張偉豪++劉易++王小晴++方萍++宋慧云++王軍++單體江

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取糖膠樹(shù)花揮發(fā)油，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，采用薄層層析——生物自顯影法測(cè)定糖膠樹(shù)花乙酸乙酯層提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性。結(jié)果表明，糖膠樹(shù)花揮發(fā)油得率為0.018%，通過(guò)GC-MS分析，從中鑒定出20個(gè)成分，占揮發(fā)油總量的97.53%，其主要成分為2-莰烯（23.30%），芳樟醇（23.09%），（-）-4-萜品醇（10.54%）。糖膠樹(shù)花乙酸乙酯層提取物對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其次為黃瓜角斑病菌，對(duì)其他供試細(xì)菌未表現(xiàn)出抑制活性。

關(guān)鍵詞 糖膠樹(shù) ；揮發(fā)油 ；次生代謝產(chǎn)物 ；抗細(xì)菌活性

中圖分類號(hào) S476 ；R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.021

Chemical Analysis and Antibacterial Activity of the

Extract from Alstonia scholaris

ZHANG Weihao LIU Yi WANG Xiaoqing

FANG Ping SONG Huiyun WANG Jun SHAN Tijiang

（Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest

Plant Germplasm， College of Forestry and Landscape Architecture，

South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract The volatile oil from the flowers of Alstonia scholaris was extracted by hydro-distillation， and its chemical components were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The antibacterial activity of the ethyl acetate extract against bacteria was analyzed by thin layer chromatography bio-autography method. The results showed that the flowers of A. scholaris was extracted to yield 0.018% of volatile oil. The GC-MS analysis showed that 20 components were identified from the volatile oil of the flowers and accounted for 97.53% of total volatile substance. The major components of the volatile oil included 1，7，7-trimethylbicyclo[2.2.1] hept-2-ene （23.30%）， 3，7-Dimethyl-1，6- octadien-3-ol （23.09%） and （-）-4-Terpineol （10.54%）. The ethyl acetate extracts showed certain antibacterial activity against Escherichia coli and Pseudomonas lachrymans， but not against the other bacteria under test.

Keywords Alstonia scholaris ； volatile oil ； chemical component ； antibacterial activity

糖膠樹(shù)[Alstonia scholaris R. Br.]，又稱燈架樹(shù)、面條樹(shù)，屬于夾竹桃科雞骨常山屬，主要分布在廣西南部、西部和云南南部，廣東、湖南和臺(tái)灣等地[1]。糖膠樹(shù)的根、樹(shù)皮、葉均可入藥。在印度，用其樹(shù)皮、葉及乳汁來(lái)治療瘧疾和發(fā)汗[2]；在我國(guó)民間，則用其樹(shù)皮來(lái)治頭痛、傷風(fēng)、痧氣、肺炎、百日咳等，外用可治外傷止血、接骨、消腫、瘡節(jié)以及殺蟲(chóng)劑的配制等[3-4]。糖膠樹(shù)喜濕潤(rùn)肥沃土壤，在水邊生長(zhǎng)良好，是次生闊葉林主要樹(shù)種，因其樹(shù)形優(yōu)美，常作為行道樹(shù)等觀賞用樹(shù)[1，5]。隨著糖膠樹(shù)的廣泛種植，其花期濃烈的氣味也引起人們的廣泛關(guān)注。植物精油又稱揮發(fā)油，屬于植物次生代謝產(chǎn)物，具有廣譜抑菌殺菌活性和消炎功能，能使人適度興奮、減緩疲勞產(chǎn)生松弛感等[6-9]，植物精油可作為協(xié)同增強(qiáng)劑，與標(biāo)準(zhǔn)藥物聯(lián)合使用時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)于個(gè)體效應(yīng)的聯(lián)合效應(yīng)，并產(chǎn)生增強(qiáng)的抗菌活性[10-11]。目前，關(guān)于糖膠樹(shù)花揮發(fā)油的研究較少，且尚未見(jiàn)糖膠樹(shù)花次生代謝產(chǎn)物抗菌活性的報(bào)道。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取糖膠樹(shù)花揮發(fā)油，并通過(guò)GC-MS分析測(cè)定其化學(xué)組成。同時(shí)采用甲醇冷浸提取和乙酸乙酯萃取得到糖膠樹(shù)花提取物，通過(guò)薄層層析-生物自顯影法（TLC-MTT-生物自顯影法）測(cè)定乙酸乙酯層提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑菌活性，為闡明糖膠樹(shù)花揮發(fā)油的化學(xué)組成以及糖膠樹(shù)的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

