陳宇涵, 賴?yán)螓? 陳愛貞, 蔣元杰, 宋 夏, 楊 芳, 陳愛琴

蟾毒靈對(duì)大鼠嗎啡成癮消退及其重建的影響

陳宇涵1, 賴?yán)螓?, 陳愛貞1, 蔣元杰1, 宋 夏1, 楊 芳1, 陳愛琴2

目的 研究蟾毒靈在嗎啡成癮消退和重建中的藥理作用。 方法 大鼠隨機(jī)分為溶酶組和蟾毒靈組，每組各12只。腹腔注射鹽酸嗎啡并通過(guò)條件性位置偏愛裝置建立嗎啡成癮模型后，2組分別注射溶酶和蟾毒靈(0.6 mg/kg)并檢測(cè)其偏愛分值變化。 結(jié)果 蟾毒靈組在注射蟾毒靈后，偏愛分值降低，與后測(cè)值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且效應(yīng)持續(xù)3 d以上；溶酶組的偏愛分值與后測(cè)值比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。成癮消退后采用半劑量嗎啡注射重建嗎啡成癮，蟾毒靈組和溶酶組的偏愛分值比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 蟾毒靈可促進(jìn)大鼠嗎啡成癮的消退，但不影響成癮消退后的重建。

腫瘤/*病理學(xué)； 腫瘤/*治療； 嗎啡依賴； 疾病模型，動(dòng)物

藥物成癮的本質(zhì)是一種慢性復(fù)發(fā)性腦病，形成機(jī)制復(fù)雜，目前的治療方法只能減輕軀體依賴，但不能解除心理依賴，而且療程結(jié)束后仍有相當(dāng)高的復(fù)吸率。因此,探尋促進(jìn)成癮消退、抑制復(fù)吸的藥物意義重大[1-2]。中藥提取物蟾毒靈目前多用于抗腫瘤領(lǐng)域。研究表明其是有效的Na+，K+-ATP酶抑制劑以及強(qiáng)效穩(wěn)定的麻醉鎮(zhèn)痛劑[3-4]。本研究擬探討藥物成癮時(shí)蟾毒靈在戒毒領(lǐng)域的運(yùn)用機(jī)制，為臨床用藥提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(200±25)g，清潔級(jí)[福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(閔)2012-0001]。在光照14 h、黑暗10 h、室溫(25±1)℃條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和攝食。

1.1.2 藥品與試劑 蟾毒靈(批號(hào):P0512，福州市永恒生物技術(shù)有限公司)，臨用前用溶酶二甲基亞砜(DMSO)配成所需濃度；鹽酸嗎啡注射液(批號(hào)：131005-2，濃度10 mg/mL，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)。

1.1.3 條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)裝置 上海移數(shù)信息科技有限公司生產(chǎn)的條件位置偏愛系統(tǒng)(穿梭箱)。穿梭箱為三箱式，由2個(gè)隔板分為大小相同的2個(gè)條件訓(xùn)練箱70 cm×30 cm×34 cm(長(zhǎng)×寬×高)和一個(gè)中間箱(13 cm×22 cm×27 cm)，隔板放入時(shí)可將動(dòng)物限制在某一個(gè)箱內(nèi)，隔板取出時(shí)動(dòng)物在整個(gè)穿梭箱內(nèi)可以自由跑動(dòng)。各箱的顏色和底板不同。一側(cè)的訓(xùn)練箱四壁白色、底板為光滑的桿狀，另一側(cè)訓(xùn)練箱四壁黑色，底板為網(wǎng)格狀，中間箱四壁灰色，底板為灰色樹脂玻璃，底板和箱內(nèi)的光線可調(diào)。箱內(nèi)裝有工業(yè)高清晰CCD攝像頭，清晰度為600線，視頻攝像系統(tǒng)既可在光亮條件下、也可在星光條件下，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)的黑白攝像和分析。

1.2 方法

1.2.1 適應(yīng)環(huán)境 將大鼠放入CPP箱體中讓其在各箱體中自由活動(dòng)15 min，連續(xù)3 d，以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暴露于實(shí)驗(yàn)裝置的新奇感與應(yīng)激作用。

1.2.2 前測(cè)階段 記錄大鼠在每側(cè)箱體停留的時(shí)間，測(cè)定其自然偏愛側(cè)，非自然偏愛側(cè)為伴藥箱，結(jié)果所有大鼠均顯示對(duì)黑箱的偏愛，故選擇白箱為伴藥箱。以前測(cè)階段最后1天的偏愛分值作為前測(cè)值：

