桑利偉++高圣風++劉愛勤++孟倩倩++孫世偉++王政++茍亞峰

摘 要 利用可可離體葉片和離體果實鑒定可可種質對黑果病抗性的方法。結果表明：接種方法、接種物濃度、葉齡或果齡等因素影響離體葉片、果實黑果病發(fā)生程度；離體葉片接種鑒定方法最適條件是采用針刺法接種、接種物濃度3 × 107 個/mL、葉齡50～60 d；離體果實接種鑒定方法最適條件為采用滴接法、接種物濃度為3×105 個/mL、果齡2～3個月。采用離體葉片接種和離體果實接種方法均能鑒定出可可種質對黑果病抗性的差異，鑒定結果與田間成株期的抗病性表現(xiàn)基本一致。

關鍵詞 可可 ；黑果病 ；離體抗病性鑒定

中圖分類號 S435.71 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.011

In vitro Identification of Cacao Germplasm with Black Pod Resistance

SANG Liwei GAO Shengfeng LIU Aiqin

MENG Qianqian SUN Shiwei WANG Zheng GOU Yafeng

（Spice and Beverage Crops Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533）

Abstract The detached leaves and pods of cacao were used as materials to identify resistance of black pod disease in vitro from cacao germplasm resources. The results showed that the infection severity of black pod disease in the leaves and pods were influenced by the factors like inoculating methods， inoculum concentrations， and leaf and pod age. The optimum conditions for disease resistance identification through detached leaf inoculation were puncture inoculation， inoculum concentration 3×107 units/mL and leaf age 50～60 days. The optimum conditions for disease resistance identification through detached pod inoculation were dripping inoculation， inoculum concentration 3×105 units/mL and pod age 2～3 months. The difference of cacao germplasm in resistance to black pod disease were identified by both the detached leaf and pod inoculations， and the identification results were basically consistent with the field performance of the mature cacao in resistance to black pod disease.

Keywords Cacao ； black pod disease ； In vitro identification of disease resistance

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大飲料之一，用于制作巧克力和高級飲料等，經濟價值極高。據不完全統(tǒng)計，2015年，中國可可豆需求量約16萬t，幾乎全部依賴進口。海南省東南部適宜可可種植[1]，目前，中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所（簡稱“香飲所”）已在海南省萬寧、瓊海、保亭、陵水、三亞、東方等市縣推廣種植可可66.7 hm2。黑果病是為害可可的首要病害，廣泛分布于世界各可可種植區(qū)，導致每年全世界可可產量減少約30%，部分為害嚴重地區(qū)減產達90%[2]，選育和推廣抗病品種是防控該病的有效措施。香飲所可可種質圃已收集可可種質資源90份，經田間自然發(fā)病鑒定，不同可可種質間對黑果病抗性存在差異。國外有關于采用離體葉片接種[3]和離體果實接種[4]方法鑒定可可種質對黑果病抗性的報道，而國內還未見相關研究報道。研究利用可可離體葉片和離體果實鑒定可可種質對黑果病抗性的方法，明確了2種鑒定方法的最適條件，為抗病育種中的親本選擇提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

誘發(fā)黑果病的柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora R. et E. Smith）[5]，由香飲所在萬寧興隆可可種植園分離獲得。

1.1.2 供試品種

選擇連續(xù)3年田間自然發(fā)病鑒定、抗黑果病表現(xiàn)穩(wěn)定的品種：ZYP2-7（抗病品種）、ZYP3-6（感病品種）、ZYP5-20（高感品種），均由香飲所可可種質圃提供。

1.2 方法

試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，每個處理10片葉或10個果，用 0.5%的KMnO4溶液進行表面消毒15 min，無菌水沖洗干凈，3次重復[6]。

