羅影，關(guān)永強(qiáng)，賈培松，努爾孜亞·亞力買買提，郝敬喆，賈文捷，魏鵬

(1. 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002)

新疆阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原菌的鑒定

羅影1，關(guān)永強(qiáng)2，賈培松1，努爾孜亞·亞力買買提1，郝敬喆1，賈文捷1，魏鵬1

(1. 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002)

【目的】研究新疆地區(qū)阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病的病原菌。【方法】應(yīng)用菌落特征、致病性測定、16S rDNA序列測定、序列同源性比較，及生理生化反應(yīng)特征，對(duì)阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原菌分離物進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】從阿魏菇子實(shí)體病害樣品中分離到19個(gè)單菌落分離物，并對(duì)該19個(gè)分離物進(jìn)行致病性檢測，其中有8個(gè)分離物在健康阿魏菇子實(shí)體上產(chǎn)生了細(xì)菌性斑點(diǎn)病癥狀，通過16S rDNA序列比對(duì)、序列同源性比較和生理生化反應(yīng)分析，該8個(gè)分離物均為假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。【結(jié)論】新疆地區(qū)阿魏菇細(xì)菌斑點(diǎn)病由假單胞桿菌 (Pseudomonasspp.)引起。

阿魏菇；細(xì)菌性斑點(diǎn)??；形態(tài)學(xué)鑒定；分子生物學(xué)鑒定；假單胞桿菌

0 引 言

【研究意義】阿魏菇(Pleurotus. Eryngii var. ferulae)又名阿魏側(cè)耳、阿魏蘑、西天白靈芝等，具有優(yōu)良的食用和藥用價(jià)值，是新疆地區(qū)特有的一種珍稀食用菌資源[1]。細(xì)菌性斑點(diǎn)病(Bacterial spot disease)又稱細(xì)菌性褐斑病、銹斑病，是一種發(fā)生在菌蓋表面的細(xì)菌性斑點(diǎn)病，主要表現(xiàn)為發(fā)生在菌蓋表面不規(guī)則和褐色斑點(diǎn)，有時(shí)也表現(xiàn)為褐色凹陷斑。其危害性極大，一旦發(fā)生，傳播迅速，很難徹底防治，并且會(huì)逐年加重[2]，給菇農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。主要危害平菇和雙孢蘑菇，在杏鮑菇、香菇、金針菇等食用菌上也有報(bào)道[3]，而關(guān)于阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病的報(bào)道很少。因此，研究阿魏菇細(xì)菌斑點(diǎn)病的發(fā)病原因及病原菌鑒定，對(duì)開發(fā)利用阿魏菇種質(zhì)資源和研發(fā)抗性菌種都具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來隨著新疆阿魏菇栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，褐斑病的發(fā)病率及發(fā)病程度越來越嚴(yán)重，如努爾孜亞等[4]于2011年4～6月在新疆的哈巴河縣、烏魯木齊縣南山板房溝鄉(xiāng)等地的菇棚內(nèi)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在平菇和阿魏菇上都相繼出現(xiàn)了細(xì)菌性斑點(diǎn)性病變，但并沒有理想的防治措施；張瑞穎[2]和金丹[5]采用16s rDNA序列測定及序列同源性比較的方法，均鑒定出了平菇褐斑病病原菌為托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonastolaasii)，表明采用16S rDNA序列分析方法鑒定食用菌致病病原菌的可行性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)新疆地區(qū)阿魏菇細(xì)菌性褐斑病病原菌分類及鑒定的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。研究通過病原菌16S rDNA序列測定以及序列同源性比較，結(jié)合病原菌落特征、菌體形態(tài)觀察和革蘭氏染色反應(yīng)等方法，對(duì)引起新疆地區(qū)阿魏菇細(xì)菌斑點(diǎn)病的病原菌進(jìn)行分類鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究鑒定出的致病病原菌的種屬關(guān)系，為阿魏菇在實(shí)際生產(chǎn)中的病害防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

患病的阿魏菇子實(shí)體分別采自烏魯木齊縣板房溝和阿勒泰地區(qū)青河縣，致病性測定所用健康子實(shí)體購自烏魯木齊市北園春市場。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離純化