糖膠樹(shù)花于2015年11月21日采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。

供試細(xì)菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+），溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+），根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens，G-），大腸桿菌（Escherichia coli，G-），黃瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans，G-），桉樹(shù)青枯菌（Ralstonia solanacearum，G-），番茄瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria，G-）。以上菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；水蒸氣蒸餾裝置（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；硫酸鏈霉素（美國(guó)Sigma公司，99%）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；C8-C40系列正構(gòu)烷烴（美國(guó)Sigma公司）；氯化鈉、無(wú)水乙醚、無(wú)水硫酸鈉、二氯甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純（北京化學(xué)試劑公司）。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取及GC-MS分析

參照Lou等[12]和劉易等[13]的方法提取揮發(fā)油。采集糖膠樹(shù)花（1 123 g），稱重后裝入水蒸氣蒸餾裝置內(nèi)，加入適量蒸餾水，待溫度升至180℃后連續(xù)蒸餾6 h，收集回流所得的揮發(fā)油，加入一定量的氯化鈉，用無(wú)水乙醚萃取3次，合并萃取液，加入無(wú)水硫酸鈉干燥處理，讓無(wú)水乙醚自然揮發(fā)，4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

糖膠樹(shù)花揮發(fā)油化學(xué)組分的鑒定在6890N-5975C GC-MS（Agilent Technologie，USA）上進(jìn)行，毛細(xì)管色譜柱為DB-5（30 m × 250 μm × 0.25 μm），無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230℃，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序：起始溫度70℃，保持1 min；然后8℃/min上升到120℃，保持1 min；以30℃/min上升到150℃，保持1 min；再以5℃/min上升到175℃，保持0 min；然后以1℃/min上升到180℃，保持0 min；最后5℃/min上升到240℃，保持0 min。離子源溫度230℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL/min，全掃描采集，質(zhì)譜檢測(cè)器（MSD）檢測(cè)。通過(guò)與NIST（2011）中標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖作對(duì)比，確定待測(cè)成分。

1.2.2 糖膠樹(shù)花乙酸乙酯層提取物抗菌活性測(cè)定

將采集的糖膠樹(shù)花剪碎，裝入三角瓶，加入適量甲醇，冷浸提取3次，每次7 d。過(guò)濾后濃縮提取液，水混懸后用乙酸乙酯萃取3次，濃縮萃取液，得到乙酸乙酯層提取物，4℃保存，備用。

采用TLC-MTT-生物自顯影法測(cè)定其抗細(xì)菌活性[14-16]。將提取物用乙酸乙酯溶解，用直徑為0.5 mm的毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5 μL，點(diǎn)樣點(diǎn)越小越好。采用石油醚和丙酮的4∶1（V/V）的混合液為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析，薄層層析后，在薄層板的一側(cè)原點(diǎn)處點(diǎn)5 μL濃度為0. 2 mg/mL 的硫酸鏈霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，備用。向滅菌的LB半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.5%）中加入一定量準(zhǔn)備好的菌液（45 mL LB+5 mL菌液），將其濃度調(diào)至約108 CFU/mL，振蕩均勻。用噴樣器將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的硅膠板上；待培養(yǎng)基在硅膠板上冷卻后，將硅膠板置于培養(yǎng)皿中于4℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的擴(kuò)散；而后將培養(yǎng)皿置于28℃下保溫培養(yǎng)，12 h后取出硅膠板，在其上均勻噴灑噻唑藍(lán)（MTT），約10 min后即可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有抗菌活性成分處，供試菌由于受到抑菌成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無(wú)抗菌活性成分處，供試菌正常生長(zhǎng)，通過(guò)MTT顯色后出現(xiàn)背景色藍(lán)色。通過(guò)抗菌斑點(diǎn)的遷移率（即Rf值）來(lái)初步評(píng)價(jià)樣品中抗菌化合物的數(shù)量和極性，根據(jù)抗菌斑點(diǎn)的大小來(lái)初步評(píng)價(jià)化合物的活性和含量。Rf值計(jì)算公式如下：

Rf值=■

2 結(jié)果與分析

2.1 糖膠樹(shù)花揮發(fā)油GC-MS分析

通過(guò)水蒸氣蒸餾法，糖膠樹(shù)花揮發(fā)油的得率為0.018%（以鮮重為基礎(chǔ)）。糖膠樹(shù)花揮發(fā)油總離子流色譜圖如圖1。