1.2.3 建立嗎啡成癮模型 選取前側(cè)階段偏愛暗箱的SD大鼠，前測(cè)試后的第1天開始為期5 d的條件訓(xùn)練。采取counterbalance設(shè)計(jì)方式，即將SD大鼠中的一半與藥物搭配黑箱，另一半與藥物搭配白箱。嗎啡劑量為1 mL/kg(濃度10 mg/mL)，生理鹽水1 mL/kg，腹腔注射。每天上午半數(shù)大鼠注射嗎啡，半數(shù)注射生理鹽水，各自一半放白箱一半放黑箱，時(shí)間為45 min；上午注射嗎啡的大鼠晚上注射生理鹽水，上午注射生理鹽水的大鼠晚上注射嗎啡，上午放白箱的晚上放置于黑箱，上午放黑箱的晚上放置于白箱，時(shí)間均為45 min。上午和晚上2次注射時(shí)間間隔8 h以上。末次條件性訓(xùn)練24 h后，把大鼠放在中間箱體中，15 min內(nèi)允許其在2個(gè)側(cè)箱內(nèi)自由活動(dòng)，記錄動(dòng)物在兩側(cè)箱體內(nèi)分別停留的時(shí)間。測(cè)定其偏愛分值并與前測(cè)值比較。若大鼠表現(xiàn)出對(duì)伴藥側(cè)的偏愛且有顯著性差別，則確定已建立CPP嗎啡成癮模型。將未表現(xiàn)成癮的大鼠剔除。

1.2.4 分組并給藥 選取建立嗎啡成癮模型后的大鼠24只，隨機(jī)分為2組(n=12)。 蟾毒靈組：?jiǎn)未胃骨蛔⑸?.6 mg/kg蟾毒靈(溶酶為DMSO)；溶酶組：?jiǎn)未胃骨蛔⑸涞葎┝緿MSO。給藥后的大鼠每天檢測(cè)1次偏愛分值。當(dāng)溶酶組、蟾毒靈組大鼠的偏愛分值連續(xù)3 d和前測(cè)值比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與后側(cè)值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，則判定大鼠進(jìn)入成癮消退期，停止測(cè)試偏愛分值。

1.2.5 CPP模型重現(xiàn)測(cè)試 大鼠進(jìn)入成癮消退期后，用藥物進(jìn)行點(diǎn)燃測(cè)試(半劑量嗎啡腹腔單次注射)，5 min后把大鼠放在中間箱體中，15 min內(nèi)允許其在兩個(gè)側(cè)箱內(nèi)自由活動(dòng)，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄動(dòng)物在兩個(gè)側(cè)箱體內(nèi)分別停留的時(shí)間，計(jì)算偏愛分值，如果偏愛分值顯著高于消退期，而且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則證明CPP模型重現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以AV±SE表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用t檢驗(yàn)及ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并利用Graphpad prism軟件繪制圖表。

2 結(jié) 果

2.1 嗎啡誘導(dǎo)大鼠CPP效應(yīng)的表達(dá) 注射嗎啡前，24只大鼠的偏愛分值前測(cè)值為(0.278 3±0.013 3)；經(jīng)過(guò)5 d的嗎啡誘導(dǎo)訓(xùn)練，偏愛分值為(0.690 8±0.013 3)，與前測(cè)值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示嗎啡條件性位置偏愛成功建立，大鼠形成成癮記憶(圖1)。

2.2 蟾毒靈對(duì)大鼠嗎啡成癮消退的作用 蟾毒靈組大鼠偏愛分值顯著降低為(0.355 8±0.069 7)，而溶酶組偏愛分值為(0.648 3±0.046 5)，注射蟾毒靈后偏愛分值與前測(cè)值比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而注射溶酶后偏愛分值與前測(cè)值比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示蟾毒靈可抑制大鼠的成癮記憶(圖2)。

為觀測(cè)藥物效應(yīng)，持續(xù)3 d檢測(cè)偏愛分值，蟾毒靈組大鼠偏愛分值分別為[(0.455 0±0.052 8),(0.430 8±0.065 8),(0.435 0±0.059 3)],與后測(cè)值比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)；溶酶組大鼠的偏愛分值分別為[(0.624 2±0.050 8),(0.631 7±0.047 1),(0.640 8±0.051 5)]，與后測(cè)值比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。連續(xù)3 d蟾毒靈組偏愛分值均減低，提示蟾毒靈可促進(jìn)大鼠嗎啡成癮記憶的消退。

與前測(cè)值比較，☆：P<0.01.圖1 嗎啡誘導(dǎo)大鼠位置偏愛效應(yīng)的表達(dá)Fig 1 Expression of morphine-induced conditioned place preference

DMSO:二甲基亞砜. 與前測(cè)值比較，☆：P<0.05.圖2 蟾毒靈對(duì)大鼠位置偏愛消退的影響Fig 2 The effects of Bufalin to extinction of morphine-induced conditioned place preference

