響 （±s，n=12）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠氨水引咳試驗(yàn)的影響

結(jié)果表明，益肺通絡(luò)顆粒組小鼠氨水引咳的潛伏期顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，P＜0.01），益肺通絡(luò)顆粒組5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著低于對照組（P＜0.01）。見表3。

表3 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠氨水引咳的影響 （±s，n=12）

表3 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠氨水引咳的影響 （±s，n=12）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別對照組益肺通絡(luò)高劑量組益肺通絡(luò)中劑量組益肺通絡(luò)低劑量組噴托維寧片劑量（g/kg）-25.8 12.9 6.4 0.013引咳潛伏期（s）36.4±1.9 54.1±1.4** 48.9±4.9* 46.8±3.8* 66.3±1.5** 5 min咳嗽（次）45.9±3.1 22.7±2.2** 31.1±2.4** 40.0±3.7 21.4±1.5**

3.4 對小鼠非特異性免疫功能的影響

結(jié)果表明，與對照組小鼠廓清指數(shù)和校正廓清指數(shù)比較，中、高劑量益肺通絡(luò)顆粒組均顯著高于對照組（P＜0.01），低劑量益肺通絡(luò)顆粒組碳粒廓清指數(shù)高于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠非特異性免疫功能的影響（±s，n=12）

表4 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠非特異性免疫功能的影響（±s，n=12）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

）

4 討論

肺結(jié)核，古稱“肺癆”，又稱“癆瘵”、“尸注”、“鬼注”等，肺癆發(fā)病原因主要是人體氣血精津內(nèi)虛，癆蟲乘虛襲人，感受為病。由于癆蟲從口鼻吸入，直接侵蝕肺臟，可出現(xiàn)干咳、咯血等肺系癥狀。本病的發(fā)病部位主要在肺。由于臟腑之間關(guān)系密切，肺病日久可以進(jìn)一步影響到其他臟器，故有“其邪輾轉(zhuǎn)，乘于五臟”之說。其中與脾腎兩臟的關(guān)系最為密切。補(bǔ)虛培元、抗癆殺蟲為治療肺癆的基本原則[6]。補(bǔ)虛，復(fù)其真元，殺蟲，絕其病根。根據(jù)體質(zhì)強(qiáng)弱分別主次，但尤需重視補(bǔ)虛培元，增強(qiáng)正氣，以提高抗病能力[7]。益肺通絡(luò)方含有黃精、白及、太子參、百部、矮地茶、紫花地丁、大薊、天冬、款冬花、鱉甲、絲瓜絡(luò)等11味中藥。黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎；白及收斂止血，消腫生肌；太子參益氣健脾，生津潤肺?，F(xiàn)代藥理研究表明黃精和白及對結(jié)核桿菌有抑菌作用[8-9]，且黃精有增強(qiáng)免疫功能、抗衰老、抗疲勞、耐缺氧作用，尤擅長于治療肺結(jié)核，研究證實(shí)其對結(jié)核桿菌有明顯抑制作用[8]。以上三藥為方中主藥，可彰顯益肺、殺蟲、生新之功。方中百部潤肺止咳、殺蟲，現(xiàn)代研究表明百部含多種生物堿，其中百部堿有較強(qiáng)的抗結(jié)核作用，百部浸出液1∶80濃度10 min可以將結(jié)核桿菌殺死[10]；矮地茶、紫花地丁清熱潤燥、化痰消腫；大薊涼血止血，祛瘀消腫；天冬養(yǎng)陰潤燥化痰；款冬花潤肺化痰止嗽；鱉甲滋陰潛陽，退熱除蒸，軟堅(jiān)散結(jié)；絲瓜絡(luò)之功效有如《本草綱目》所言：“能通人脈絡(luò)臟腑，而去風(fēng)解毒，消腫化痰，祛痛殺蟲，治諸血病可消腫化痰，去痛殺蟲，治諸血病”。上述諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)、去腐殺蟲之功。