1.2.1 離體葉片接種鑒定

（1）接種方法。選取葉齡50～60 d的葉片，采用血球計數(shù)法[7]配制的3 × 107 個/mL游動孢子懸浮液進行接種，接種方法為離體葉片滴接法和離體葉片針刺法。離體葉片滴接法：將洗好的葉片放入經滅菌且?guī)V紙的托盤內，濾紙用無菌水保濕；吸取孢子懸浮液0.2 mL滴接于葉片表面中心，以滴接無菌水為對照。離體葉片針刺法：葉片處理同上，用一束針捆在一起，沾取孢子懸浮液刺于葉片中心，每刺一片葉沾一次菌液，以無菌水為對照；覆膜保濕并置于26℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每日早晨在濾紙上滴加無菌水；接種7 d后，統(tǒng)計發(fā)病級別，計算病情指數(shù)，進行抗病性劃分。

可可黑果病葉片病情分級標準：0級，葉片表面沒有病斑；1級，葉片表面病斑面積占葉片總面積的1%以下；2級，葉片表面病斑面積占葉片總面積的1%～10%；3級，葉片表面病斑面積占葉片總面積的11%～20%；4級，葉片表面病斑面積占葉片總面積的21%～50%；5級，葉片表面病斑面積占葉片總面積的 50%以上。

病情指數(shù)計算公式：

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調查總葉片數(shù)×最高一級代表值）×100。

抗性劃分標準：免疫，病情指數(shù)為0；高抗，病情指數(shù)在10以下；抗病，病情指數(shù)在11～30；感病，病情指數(shù)在31～50；高感，病情指數(shù)在 51 以上。

（2）接種物濃度的影響試驗。將配制好的3個不同濃度梯度（即3 × 105 、3 × 107 和3 × 109 個/mL）的游動孢子懸浮液，采用離體葉片針刺法接種在葉齡50～60 d的葉片上，以無菌水為對照；接種7 d后統(tǒng)計發(fā)病情況，方法同1.2.1-（1），確定最適接種物濃度。

（3）接種葉齡的影響試驗。在3個不同葉齡（即20～30、50～60和80 d以上）的葉片上，采用離體葉片針刺法接種濃度為3 × 107個/mL的游動孢子懸浮液，以無菌水為對照；接種7 d后，統(tǒng)計發(fā)病情況，方法同1.2.1-（1），確定最適接種葉齡。

1.2.2 離體果實接種鑒定

（1）接種方法。選取果齡2～3個月的可可果，以3×105個/mL的游動孢子懸浮液為接種物，接種方法為離體果實滴接法和離體果實針刺法，具體步驟同1.2.1-（1）。

可可黑果病果實病情分級標準：0級，果實表面沒有病斑；1級，果實表面病斑面積占果實總面積的1%以下；2級，果實表面病斑面積占果實總面積的1%～10%；3級，果實表面病斑面積占果實總面積的11%～20%；4級，果實表面病斑面積占果實總面積的21%～50%；5級，果實表面病斑面積占果實總面積的50%以上。

病情指數(shù)計算公式：

病情指數(shù)=∑（各級病果數(shù)×各級代表值）/（調查總果數(shù)×最高一級代表值）×100。

抗性劃分標準：免疫，病情指數(shù)為0；高抗：病情指數(shù)在10以下；抗病，病情指數(shù)在11～30；感?。翰∏橹笖?shù)在31～50；高感，病情指數(shù)在51以上。

（2）接種物濃度的影響試驗。將游動孢子懸浮液配成3×103、3×105和3×107個/mL等3個不同濃度梯度，采用離體果實滴接法接種在果齡2～3個月的可可果上，以無菌水為對照；接種7 d后，統(tǒng)計發(fā)病情況，方法同1.2.2-（1），確定最適接種濃度。

（3）接種果齡的影響試驗。果齡設1個月以內、2～3個月和4～5個月等3個處理，每個處理采用離體果實滴接法，接種濃度為3 × 105個/mL的游動孢子懸浮液，以無菌水為對照；接種7 d后，統(tǒng)計發(fā)病情況，方法同1.2.2-（1），確定最適接種果齡。