2.3 蟾毒靈組和溶酶組大鼠嗎啡成癮的消退 溶酶組大鼠在注射DMSO 11，12，13 d后，其偏愛分值分別為[(0.308 3±0.028 0),(0.320 0±0.022 5),(0.318 3±0.030 8)]，與前測(cè)值比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與后測(cè)值比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示嗎啡成癮已消退；蟾毒靈組的偏愛分值一直維持在較低的水平，注射蟾毒靈10，11，12 d后，其偏愛分值分別為[(0.455 8±0.059 6),(0.345 0±0.065 8),(0.355 0±0.059 2)]，與前測(cè)值比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與后測(cè)值比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示蟾毒靈組與溶酶組大鼠嗎啡成癮均已完全消退(表1)。

2.4 蟾毒靈對(duì)半劑量嗎啡誘導(dǎo)大鼠CPP復(fù)燃的影響 大鼠CPP效應(yīng)消退后，以半劑量嗎啡和伴藥箱作為引燃刺激，以探討蟾毒靈是否影響成癮消退后的重建。無(wú)論是蟾毒靈組還是溶酶組，半劑量注射嗎啡后，偏愛分值明顯增加[(0.560 8±0.040 4)，(0.699 2±0.031 9)]，與注射前的偏愛分值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示2組半劑量嗎啡均成功重建嗎啡成癮。此外，點(diǎn)燃后2組之間的偏愛分值比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示蟾毒靈對(duì)嗎啡成癮消退后的重建無(wú)明顯抑制作用(圖5)。

與后測(cè)值比較,☆:P<0.05.圖3 蟾毒靈促進(jìn)大鼠嗎啡成癮消退的持續(xù)時(shí)間Fig 3 The duration of Bufalin facilitates extinction of morphine-induced conditioned place preference

DMSO:二甲基亞砜.圖4 注射溶酶后大鼠偏愛分值的變化Fig 4 The changes of preference value after injection DMSO

表1 蟾毒靈組和溶酶組大鼠在嗎啡成癮消退階段的偏愛分值

Tab 1 The preference value of group bufalin and group DMSO in morphine-induced conditioned place preference extinction phase

時(shí) 間偏愛分值蟾毒靈DMSO前測(cè)值0．2783±0．01330．2783±0．0133后側(cè)值0．6908±0．01330．6908±0．0133注射10d后0．4558±0．0596☆0．5752±0．0327注射11d后0．3450±0．0658☆0．3083±0．0280☆注射12d后0．3550±0．0592☆0．3200±0．0225☆注射13d后0．3183±0．0308☆

DMSO:二甲基亞砜. 與后測(cè)值比較，☆：P<0.05.

DMSO:二甲基亞砜. 與后測(cè)值比較，☆：P<0.05；與消退期偏愛分值比較，#：P<0.05.圖5 蟾毒靈對(duì)大鼠嗎啡成癮消退后重建的影響Fig 5 The effects of Bufalin to the reinstatement of morphine-induced conditioned place preference

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以CPP建立大鼠嗎啡成癮模型，以半劑量嗎啡腹腔注射點(diǎn)燃，研究蟾毒靈對(duì)大鼠嗎啡成癮消退和重建的影響。蟾毒靈組單次腹腔注射蟾毒靈(0.6 mg/kg)，對(duì)照組單次注射同等劑量的DMSO，比較偏愛分值的變化。結(jié)果表明,蟾毒靈可促進(jìn)大鼠嗎啡成癮的消退，但不影響消退后嗎啡成癮的重建。

在藥物成癮的研究中，CPP模型是應(yīng)用巴甫洛夫條件反射的原理，把藥物與環(huán)境刺激反復(fù)結(jié)合后，動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出對(duì)伴藥環(huán)境(伴藥箱)的偏愛，把藥物的獎(jiǎng)賞效應(yīng)與伴藥箱聯(lián)系起來(lái)，表明大鼠形成了成癮記憶。成癮記憶是藥物成癮牢固性和持續(xù)性及高復(fù)吸率的關(guān)鍵機(jī)制[5]。

本研究觀察到大鼠嗎啡成癮后腹腔內(nèi)單次注射蟾毒靈，可降低大鼠CPP的偏愛分值，促進(jìn)成癮記憶的消退。蟾毒靈是中藥蟾酥的藥理成分之一，目前多用于抗腫瘤領(lǐng)域，有研究表明其是有效的Na+，K+-ATP酶抑制劑[3]。Hazelwood等發(fā)現(xiàn)，Na+，K+-ATP酶影響中樞DA系統(tǒng)的功能[6]。藥物成癮的機(jī)制研究表明，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)腦內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)的增多是致使嗎啡成癮的原因之一，藥物通過(guò)激活中腦邊緣的多巴胺系統(tǒng)促進(jìn)DA的釋放，從而產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)，致使藥物成癮[7-8]。因而，筆者推測(cè)蟾毒靈可能通過(guò)抑制Na+，K+-ATP酶的活性，影響到大腦獎(jiǎng)賞通路多巴胺的功能，促進(jìn)嗎啡成癮的消退。