臨床研究發(fā)現(xiàn)采用益肺通絡(luò)方聯(lián)合化療方案治療耐多藥肺結(jié)核可以促進(jìn)痰菌陰轉(zhuǎn)及肺部病灶吸收，近期療效有效且安全，優(yōu)于單純化療治療[11-12]。西藥治療肺結(jié)核，多重耐藥菌和藥物的毒副作用已成為治療失敗的主要原因，中藥治療肺癆具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，近年來與抗癆西藥聯(lián)用，能提高療效和減少毒副作用[13]，中西醫(yī)結(jié)合對復(fù)治性、耐藥性肺結(jié)核的臨床研究顯示了中醫(yī)藥顯著優(yōu)勢和很好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益肺通絡(luò)顆粒具有體外抗結(jié)核作用，能縮短小鼠出血時(shí)間、凝血時(shí)間，對氨水引起的小鼠咳嗽有顯著的抑制作用，并且益肺通絡(luò)顆粒能增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能。這可能是其治療耐藥結(jié)核病，改善臨床癥狀的藥理學(xué)基礎(chǔ)。

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（本文編輯 李 杰）

Effects of Yifei Tongluo Granules on Anti-tuberculosis and Relieving Cough and Hemostatic in Vitro

LIU Sha1，PENG Xiaoshan1，DING Huang1，SHI Guomin2，TANG Yinghong1*
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Central Hospital of Changsha,Changsha, Hunan 430100,China）

Objective To study the effects of Yifei Tongluo granules on anti tuberculosis and the effect on relieving cough,hemostatic and non-specific immunological function.Methods Human Mycobacterium tuberculosis H37Rv and clinical isolated Mycobacterium tuberculosis sensitive strain and drug-resistant strains were inoculated in culture medium with different concentrations of Yifei Tongluo granules,separately.Growing states of Mycobacterium tuberculosis were observed.The bleeding time was measured by tail breaking test in mice and the coagulation time was measured by capillary method in mice to observe the hemostasis effect of Yifei Tongluo granules.The antitussive effect was observed by ammonia water induced cough method.The effect on the non-specific immunological function(clearance index and corrected clearance index)was observed by macrophage carbon particle clearance test.Results Mycobacterium tuberculosis were significantly inhibited by Yifei Tongluo granules with high concentration (0.01～0.2 g/mL),and the antibacterial effect was significantly reduced by decreasing concentration of Yifei Tongluo granules.The antibacterial effect is not obvious when the concentration of Yifei Tongluo granules decreased to 0.025 g/mL.Compared with the bleeding time (321.2±34.3)s and the clotting time (135.8±5.1)s in the control group mice,the bleeding time (169.5±23)s and the coagulation time (97.5±3.3)s in high concentration of Yifei Tongluo group mice were significantly decreased (P＜0.01).Compared with the incubation period (36.4±1.9)s of ammonia induced cough and cough frequency(45.9±3.1)in 5 min in the control group mice，the incubation period(54.1±1.4)s of ammonia induced cough was significantly prolonged and the cough frequency(22.7±2.2)in 5min significantly decreased(P＜0.01)in the Yifei Tongluo with high dose group mice.Compared with the control group,the clearance index and the corrected clearance index were significantly improved in Yifei Tongluo group mice(P＜0.01).Conclusion Yifei Tongluo granules have the effects on anti-tuberculosis,relieving cough and hemostasis and enhancing non-specific immunological function in vitro.

Yifei Tongluo granules;anti-tuberculosis effect;relieving cough;hemostatic;carbon particles clearance index;Mycobacterium tuberculosis

R285.5；R521

B

doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2017.04.001

2016-08-09

國家“十二五”科技重大專項(xiàng)子課題3（2013ZX10005004-003）。

劉 莎，女，在讀碩士研究生，研究方向：藥理學(xué)研究。

*唐映紅，女，博士，教授，E-mail：tyhong62@qq.com。

本文引用：劉 莎，彭曉珊，丁 煌，石國民，唐映紅.益肺通絡(luò)顆粒體外抗結(jié)核及止咳止血作用研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（4）：349-352.