沈留紅，巫曉峰，肖勁邦，姜思汛，鄧俊良，左之才，傅宏慶，曹隨忠，余樹民，*，張有瑞

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，奶牛疾病研究中心， 四川 成都 611130； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 3.河北省廊坊市農(nóng)業(yè)局水產(chǎn)站，河北 廊坊 065000)

回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量變化

沈留紅1，巫曉峰1，肖勁邦1，姜思汛1，鄧俊良1，左之才1，傅宏慶2，曹隨忠1，余樹民1，*，張有瑞3

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，奶牛疾病研究中心， 四川 成都 611130； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 3.河北省廊坊市農(nóng)業(yè)局水產(chǎn)站，河北 廊坊 065000)

為探究回乳期奶牛血清中生長激素(GH)、胰島素(INS)、氫化可的松(HC)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)含量的變化及其相關(guān)性。試驗選擇規(guī)?；膛鋈债a(chǎn)奶量為(15.43 ± 2.10) kg，即將干乳的妊娠后期健康中國荷斯坦奶牛20頭。干乳開始當天記為第0天，分別采集第0、1、3、5、7、9和11天奶牛尾靜脈血，ELISA法檢測血清中GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量并對結(jié)果進行統(tǒng)計學處理，分析其在奶?；厝檫^程中的變化規(guī)律及其相關(guān)性。結(jié)果顯示，回乳期奶牛血清GH、INS、HC和TGF-β1含量在第0至1天變化不顯著(P>0.05)；血清GH和HC含量第3至11天依次降低且差異均極顯著(P<0.01)，其中血清HC含量第3天極顯著高于其余各天(P<0.01)；血清INS含量第3至11天依次升高且差異均極顯著(P<0.01)；血清TGF-β1含量第3至11天差異性均不顯著(P>0.05)；血清IGF-1含量依次呈階梯式下降趨勢，第0天和第1天、第3天和第5天、第7天和第9天、第9天和第11天之間均差異不顯著(P>0.05)，但第0至1天、第3至5天、第7至11天3階段之間差異極顯著(P<0.01)?；厝槠谀膛Ｑ錑H、INS、TGF-β1和IGF-1含量變化兩兩間呈極顯著相關(guān)(P<0.01)；HC含量變化與GH、INS和IGF-1含量變化均呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與TGF-β1含量變化呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

回乳期奶牛；生長激素；胰島素；氫化可的松；轉(zhuǎn)化生長因子β1；胰島素樣生長因子1

激素在哺乳動物生長發(fā)育過程中具有不可替代的調(diào)控作用，其中直接調(diào)控乳腺發(fā)育和泌乳的激素主要有生長激素(growth hormone，GH)、胰島素(insulin，INS)、氫化可的松(hydrocortisone，HC)、催乳素(prolactin， PRL)、雌激素(estrogen， E)和孕酮(progesterone，P4)等[1-2]，它們通過與轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transduction and transcriptional activation factor of 5，STAT5)等[3]細胞因子相互作用而形成乳腺發(fā)育和泌乳的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。泌乳相關(guān)激素對人、小鼠、奶牛等動物泌乳期的影響已有研究，并顯示均與泌乳量呈一定的相關(guān)性[4-6]。由于奶牛經(jīng)過泌乳期，消耗大量能量和營養(yǎng)物質(zhì)，在妊娠后期，為保證胎犢宮內(nèi)生長發(fā)育及分娩后再次泌乳做充分準備，奶牛需要經(jīng)過一段時間的回乳期后進入干乳期，使乳房更新乳腺組織，另外，不適當?shù)幕厝榉椒〞黾痈扇槠诩胺置浜竽膛Ｈ榉垦椎陌l(fā)生率，而目前關(guān)于回乳期奶牛泌乳相關(guān)激素和因子的變化規(guī)律及其相關(guān)性研究尚未見報道。因此，本試驗旨在探究回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量變化規(guī)律及其相關(guān)性，以進一步研究回乳期奶牛相關(guān)泌乳激素的調(diào)控機理，以及為尋求更安全有效的回乳技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗選擇四川省某規(guī)?；膛霭敕忾]統(tǒng)一舍飼，體質(zhì)量(582±41)kg、2～4胎中國荷斯坦奶牛51頭。從中選擇體況良好，臨床檢查健康，乳房、乳汁均正常，即將進入回乳期，產(chǎn)奶量為(15.43±2.10)kg的妊娠后期奶牛20頭。

