劉紅莉，賈文江，曹望弟

（陜西省商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000）

·檢驗(yàn)檢測·

高效液相色譜法測定蓼子七中沒食子酸含量

劉紅莉，賈文江，曹望弟

（陜西省商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000）

目的建立測定蓼子七中沒食子酸含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱采用InertSusTain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇－水－磷酸（15∶85∶0.085），流速為1.0 mL／min，檢測波長為270 nm，柱溫為35℃。結(jié)果蓼子七中沒食子酸質(zhì)量濃度在0.141 5～0.830 5 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（R2＝0.999 9），平均回收率為98.35%，RSD為0.60%（n＝6）。結(jié)論 該方法簡便、快速，穩(wěn)定性好，可用于蓼子七中沒食子酸含量的測定。

高效液相色譜法；蓼子七；沒食子酸；含量測定

蓼子七為蓼科植物金線草 Antenoron filiforme (Thunb.)Roberty et Vautier的根莖，始載于《本草拾遺》，別名豬蓼七、鐵棱角三七、金線草、鐵拳頭、土三七、毛蓼，屬民間草藥[1－6]。其藥性平、淡，具有祛風(fēng)除濕、止血、涼血、舒筋接骨、止痛等功效，可用于治療咳血、止血、便血、風(fēng)濕脾癥、跌打損傷、骨折等病癥[7－8]。文獻(xiàn)記載，在同屬的短毛金線草的乙醇提取物中分離鑒定了11個(gè)化合物，其中有沒食子酸（gallic acid）、左旋兒茶精（catechin）、左旋表兒茶精（epicatechin）、左旋表兒茶精－3－O－沒食子酸酯（epicatechin－3－O－gallate）、原矢車菊素B2（procyanidin B2）、原矢車菊素B2－3－O－沒食子酸酯（procyanidin B2－3－O－gallate）等化合物[9]，曾采用顯微鑒別法、薄層色譜（TLC）法對蓼子七中沒食子酸進(jìn)行定性鑒別[6]。目前尚未見蓼子七中沒食子酸的含量測定報(bào)道，本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法測定蓼子七中沒食子酸含量，為蓼子七的開發(fā)和利用提供質(zhì)量控制依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U－3000型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器，四元泵（美國賽默飛世爾科技公司）；BT－125D型電子天平（日本島津公司）；FW－200D型高速萬能粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限公司）；HH－S8型水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；AS7240A型超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩儀器有限公司）。

1.2 試藥

蓼子七采于商洛市柞水縣，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師郭耀武鑒定為蓼科植物金線草 Antenoron filiforme(Thunb.)Roberty et Vautier；沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110831－201204，含量為89.9%）。甲醇（色譜純，西格瑪奧德里奇公司）；磷酸（分析純，天津耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[7]

色譜柱：InertSusTain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－水－磷酸(15∶85∶0.085)；檢測波長：270 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)以沒食子酸峰計(jì)應(yīng)不小于5 000，保留時(shí)間約為7.1 min，沒食子酸峰與相鄰峰的分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取沒食子酸對照品（批號為110831－201204）12 mg，精密稱定，置 100 mL容量瓶中，加甲醇適量，使其溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取1 mL，置200 mL容量瓶中，用甲醇定容并稀釋成每1 mL含0.6 μg的溶液，即得。

供試品溶液：將藥材粉碎并，四號篩，取藥材細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，加入精密量取的4 mol／L鹽酸溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量；水浴加熱2.5 h后，放冷，再稱定質(zhì)量，并用4 mol／L的鹽酸溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液1 mL置100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.594 μg／mL），分別進(jìn)樣2，4，6，8，10，12 μL，以進(jìn)樣量（X，μL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y＝0.068 9 X＋0.003 7，R2＝0.999 9(n＝6)。結(jié)果表明,沒食子酸質(zhì)量濃度在0.141 5～0.830 5 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖2。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定和記錄沒食子酸的峰面積。結(jié)果沒食子酸峰面積 RSD 為0.28%（n＝6），表明儀器精密度良高。

圖2 沒食子酸線性關(guān)系圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取0.45 μm微孔濾膜過濾后的同一供試品溶液適量，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果沒食子酸峰面積的 RSD為0.55%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取蓼子七樣品細(xì)粉6份，每份約0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果平均含量為0.258 4%，RSD為1.3% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的蓼子七供試品6份，精密稱定，每份約0.5 g，加入質(zhì)量濃度為1.4 g／L的沒食子酸對照品溶液適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取供試品約0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄沒食子酸的峰面積（A），按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表1 沒食子酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 蓼子七中沒食子酸含量（n＝4）