采用常規(guī)分離方法進(jìn)行[2]，先用75%酒精對(duì)病菇表面消毒，再用無菌水沖洗2～3次，置于無菌玻璃皿中，于病健交界處取約5 mm2病斑組織3～5塊，同一病斑的病斑組織塊置于同一LB平板中。平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察病菌生長情況，2～3 d后觀察菌落生長情況，并純化保存。

1.2.2 致病性測定

致病性檢測常采用點(diǎn)蝕測試評(píng)估方法(spotting-test)[6]，即將細(xì)菌菌懸液接種到健康蘑菇菌蓋表面，觀察是否形成侵染抑制病斑。以健康的阿魏菇子實(shí)體作為病原菌致病性檢測的供試材料，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16～18 h，取健康阿魏菇子實(shí)體，表面用75%酒精消毒，以霧狀噴灑在阿魏菇子實(shí)體上，以無菌水作對(duì)照試驗(yàn)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，放入鋪有保濕紙的塑料盒內(nèi)，于恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)觀察。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

待測分離物在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取分離物的細(xì)菌總DNA。利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1 492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：引物27F和1 492R各1 μL，Taq酶1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延長1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行純化。

將純化后的產(chǎn)物交由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用DNAstar軟件進(jìn)行拼接，后提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。分別選取與各個(gè)菌株相似性較高的細(xì)菌16S rDNA序列，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA6.0軟件首先進(jìn)行多重序列比對(duì)，再采用Neighbour-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次Bootstrap自舉法檢驗(yàn)[5]。

1.2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

參照東秀珠等[7]編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法進(jìn)行，對(duì)各菌株的生長溫度、接觸酶、氧化酶等生理生化特征進(jìn)行測定，并依照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病子實(shí)體的癥狀

研究表明，細(xì)菌性斑點(diǎn)病在阿魏菇生長的任何時(shí)期都有發(fā)現(xiàn)，且病原菌一般侵染阿魏菇子實(shí)體的表面組織，多為菌蓋被感染。如果在子實(shí)體早期發(fā)育階段感染病原菌，會(huì)導(dǎo)致子實(shí)體發(fā)育緩慢或畸形，甚至停止發(fā)育，子實(shí)體萎蔫死亡。成熟子實(shí)體被侵染后，菌蓋表面病斑或呈點(diǎn)狀或塊狀分布，呈現(xiàn)圓形或近圓形黃褐色凹陷斑；或呈片狀分布，條件適宜時(shí)病斑蔓延至整個(gè)子實(shí)體，且凹陷斑表面會(huì)出現(xiàn)一層粘性菌膿，并迅速腐爛發(fā)出臭味，嚴(yán)重影響阿魏菇的產(chǎn)量。若及時(shí)菇棚內(nèi)控制溫度和濕度，可有效控制患病的范圍和程度，但已產(chǎn)生的病斑不會(huì)消散，影響阿魏菇的品質(zhì)。圖1

圖1 阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病的癥狀
Fig.1 Disease symptoms of thePleurotus. Eryngii var. ferulae

2.2 病原菌的分離純化與致病性檢測

在新疆阿魏菇主栽區(qū)烏魯木齊縣和青河縣共計(jì)采集阿魏菇病樣14個(gè)，分離出19個(gè)單菌落。分別將該19個(gè)分離物回接至健康的阿魏菇子實(shí)體，引起病斑反應(yīng)，即有致病性的分離物有8個(gè)：BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20。人工感染的阿魏菇子實(shí)體，約48 h后出現(xiàn)病斑，72 h后整個(gè)子實(shí)體開始發(fā)臭發(fā)粘，與大田發(fā)病癥狀基本相同，而陰性對(duì)照無明顯反應(yīng)，且從再次接種后發(fā)病子實(shí)體上分離到與接種菌株菌落形態(tài)相同的菌株。表1

表1 菌株來源、菌落形態(tài)及致病性檢測
Table 1 Origin of stains, colony morphologies and pathogenecitiestest