1.1.2 試驗試劑

牛GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒，均由美國RD公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 回乳方式

采用逐漸干奶法[7-8]，方法：停喂多汁飼料，減少精料喂量，以青干草為主，控制飲水，適當加強運動。在回乳第1天，擠奶次數(shù)由3次改為2次，第2天改為1次，逐漸減少擠奶次數(shù)，當奶牛日產(chǎn)奶量為3～4 kg時，停止擠奶。

1.2.2 血清收集

奶牛回乳開始當天記為第0天，依次采集第0、1、3、5、7、9和11天尾靜脈血10 mL，置于未加抗凝劑的離心管中，室溫下靜置1 h，離心力352g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血清于EP管中，-20 ℃凍存，待檢。

1.2.3 ELISA檢測

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)測定牛GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量，步驟嚴格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，K-S檢驗計量資料是否服從正態(tài)分布，以平均數(shù)±標準差(Mean ± SD)表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用雙變量Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量

由表1可知，回乳期血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量在第0至1天變化均不顯著(P>0.05)；血清GH和HC含量第3至11天依次降低且差異均極顯著(P<0.01)，其中血清HC含量第3天極顯著高于其余各天(P<0.01)；血清INS含量第3至11天依次升高且差異均極顯著(P<0.01)；血清TGF-β1含量第3至11天差異性均不顯著(P>0.05)；血清IGF-1含量依次呈階梯式下降趨勢，但第0天和第1天、第3天和第5天、第7天和第9天、第9天和第11天之間差異均不顯著(P>0.05)，而第0至1天、第3至5天、第7至11天3個階段之間差異極顯著(P<0.01)。

2.2 回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1的相關(guān)性

由表2可知，回乳期奶牛血清GH、INS、TGF-β1和IGF-1含量變化兩兩間呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，其中血清GH與HC和IGF-1、INS與TGF-β1極顯著正相關(guān)(P<0.01)，血清GH與INS和TGF-β1、INS與HC和IGF-1、TGF-β1與IGF-1極顯著負相關(guān)(P<0.01)，血清HC與TGF-β1顯著負相關(guān)(P<0.05)。

表1 回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量

Table 1 Levels of GH， INS， HC， TGF-β1 and IGF-1 in cows’ serum during milk withdrawal period

時間Time指標Index(n=20)GH/(ng·mL-1)INS/(nIU·mL-1)HC/(ng·mL-1)TGF-β1/(ng·mL-1)IGF-1/(ng·mL-1)第0天0thday360.90±11.61Aa421.76±33.53F958.90±40.92B184.20±12.38B56.04±3.81A第1天1stday349.96±16.33Aa430.35±26.56F946.20±54.49B183.72±9.68B54.88±3.93A第3天3rdday328.12±11.57Ab482.43±11.67E1181.77±67.44A236.38±14.34A49.03±1.53B第5天5thday287.75±14.07B535.81±18.20D855.35±46.27C231.87±10.44A46.78±1.70B第7天7thday247.75±15.45C593.19±21.36C752.94±26.60D243.56±23.85A43.25±2.59Ca第9天9thday210.74±15.50D638.95±20.62B689.82±27.15E229.95±15.66A42.20±2.76Cab第11天11thday177.14±12.89E702.92±27.26A556.67±25.27F237.68±15.00A38.20±1.08Cb

同列數(shù)據(jù)后無相同大、小寫字母的分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)與顯著(P<0.05)。

Data followed by no same uppercase or lowercase letters within the same column indicated significant difference atP<0.01 andP<0.05， respectively.