3 討論

3.1 測定方法選擇

蓼子七為民間常用中藥材，收載于2015年版《陜西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。其中僅規(guī)定了性狀、鑒別及檢查項(xiàng)，含量測定未作要求，且尚未見HPLC法測定蓼子七中沒食子酸含量的報(bào)道。研究表明，沒食子酸具有收斂、止血、止瀉、殺菌、抗病毒作用[10－11]，抗菌、抗病毒、抗腫瘤的作用[12－13]，以及抗炎、抗突變、抗氧化等生物活性[14－15]。本研究中建立了測定蓼子七中沒食子酸含量的HPLC法，目的是為更好地開發(fā)和利用蓼子七提供依據(jù)。

3.2 超聲處理時(shí)間選擇

曾選擇 4 moL／L鹽酸溶液水浴加熱 2.5 h，加50%甲醇溶液回流30 min，加水超聲30 min，水浸1 h，回流2 h，乙酸乙酯等提取方法[6－8]。結(jié)果顯示，水浴加熱2.5 h＞水浸1 h，回流2 h＞加水超聲30 min＞加熱回流30 min，以加4 moL／L鹽酸溶液水浴加熱2.5 h的含量提取最高（0.26%），超聲30 min的含量提取最低（0.06%）。故選擇了加4 moL／L鹽酸溶液水浴加熱2.5 h。

3.3 檢測波長選擇

曾選用270，290，330 nm檢測波長進(jìn)行測試，結(jié)果顯示于270 nm波長處出峰快，分離度效果好，理論板數(shù)高。故選擇270 nm為檢測波長。

綜上所述，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC法測定蓼子七中沒食子酸含量，簡單易行，穩(wěn)定可靠，可作為測定蓼子七中沒食子酸成分含量的可行性方法，可作為蓼子七開發(fā)利用和質(zhì)量控制的依據(jù)，可為其標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考依據(jù)。

[1]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1975:534.

[2]南京中藥大學(xué).中藥大辭典（上冊）[M].第2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1957－1981.

[3]崔同寅.全國重名易混中藥鑒別手冊[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1992:39.

[4]李世友.秦嶺巴山天然藥物志[M].西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1987:86.

[5]湖北省衛(wèi)生局.湖北中草藥志(二)[M].武漢：湖北人民出版社，1982:633.

[6]曹望弟，王翠萍.金錢草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥業(yè)，2012，21(10)：92－93.

[7]韓 雙，席先蓉，黃 平.貴州不同地區(qū)五倍子中沒食子酸含量測定與品質(zhì)評價(jià)[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16(5)：52－53.

[8]周小雅，梁光毅，劉雪梅.高效液相色譜法測定草龍中沒食子酸的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29（3）：235－237.

[9]趙友興，李紅芳，馬青云，等.金線草化學(xué)成分研究[J].中藥材，2011，34(5)：704－707.

[10]章榮生.高效液相色譜法測定山茱萸中沒食子酸的含量[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2006，3(4)：27－28.

[11]張?zhí)m珍，王曉強(qiáng)，宣 輝，等.高效液相色譜法測定葉下珠中沒食子酸的含量[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23(6)：46－47.

[12]劉 瑞，何方奕，李 磊，等.高效液相色譜法同時(shí)測定拳參藥材中沒食子酸和綠原酸的含量[J].藥物分析雜志，2005，25(4)：390－393.

[13]國家醫(yī)藥局中藥情報(bào)中心站.植物藥效成分手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：209.

[14]李肖玲，崔 嵐，祝德秋 .沒食子酸生物學(xué)作用的研究進(jìn)展[J].中國藥師，2004，7(10)：767－769.

[15]曹瑞珍，張國文，薛 燕，等.地錦草提取物對小鼠血液過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2002，13(12)：724－725.

Content Determination of Gallic Acid in Antenoron Filiforme(Thunb.)by HPLC

Liu Hongli,Jia Wenjiang,Cao Wangdi
(Shangluo Institute for Food and Drug Control,Shangluo,Shaanxi,China 726000)

Objective To establish an HPLC method for the content determination of gallic acid in Antenoron Filiforme(Thunb.).M ethods The chromatographic column was InertSusTain C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm),the mobile phase was methanolwater－phosphoric(15∶85∶0.085)with a flow rate was 1.0 mL／min,the detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 35℃.Results The linear ranges of gallic acid in Polygonum seven was 0.141 5－0.830 5 μg／mL(R2＝0.999 9).The average recovery was 98.35% and RSD was 0.60%.Conclusion The method is simple,rapid,has good stability,and can be used for the content determination of gallic acid in Antenoron Filiforme(Thunb.).

HPLC;Antenoron Filiforme(Thunb.);gallic acid;content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)05－0032－03

2016－11－05；

2016－12－04)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.05.008

劉紅莉（1964－），女，主管藥師，研究方向藥品檢驗(yàn)及管理，（電話）0914－2396710（電子信箱）1445213517＠qq.com。