2 結果與分析

2.1 離體葉片接種鑒定

2.1.1 最適接種方法

由表1可知，采用離體葉片滴接法，各供試品種發(fā)病普遍較輕，病情指數(shù)雖依次增大，但差異小，無法區(qū)分抗性類別；采用離體葉片針刺法，各供試品種的病情指數(shù)差異明顯，抗性表現(xiàn)與田間自然發(fā)病鑒定結果一致。因此，針刺法是離體葉片鑒定的最適接種方法。

2.1.2 最適接種物濃度

表2結果表明，3種接種物濃度對供試品種發(fā)病情況影響不同，接種物濃度與病情指數(shù)呈正相關，接種物濃度越大，發(fā)病程度越嚴重。當接種物濃度為3×105個/mL時，各供試品種發(fā)病較輕，高感品種和感病品種差異不明顯，不能準確區(qū)分；當接種物濃度為3×107個/mL時，各供試品種間病情指數(shù)差異明顯，能將抗病、感病和高感很好地區(qū)分，并且同田間自然發(fā)病鑒定結果一致；當接種物濃度為3×109個/mL時，各供試品種發(fā)病普遍嚴重，抗病品種和感病品種不能很好地區(qū)分，無法真實反映供試品種的抗性類別。因此，最適的接種物濃度為3×107個/mL。

2.1.3 最適接種葉齡

不同葉齡對各供試品種發(fā)病情況影響不同。由表3可知，當葉齡為20～30 d時，各供試品種發(fā)病程度較高，雖然可以區(qū)分供試品種的抗性類別，但是感病品種和高感品種的病情指數(shù)差異小，區(qū)分度不高；當葉齡為50～60 d時，各供試品種病情指數(shù)差異顯著，可以將供試品種明確地歸類為抗病、感病和高感3類，并與田間自然發(fā)病鑒定結果一致；當葉齡為80 d以上時，各供試品種發(fā)病程度較輕，抗病品種和感病品種病情指數(shù)差異不明顯，無法顯著區(qū)分，不能真實反映供試品種抗病情況。因此，采用離體葉片接種法的最適葉齡為50～60 d。

綜上所述，采用離體葉片接種方法鑒定可可種質對黑果病抗性的最適條件是接種方法采用針刺法接種、接種物濃度為3 × 107 個/mL、葉齡50～60 d。

2.2 離體果實接種鑒定

2.2.1 最適接種方法

由表4可知，采用離體果實滴接法時，各供試品種間病情指數(shù)差異明顯，抗病、感病和高感品種可以被明顯區(qū)分，且與田間抗性表現(xiàn)一致；采用離體果實針刺法時，各供試品種病情發(fā)生嚴重，經田間自然發(fā)病鑒定表現(xiàn)穩(wěn)定的抗性品種被歸類為感病品種，不能準確體現(xiàn)供試品種的抗病特性。因此，最適接種方法為離體果實滴接法。

2.2.2 最適接種物濃度

各供試品種發(fā)病程度隨接種物濃度增加而越來越嚴重（表5）。當接種物濃度為3×103個/mL時，供試品種發(fā)病程度較輕，病情指數(shù)差異不明顯，抗病品種和感病品種不能被明確區(qū)分；當接種物濃度為3×105個/mL時，各供試品種的病情指數(shù)差異明顯，抗病、感病和高感品種病情區(qū)分度高，適宜品種抗性評價，評價結果與田間自然發(fā)病鑒定結果一致；當接種物濃度為3×107個/mL時，各供試品種發(fā)病情況嚴重，病情指數(shù)普遍較高，不能真實反映供試品種抗病特性，與田間自然發(fā)病鑒定結果不一致?？梢?，最適接種物濃度為3×105個/mL。