采用峰面積歸一化法計(jì)算出各組分的相對(duì)百分含量，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)GC-MS分析，從糖膠樹(shù)花揮發(fā)油中共鑒定出21個(gè)成分，占揮發(fā)油總量的97.53%。主要成分是2-莰烯（23.30%），芳樟醇（23.09%），（-）-4-萜品醇（10.54%），α-甲基-α-（4-甲基-3-戊烯基）-環(huán)氧乙烷甲醇（9.19%），鐵銹羅漢柏醇（5.68%），其余成分相對(duì)含量均在5%以下。得到的揮發(fā)油化合物主要為醇類（57.53%）和烴類（28.51%），其相對(duì)含量見(jiàn)圖2，說(shuō)明糖膠樹(shù)花揮發(fā)油中含有種類豐富的化合物。

2.2 糖膠樹(shù)花乙酸乙酯層提取物的抗菌活性結(jié)果

采用TLC-MTT-生物自顯影法測(cè)定了糖膠樹(shù)花乙酸乙酯提取物對(duì)6種供試細(xì)菌的抑制活性，陽(yáng)性對(duì)照為硫酸鏈霉素，結(jié)果見(jiàn)表2。糖膠樹(shù)花乙酸乙酯提取物對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制活性， Rf值為0.28～0.45，抑菌斑的最大直徑在5.6～10 mm；其次是黃瓜角斑病菌，在Rf值為0.31～0.40（+），0.42～0.43（+）的范圍內(nèi)表現(xiàn)出抑菌活性，抑菌斑的最大直徑為4 mm。糖膠樹(shù)花乙酸乙酯層提取物對(duì)其他供試細(xì)菌未表現(xiàn)出抑制活性。硫酸鏈霉素對(duì)黃瓜角斑病菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌斑的直徑大于10 mm，而對(duì)其他供試細(xì)菌的抑菌斑直徑均在5～10 mm。

3 討論

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，糖膠樹(shù)花揮發(fā)油中相對(duì)含量較高的成分主要為2-莰烯（23.30%）、芳樟醇（23.09%）和（-）-4-萜品醇（10.54%）。莰烯可以作為合成香料的重要原料[17-18]，以莰烯為原料合成的衍生物在精細(xì)化工、醫(yī)藥、食品、材料等各個(gè)行業(yè)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[19-21]。芳樟醇是香水香精、家化產(chǎn)品香精及皂用香精配方中使用頻率最高的香料品種，也用于配制食用香精，現(xiàn)在全世界用于配制各種香精的芳樟醇達(dá) 1萬(wàn)多t[22]。芳樟醇也是重要的化工原料，用于合成各種芳樟酯類香料并具有廣譜抗細(xì)菌真菌、抗寄生蟲(chóng)、抗害蟲(chóng)、抗氧化等作用[23]。而萜品醇具有平喘，止咳，祛痰作用，可將糖膠樹(shù)花中成分開(kāi)發(fā)成安全有效的平喘藥物[24]。不同的提取方法對(duì)揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對(duì)含量影響較大。張宏意等[25]采用乙醚超聲提取法提取糖膠樹(shù)花揮發(fā)油，通過(guò)GC-MS分析鑒定出19種成分，其中主要成分為角鯊烯，相對(duì)含量高達(dá)39.44%，而本研究采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油，從中鑒定出21種組分，但并未檢測(cè)到角鯊烯。由于角鯊烯是高度不飽和烴類化合物，分子量大，沸點(diǎn)高（280℃），難揮發(fā)[26]，通過(guò)水蒸氣蒸餾法難以獲得。此外，張宏意等獲得的揮發(fā)油中芳樟醇的相對(duì)含量只有5.05%，遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)中的23.09%。所以對(duì)于需要分離不同的物質(zhì)，根據(jù)需要使用不同的工藝可以取得更好的效果。糖膠樹(shù)花揮發(fā)油中的某些組分在藥用和商用上有巨大潛力，本實(shí)驗(yàn)可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用糖膠樹(shù)提供參考。

而乙酸乙酯提取物對(duì)于常見(jiàn)的幾種細(xì)菌并未表現(xiàn)出較好的抗菌活性，僅對(duì)大腸桿菌的抑菌效果與陽(yáng)性對(duì)照硫酸鏈霉素效果相當(dāng)，說(shuō)明從糖膠樹(shù)花揮發(fā)油中可開(kāi)發(fā)利用抗大腸桿菌的物質(zhì)。Khan等[27]的研究結(jié)果表明，糖膠樹(shù)的葉、莖和根皮提取物都對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌有抑制作用，其丁醇提取物對(duì)細(xì)菌的作用效果尤其顯著，但沒(méi)有對(duì)花進(jìn)行研究，說(shuō)明在其他部位或者通過(guò)其他方法提取抗菌物質(zhì)仍有待深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 施金生. 糖膠樹(shù)生長(zhǎng)狀況及其土壤養(yǎng)分含量的調(diào)查分析[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2002 （3）：6-8.