采集病樣Samples純化菌株P(guān)urifiedstrains來源Origin菌落形態(tài)特征Colonymorphologies致病性檢測PathogenecitytestAW-1BD1青河縣淡黃色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-2BD2青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-3BD3青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-4BD4烏魯木齊縣乳白色,不規(guī)則形狀,邊緣不整齊,表面粗糙,無光澤-AW-4BD5烏魯木齊縣乳白色,不規(guī)則形狀,邊緣不整齊,表面粗糙,無光澤-AW-5BD6烏魯木齊縣黃色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-5BD7烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-6BD8烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-7BD10烏魯木齊縣乳白色,不規(guī)則形狀,邊緣不整齊,表面粗糙,無光澤-SF-1BD11烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面粗糙,無光澤-SF-2BD12烏魯木齊縣白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-SF-3BD13烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-11BD14青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-12BD15青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-12BD16青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-13BD17青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-13BD18青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-14BD19青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-14BD20青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+

注："+"有致病性，"-"無致病性

Note: "+" Pathogenicity, "-" No pathogenicity

2.3 分子生物學(xué)鑒定

提取8個(gè)分離物的全基因組DNA，用16S rDNA基因通用引物27F/1492R擴(kuò)增8個(gè)分離物的基因組DNA，電泳檢測其分子量均約為1 500 bp，其分子量大小與理論值相符。基因測序后，分別將8個(gè)分離物的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，研究表明，與這8個(gè)分離物同源性高達(dá)99%的均屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)。 圖2

選擇這些種屬關(guān)系較明確的菌株，并從LPSN(www.bacterio.net/bacillus.html)上下載該菌的模式菌株的16S rDNA序列，與8個(gè)分離物的16S rDNA序列一起，用Mega6.0中Neighbor-joining 法進(jìn)行1 000次Bootstrap自舉法檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。8個(gè)分離物BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20可確定為Pseudomonassp.；且BD3和BD20、BD14和BD19的進(jìn)化距離很小，且自舉值>50%，這說明它們可能為同一種菌或親緣關(guān)系較近。 圖3

圖2 8個(gè)分離物的16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA of 8 pathogenic bacteria

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence表2 8個(gè)分離物的生理生化特征
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 10 pathogenic bacteria

項(xiàng)目Items菌株 StrainsBD2BD3BD13BD14BD15BD18BD19BD20革蘭氏染色(Gramstain)--------乙醇產(chǎn)酸(Useofethanoltoaceticacid)--------D-甘露醇產(chǎn)酸(UseofD-mannitoltoacid)--------反硝化(Denitrification)--------氧化酶(Oxidase)++++++++接觸酶(Hydrogenperoxidase)++++++++硝酸鹽還原(Nitratereduction)++++++++甲基紅測定(Methylredtest)--------V-P測定(Voges-Proskauer)--------吲哚(Indole)--------明膠液化(Gelatinliquefaction)++++++++丙二酸利用(Useofmalonate)++++++++淀粉水解(Starchhydrolysis)--------賴氨酸脫羧酶(Lysinedecarboxylase)--------鳥氨酸脫羧酶(Ornithinedecarboxylase)--------苯丙氨酸脫氨酶(Phenylalaninedeamination)--------精氨酸雙水解酶(Argininedihydrolase)++++++++生長:4℃(4℃tolerance)++++++++41℃(41℃tolerance)----++--60℃(60℃tolerance)--------

注：“+/-”分別表示生理生化反應(yīng)的陽性和陰性

Note: "+/-" indicates positive and negative of these physiological and biochemical tests, respectively

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

研究表明，8個(gè)分離物均為革蘭氏陰性菌，均不能在60℃下生長，不能氧化乙醇和甘露醇產(chǎn)酸，不能進(jìn)行反硝化作用，能夠產(chǎn)生氧化酶和接觸酶，能夠還原硝酸鹽，甲基紅和V-P測定皆為陰性，不產(chǎn)生吲哚等特征，均符合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[7]中好氧革蘭氏陰性桿菌檢索表中對(duì)假單胞菌屬的檢索。表2