表2 回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1的相關(guān)性

Table 2 Correlation between levels of GH， INS， HC， TGF-β1 and IGF-1 in cows’ serum during milk withdrawal period

指標IndexGHr值rvalueP值PvalueINSr值rvalueP值PvalueHCr值rvalueP值PvalueTGF-β1r值rvalueP值PvalueIGF-1r值rvalueP值PvalueGH——-0.956**<0.0010.824**<0.001-0.606**<0.0010.901**<0.001INS——-0.812**<0.0010.634**<0.001-0.885**<0.001HC——-0.296*0.0390.893**<0.001TGF-β1——-0.706**<0.001IGF-1——

r，相關(guān)系數(shù)；*與**分別代表相關(guān)性顯著(P<0.05)與極顯著(P<0.01)。

r， Correlation coefficient; * and ** indicated statistically significant correlation atP<0.05 andP<0.01， respectively.

3 討論

3.1 回乳期奶牛血清GH含量的變化

GH是一種由腦垂體分泌的單一肽鏈蛋白質(zhì)激素，具有促進生長發(fā)育、調(diào)控泌乳等作用[9-10]。運用牛生長素可調(diào)節(jié)奶牛機體物質(zhì)代謝，提高飼料轉(zhuǎn)化率，增加產(chǎn)奶量[11-12]。Macrina[13]研究表明，GH可提高奶?？傃髁坎⒃黾痈闻K丙酸異生成糖的能力，降低總氧化量，提高乳腺血流量，促使奶牛動用機體儲存物質(zhì)，增加葡萄糖利用率。對早期泌乳奶牛注射GH可提高乳房利用營養(yǎng)物質(zhì)合成牛奶的效率，增加產(chǎn)奶量。Hadi等[14]和Kawashima等[15]均發(fā)現(xiàn)，奶牛GH受體和IGF-1表達量越高，產(chǎn)奶量越高，主要通過JAK2/STAT5信號通路、IGF-1和GH受體等增加乳腺血流量，降低外周組織對INS的應答，使營養(yǎng)成分向乳腺聚集，促進乳腺泌乳[16]。本研究結(jié)果顯示，在奶?；厝檫^程中，GH含量呈下降趨勢，可能是減少了擠奶刺激，乳房GH受體表達受到抑制，進而反饋性的抑制垂體分泌GH，也可能是由于懷孕末期，為滿足胎犢宮內(nèi)快速發(fā)育需求導致。

3.2 回乳期奶牛血清INS含量的變化

INS具有加強糖原合成、維持血糖恒定并調(diào)控泌乳等作用[17]。其可激活胰島素亞基受體I(IRS-I)，通過配體約束力和自動磷酸化的誘導，促使INS受體蛋白位點生成，從而調(diào)控乳腺上皮細胞乳糖、乳脂的生物合成[18]。但INS對反芻動物乳腺發(fā)育的作用仍存在爭議，佟慧麗等[19]使用INS處理奶山羊乳腺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)細胞活力無明顯變化。陳建暉等[20]使用INS對奶牛乳腺上皮細胞進行類似處理后細胞活力下降。田青等[21]表示INS對奶牛泌乳細胞生長及分化均有促進作用。本研究結(jié)果顯示，在奶牛回乳過程中，血清INS含量在第0至1天變化不顯著(P>0.05)，在第3至11天依次升高且差異均極顯著(P<0.01)，可能由于回乳期間GH含量降低，減少其對INS的抑制作用，并且由于懷孕后期宮內(nèi)胎犢發(fā)育需要大量糖脂沉積，共同促進機體釋放INS。

3.3 回乳期奶牛血清HC含量的變化

HC是哺乳動物腎上腺皮質(zhì)分泌的主要糖皮質(zhì)激素之一，近年來，關(guān)于HC對提高奶牛泌乳量及改善乳品質(zhì)逐漸成為研究熱點。HC主要通過結(jié)合乳腺細胞胞內(nèi)核受體，啟動并調(diào)控泌乳相關(guān)基因表達和乳蛋白合成等相關(guān)基因組機制來實現(xiàn)其生理和藥理功能[22-23]。Kabotanski等[24]發(fā)現(xiàn)，HC能夠增強PRL對酪蛋白mRNAs累積，進而對奶牛乳腺上皮細胞增殖起重要調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，在奶牛回乳過程中，血清HC含量在第0至1天差異性不顯著(P>0.05)，第3天極顯著高于其余各天(P<0.01)，可能是由于奶牛飼糧成分和飼養(yǎng)環(huán)境等改變造成的應激使HC含量升高。第3至11天依次降低且差異均極顯著(P<0.01)，推測在奶?；厝檫^程中，PRL表達量下降[25]，促使乳腺減少其泌乳細胞胞內(nèi)核受體表達量，反饋抑制腎上腺皮質(zhì)分泌HC，降低產(chǎn)奶量，也從正面表明了HC在奶?；厝橹械闹匾饔谩?/p>