[2] Channa S， Dar A， Ahmed S， et al. Evaluation of Alstonia scholaris leaves for broncho- vasodilatory activity[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2005， 97（3）： 469-476.

[3] 蘭芹英，仇玉萍，劉洪茂，等. 燈架樹(shù)的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2004，40（2）：203.

[4] Arulmozhi S， Mazumder P M， Lohidasan S， et al. Antidiabetic and antihyperlipidemic activity of leaves of Alstonia scholaris Linn. R.Br[J]. European Journal of Integrative Medicine， 2010， 2（1）： 23-32.

[5] Macabeo A P G， Krohn K， Gehle D， et al. Indole alkaloids from the leaves of Philippine Alstonia scholaris[J]. Phytochemistry， 2005， 66（10）： 1 158-1 162.

[6] 單體江，唐祥佑，劉 易，等. 池杉葉片和球果揮發(fā)油化學(xué)成分分析及抗細(xì)菌活性[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（5）：72-76.

[7] 李文茹，施慶珊，莫翠云，等. 幾種典型植物精油的化學(xué)成分與其抗菌活性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（11）：2 128-2 137.

[8] 鄭 華，李文彬，金幼菊，等. 植物氣味物質(zhì)及其對(duì)人體作用的研究概況[J]. 北方園藝，2007 （6）：76-78.

[9] Maciela M V， Moraisb S M， Bevilaquaa C M L， et al. Chemical composition of Eucalyptus spp. essential oils and their insecticidal effects on Lutzomyia longipalpis[J]. Veterinary Parasitology， 2010， 167（1）： 1-7.

[10] 王 銳， 穆 青. 精油——抗細(xì)菌耐藥性的新視野[J]. 國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)），2015（3）：103-107.

[11] 汪 燕，馮 皓，余炳偉，等. 白千層葉片和果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分及抗菌活性[J]. 福建林業(yè)科技，2016，43（4）：8-12，48.

[12] Lou J， Mao Z， Shan T， et al. Chemical composition， antibacterial and antioxidant properties of the essential oils from the roots and cultures of Salvia miltiorrhiza[J]. Journal of Essential Oil Bearing Plants， 2014， 17（3）： 380-384.

[13] 劉 易，唐祥佑，方 萍，等. 花葉良姜果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，36（3）：62-66.

[14] 李上標(biāo)，裴淑艷，蔣 超，等. MTT比色法研究進(jìn)展[J]. 西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，34（3）：68-73，91.

[15] 曲建博，婁紅祥，范培紅. TLC生物自顯影技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 中草藥，2005，36（1）：132-137.

[16] 趙江林，徐利劍，黃永富，等. TLC-生物自顯影-MTT法檢測(cè)滇重樓內(nèi)生真菌中抗菌活性成分[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2008，20（1）：28-32，51.

[17] 周調(diào)調(diào). 以莰烯為原料合成檀香型香料[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2012.

[18] 游晴如. 莰烯在合成香料中的應(yīng)用[J]. 林產(chǎn)化工通訊，1996（3）：24-28.

[19] 翁玉輝，肖轉(zhuǎn)泉，陳金珠，等. 莰烯衍生物的合成研究進(jìn)展[J]. 廣州化工，2015，43（21）：16-21.

[20] Kim S， Choi Y， Choi S， et al. Dietary camphene attenuates hepatic steatosis and insulin resistance in mice [J]. Obesity， 2014， 22（2）： 408-417.

[21] Tiwari M， Kakkar P. Plant derived antioxidants-Geraniol and camphene protect rat alveolar macrophages against t-BHP induced oxidative stress [J]. Toxicology in Vitro， 2009， 23（2）： 295-301.

[22] 林翔云. 天然芳樟醇與合成芳樟醇[J]. 化學(xué)工程與裝備，2008 （7）：21-26.

[23] 姜冬梅，朱 源，余江南，等. 芳樟醇藥理作用及制劑研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（18） ：3 530-3 533.

[24] 邵宏偉，朱婉萍. α-萜品烯醇止咳平喘作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2006，15（9）：32.

[25] 張宏意，方思琪，彭 維，等. 糖膠樹(shù)花揮發(fā)油GC-MS分析[J]. 中藥材，2010，33（8）：1 273-1 274.

[26] 廖 杰，趙玉蘭，李 寧，等. 植物油中角鯊烯的GC/MS分析[J]. 現(xiàn)代儀器，2008，14（5）：36-37.

[27] Khan M R， Omoloso A D， Kihara M. Antibacterial activity of Alstonia scholaris and Leea tetramera [J]. Fitoterapia 2003， 74（7-8）： 736-740.