2.2.3 最適接種果齡

表6結果表明，當果齡為1個月以內時，各供試品種發(fā)病情況嚴重，病情指數(shù)普遍偏高，不能客觀反映供試品種抗病性，在田間表現(xiàn)穩(wěn)定的抗病品種會出現(xiàn)感病品種的發(fā)病癥狀；當果齡為2～3個月時，各供試品種病情指數(shù)差異顯著，供試品種被歸類為不同的抗性類別，并且與其田間抗病性表現(xiàn)一致，適宜用于抗性鑒定；當果齡為4～5個月時，各供試品種發(fā)病程度較輕，病情指數(shù)偏小，感病品種和高感品種抗病性區(qū)分度不高，會出現(xiàn)與田間自然發(fā)病鑒定結果不一致情況。因此，最適接種果齡為2～3個月。

綜上所述，采用離體果實接種法鑒定可可種質對黑果病抗性的最適條件是接種方法采用滴接法、接種物濃度為3×105個/mL、果齡為2～3個月。

3 討論與結論

對于離體葉片接種法，采用滴接法接種，各可可品種發(fā)病程度較輕，對于田間表現(xiàn)為感病的品種可能被歸類為抗病品種；采用針刺法接種，抗病、感病和高感品種間區(qū)分度高，鑒定結果與田間抗病性表現(xiàn)一致。接種物濃度會影響葉片的發(fā)病程度和保綠時間，接種量過少，葉片發(fā)病程度普遍偏輕；接種量過大，葉片發(fā)病程度偏嚴重，保綠時間短，都不能真實反映品種抗病性，適宜的接種物濃度為3×107個/mL。幼嫩葉片保綠時間短，老化葉片品種抗病性普遍偏弱，均不適宜抗病性鑒定，最適葉齡為50～60 d。采用離體葉片接種方法鑒定可可種質對黑果病抗性的最適條件是采用針刺法接種、接種物濃度為3×107個/mL、葉齡為50～60 d。對于離體果實接種法，采用針刺法時，各品種病情發(fā)生偏嚴重，適宜的接種方法是滴接法。接種物濃度對果實發(fā)病程度有明顯影響，接種量過少或過大均不能真實反映品種抗病性，適宜的接種物濃度為3×105個/mL。幼果保存時間短，接種后病情偏嚴重；老齡果，品種發(fā)病程度偏輕，最適接種果齡為2～3個月。采用離體果實接種法鑒定可可種質對黑果病抗性的最適條件為采用滴接法接種、接種物濃度為3×105個/mL、果齡為2～3個月。

關于可可種質抗黑果病鑒定方法的研究在國內未見報道。國外學者將離體葉片接種法作為可可抗黑果病早期鑒定的方法進行了研究，結果表明，以選取未木質化的枝條上或葉齡在50～60 d的葉片為宜，一般苗圃里可可苗的葉片比田間生長植株上的葉片鑒定效果更好，接種游動孢子濃度為3×105 個/mL的病原菌，5～7 d后觀察結果，該方法能快速準確地反映不同可可種質對黑果病的抗性[3，8]。 也有專家采用離體果實接種法進行了可可種質抗黑果病鑒定[4]，其鑒定結果與連續(xù)3年以上的田間觀察數(shù)據具有顯著的相關性，該方法有助于實現(xiàn)抗黑果病可可種質的早期快速篩選?？煽蓪诠〉目剐阅軌蚍€(wěn)定地遺傳給后代[9-10]。葉片接種是早期可可抗黑果病鑒定的最合適方法，按照標準化的方式，在最適條件下，該方法可解釋可可種質抗黑果病遺傳變異的75%～90%[11-12]。

本研究結果表明，采用離體葉片接種方法鑒定可可種質對黑果病抗性的最適接種物濃度是3×107個/mL，而采用離體果實接種方法的最適接種物濃度是3×105個/mL，同Nyassé等[3]和Iwaro等[4]研究結果不同，原因可能是病原菌致病性不同。綜上所述，采用離體葉片接種法和離體果實接種法均能鑒定出不同可可種質對黑果病抗性的差異，鑒定結果與田間抗病性表現(xiàn)基本一致。但是不同接種方法、接種物濃度和接種葉齡對鑒定結果有影響。為提高可可種質抗黑果病鑒定的準確性，應采取離體鑒定與田間自然發(fā)病鑒定相結合的方法。

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