3.4 回乳期奶牛血清TGF-β1含量的變化

TGF-β1是一種多效的細胞因子，可影響上皮細胞增殖、凋亡并維持細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，對于乳腺形態(tài)發(fā)生及分泌功能有重要作用。已有研究表明，TGF-β1可誘導乳腺上皮干細胞群衰老，抑制乳腺發(fā)育[26]，并與乳腺泌乳的終止信號密切相關(guān)[27]。另外，TGF-β1可減少乳腺上皮細胞由PRL誘導的β-酪蛋白mRNA和蛋白表達水平，且對蛋白水平的抑制更明顯[28]，說明，TGF-β1在牛乳腺退化過程中對抑制細胞生長起重要調(diào)控作用[29]，Vries等[30]指出TGF-β1在奶牛回乳后1周內(nèi)達到最高，本研究發(fā)現(xiàn)，在奶?；厝檫^程中，血清TGF-β1含量在第0至1天變化均不顯著(P>0.05)，第0至1天極顯著低于第3至11天，且第3至11天差異性均不顯著(P>0.05)，與上述研究結(jié)果趨勢一致，可能是由于奶牛GH降低，增強TGF-β1前體相關(guān)肽活性[31]，促進乳腺中TGF-β1的表達，減少β-酪蛋白mRNA和蛋白水平，降低奶牛泌乳量。

3.5 回乳期奶牛血清IGF-1含量的變化

IGF-1是一類功能復雜的多肽因子，可促進乳腺泌乳，特別是介導GH的催乳作用[3]。研究表明，乳腺組織中存在IGF-1及其受體，對早期泌乳奶牛注射GH，增加了IGF-1及其受體表達量[13]。另外，IGF-1可直接通過其受體作用于乳腺，對乳腺最終分化完全、發(fā)育成熟、乳汁生成以及新生兒的生長發(fā)育有調(diào)控作用[32]，Murney等[33]和Hernndez等[34]也均表示IGF-1與奶牛產(chǎn)奶量相關(guān)性顯著。本研究指出，在奶?；厝檫^程中，血清IGF-1含量依次呈階梯式下降，而第0天和第1天、第3天和第5天、第7天和第9天、第9天和第11天之間差異均不顯著(P>0.05)，但第0至1天、第3至5天、第7至11天三階段之間差異極顯著(P<0.01)，與上述結(jié)果趨勢一致，可能是由于GH降低，其與IGF-1結(jié)合減少，反饋抑制乳腺泌乳細胞泌乳。表明奶牛IGF-1不僅在奶牛青春期乳腺生長和泌乳期起正向調(diào)控，且在奶?；厝槠诳赏ㄟ^降低IGF-1含量的方法，促進奶?；厝?。

3.6 回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1間的相關(guān)性

神經(jīng)內(nèi)分泌的多種激素與乳腺外組織及乳腺分泌的多種生長因子相互協(xié)同，以內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌等方式共同調(diào)節(jié)乳腺的生長發(fā)育和泌乳[2]。Rhoads等[12]研究表明，泌乳主要受GH調(diào)控，其主要通過IGF-1介導發(fā)揮泌乳作用[3]，且在注射GH后，可提高奶牛產(chǎn)奶量[13]。本研究中，奶?；厝槠贕H含量與IGF-1含量均降低，且呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，表明在奶牛回乳過程中，IGF-1和GH相互影響，協(xié)同調(diào)控奶牛泌乳，降低產(chǎn)奶量。另有研究資料表明，HC通過促進GH對葡萄糖的攝取方式，增加泌乳量[35]，但INS與GH在泌乳過程中存在拮抗作用，當血清INS含量較高時，INS競爭性抑制GH表達，并調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運至非乳腺組織，使乳腺對葡萄糖攝取不敏感，而血清INS含量較低時，GH呈高表達，共同調(diào)節(jié)乳腺與乳腺外組織的營養(yǎng)競爭，使營養(yǎng)向乳腺轉(zhuǎn)移，促進乳腺發(fā)育和乳的合成[36]。本研究顯示，奶?；厝槠?，GH與HC呈極顯著正相關(guān)，而與INS呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，表明奶?；厝闀r，GH、HC均降低，而INS與GH仍存在明顯拮抗。有研究指出，在乳腺退化過程中，TGF-β1在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達均增加[37]，抑制GH受體、IGF-1表達，減少HC活性[38]，在INS促使機體營養(yǎng)物質(zhì)不向乳腺聚集的基礎(chǔ)上，誘導乳腺導管快速退化[37]。本研究結(jié)果顯示，在奶牛回乳過程中，TGF-β1含量與GH、IGF-1含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與HC含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與INS含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，表明在奶牛回乳期，GH、HC和IGF-1是奶牛回乳的負調(diào)控因子，而INS和TGF-β1是奶牛回乳的正調(diào)控因子。