3 討 論

彭煒等報(bào)道侵染性細(xì)菌病害的病原菌主要為假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和歐文氏菌屬(Erwinia)，而侵染性細(xì)菌病害主要為細(xì)菌性褐斑病[9]?；亟硬≡陌⑽汗阶訉?shí)體，初期為小的黃褐色的斑點(diǎn)，逐步發(fā)展成為大片黃褐色斑塊，最后整個(gè)菇體腐爛變質(zhì)。其菌落形態(tài)大多為米白色，圓形，邊緣整齊，光滑，飽滿，有光澤。經(jīng)檢測8株菌均為革蘭氏陰性菌，氧化酶和接觸酶反應(yīng)均呈陽性甲基紅和V-P反應(yīng)呈陰性。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色法與16S rDNA序列測定以及序列同源性比較得出致病菌菌株BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20均屬于假單胞桿菌屬 (Pseudomonas )，但無法確定具體種。據(jù)調(diào)查，未見有新疆地區(qū)阿魏菇致病性病原菌的分析鑒定的相關(guān)報(bào)道，研究首次確定出新疆地區(qū)阿魏菇致病性病原菌為假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。

根據(jù)1993年P(guān)alleroni對(duì)假單胞菌屬的分類[10]，假單胞菌屬包括20個(gè)種59個(gè)致病變種，而事實(shí)上該屬成員眾多，是一個(gè)異質(zhì)性很強(qiáng)的屬。研究得出8株致病病原菌均屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，而可能為不同種。針對(duì)阿魏菇致病性病原菌分類，開展更深層次的研究，獲得更為詳細(xì)的分類標(biāo)準(zhǔn)，為阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病的科學(xué)防治提供依據(jù)，將是該領(lǐng)域未來研究的重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

從新疆阿魏菇主栽區(qū)烏魯木齊縣和青河縣采集阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病病菇，分離到細(xì)菌性分離物，經(jīng)致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定包括其各類生理生化反應(yīng)和分子生物學(xué)輔助(16S rDNA序列比對(duì)和同源性比較)鑒定出病原菌為假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。病原菌的確定為阿魏菇在實(shí)際生產(chǎn)中的病害防控提供了理論依據(jù)。

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Supported by: China Agriculture Research System Program (No.CARS24)；Open Fund of Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Desert Oasis "The investigation and identification of bacterial spot disease and pathogen on Pleurotus ferulae in Xinjiang" (No.KFJJ20150105)

WEI Peng(1961-), male, Edible fungi cultivation research

Identification of Pathogens Causing Bacterial Spot Disease onPleurotusFerulae (Pleurotus. Eryngii var. ferulae) in Xinjiang

LUO Ying1，GUAN Yong-qiang2，JIA Pei-song1，Nerziya Yalimaimaiti1， HAO Jing-zhe1，JIA Wen-jie1，WEI Peng1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.XinjiangResearchInstitutesofTraditionalChineseMateriaMedicaandEthnodrug,Urumqi830002,China)

【Objective】 The objective of this study is to identify the pathogens that cause bacterial spot disease ofPleurotusferulae in Xinjiang. 【Method】The causal agents were identified by colony characterization, pathogenicity test, 16S rDNA sequence analyses, sequence homology comparison, and biochemical characterization tests. 【Result】Nineteen bacterial isolates were isolated from diseased samples ofPleurotusferulae. Through pathogenicity test, eight tested isolates caused typical symptoms of bacterial spot disease on the healthy fruiting bodies ofPleurotusferulae. Based on pathogenicity test, and combined with the results of 16S rDNA sequence analyses, sequence homology comparison, biochemical and molecular characterization, eight isolates were identified asPseudomonasspp. 【Conclusion】The bacterial spot disease onPleurotusferulae in Xinjiang is incited byPseudomonasspp.

Pleurotus. eryngii var. ferulae; bacterial spot disease; morphological identification; molecular biological identification;Pseudomonas

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.03.016

2016-11-24

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS24)；農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金“新疆阿魏菇細(xì)菌性斑點(diǎn)病的調(diào)查與病原菌鑒定研究”(KFJJ20150105)

羅影(1988-)，女，碩士研究生，助理研究員，研究方向?yàn)槭秤镁N，(E-mail)ly19880219@126.com

魏鵬(1961-)，男，新疆人，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)槭秤镁耘啵?E-mail)xjzbswp@126.com

S435.673

A

1001-4330(2017)03-0513-07