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(責任編輯 盧福莊)

Changes of GH， INS， HC， TGF-β1 and IGF-1 levels in cows’ serum during milk withdrawal period

SHEN Liuhong1， WU Xiaofeng1， XIAO Jinbang1， JIANG Sixun1， DENG Junliang1， ZUO Zhicai1， FU Hongqing2， CAO Suizhong1， YU Shumin1，*， ZHANG Yourui3

(1.TheKeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，TheMedicalResearchCenterforCowDisease，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou225300，China; 3.AgriculturalBureauofLangfangCity，Langfang065000，China)

In order to explore the changes and correlation among the levels of growth hormone (GH)， insulin (INS)， hydrocortisone (HC)， TGF-β1 and IGF-1 in cows’ serum during the period of milk withdrawal. Twenty healthy Chinese Holstein cows in late pregnancy that gave (15.43±2.10) kg milk per day were used， which were ready to dry milk. The day when cows began to dry milk was recorded as the 0 d. The cows’ venous blood from the tail on the day 0， 1， 3， 5， 7， 9 and 11 were collected. ELISA was used to evaluate the levels of GH， INS， HC， TGF-β1 and IGF-1 in serum to analyze the changes and correlation among them. The results showed that， during the period of milk withdrawal， the changes of GH， INS， HC and TGF-β1 levels in serum were not obvious from the day 0 to the day 1 (P>0.05). The levels of GH and HC in serum were both on the decline and had significant difference from the day 3 to the day 11 (P<0.01)， and the levels of GH in serum on the day 3 was significantly higher than those on the other days (P<0.01). The levels of INS in serum was on the rise and had significant (P<0.01) difference from the day 3 to the day 11， while the levels of TGF-β1 in serum had no significant (P>0.05) difference from the day 3 to the day 11. The levels of IGF-1 in serum showed downward trend in ladder type， and the difference among levels of IGF-1 in serum on the day 0 and day 1， day 3 and day 5， day 7 and day 9， day 9 and day 11 were not obvious (P>0.05)， while IGF-1 levels among 0-1 d， 3-5 d and 7-11 d had significant (P<0.01) difference. There was significant (P<0.01) correlation among the levels of GH， INS， TGF-β1 and IGF-1 in cows’ serum separately during the period of milk withdrawal. The HC levels showed significant (P<0.01) correlation with GH， INS and IGF-1 levels， while it showed significant (P<0.05) negative correlation with TGF-β1 levels.

cows in milk withdrawal period; GH; INS; HC; TGF-β1; IGF-1

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.05

2016-11-01

四川省教育廳重點項目(15ZA0024)；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新項目(NSF201604)；四川農(nóng)業(yè)大學雙支計劃項目

沈留紅(1979—)，男，江蘇如皋人，副教授，博士研究生，從事反芻動物疾病及繁殖新技術(shù)研究，E-mail:shenlh@sicau.edu.cn

*通信作者，余樹民，E-mail:yayushumin@163.com

S857.2;[S811.2]

A

1004-1524(2017)04-0548-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 548-554

沈留紅，巫曉峰，肖勁邦，等. 回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量變化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報， 2017， 29(4): 548-554.