研究表明，蟾毒靈具有平穩(wěn)的鎮(zhèn)痛麻醉作用，其鎮(zhèn)痛效果是可卡因的30～60倍，且無(wú)局部刺激作用，其作用機(jī)理與肌細(xì)胞緩慢釋放乙酰膽堿有關(guān)[4]。現(xiàn)有的中樞乙酰膽堿和藥物成癮的研究進(jìn)展表明，乙酰膽堿對(duì)VTA投射到伏隔核的獎(jiǎng)賞投射通路具有調(diào)節(jié)作用，膽堿能神經(jīng)參與了藥物的獎(jiǎng)賞和自身給藥行為[9]。Rezayof等發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)微量注射膽堿能抑制劑能顯著抑制嗎啡或可卡因誘導(dǎo)的CPP及自發(fā)活動(dòng)[10]。故蟾毒靈對(duì)大鼠嗎啡成癮消退的促進(jìn)作用也可能是通過(guò)作用于中樞膽堿能神經(jīng)，影響乙酰膽堿的釋放，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物獎(jiǎng)賞和自身給藥行為的調(diào)節(jié)。當(dāng)然，由于阿片類藥物成癮機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多系統(tǒng)多靶點(diǎn)的變化，蟾毒靈是否通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗嗎啡依賴與促進(jìn)成癮消退的作用及主要的作用靶點(diǎn)有哪些，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

藥物成癮后復(fù)吸率居高不下，可能與成癮記憶的牢固持久有關(guān)。實(shí)驗(yàn)大鼠成癮記憶一旦形成后，將失去對(duì)藥物的控制，藥物戒除后，成癮記憶仍處于潛伏狀態(tài)；當(dāng)重新暴露于藥物或其他相關(guān)環(huán)境后，成癮記憶很容易被喚起[11]。蟾毒靈可促進(jìn)嗎啡成癮記憶的消退，然而本研究未觀察到其對(duì)嗎啡成癮消退后重建的抑制，提示成癮記憶并未被蟾毒靈完全擦除。下一階段筆者擬通過(guò)多次注射蟾毒靈來(lái)進(jìn)一步探究其對(duì)藥物成癮復(fù)吸的影響。

綜上所述，蟾毒靈可以促進(jìn)大鼠嗎啡成癮的消退，為今后精神藥物及毒品戒斷研究提供理論依據(jù)。由于蟾毒靈還具有強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛作用，理論上支持與嗎啡等具有依賴性的鎮(zhèn)痛藥物臨床聯(lián)合使用，在優(yōu)化鎮(zhèn)痛效應(yīng)的同時(shí)預(yù)防藥物成癮，這也為臨床用藥提供了新的思路。

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(編輯:張慧茹)

The Effects of Bufalin on Extinction and Reinstatement of Morphine Addictive Rats

CHEN Yuhan1, LAI Lili2, CHEN Aizhen1, JIANG Yuanjie1, SONG Xia1, YANG Fang1, CHEN Aiqin2

1. Department of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350122,China; 2. Department of Physiology and Pathology Physiology, Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350122,China

Objective To study the pharmacological actions of bufalin on extinction and relapse of morphine addictive rats. Methods We established the rat models of morphine addiction by using conditioned place preference. To explore the effects of bufalin on extinction and reinstatement of morphine addictive rats, the rats in the experimental group were given a single peritoneal injection of bufalin (0.6 mg/kg) after addiction while the control group only received an injection of same amount of DMSO. Results The preference value decreased significantly compared with the post-test value(P<0.05) after bufalin injection and the effects lasted at least 3 days. However, the preference value of the control group didn’t change significantly after injection of DMSO. Then half-dose of morphine was injected to reinstate conditioned place preferences after extinction. The results indicted both groups produced reinstatement and there was no significant difference between the bufalin group and the DMSO group. Conclusion Bufalin promotes the extinction of morphine addictive rats, while it does not affect half-dose of morphine reinstatement.

neoplasms/*pathology；neoplasms/*therapy；morphine dependence；disease models, animal

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)青年基金(81100998)；福建省自然科學(xué)基金(2016J01364)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510392008)

福建醫(yī)科大學(xué),福州 350122 1.臨床醫(yī)學(xué)部；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)系

陳宇涵,男,福建醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生

陳愛琴. Email:jesseaqc@163.com

R332； R730.1； R730.2； R730.5

A

1672-4194(2017)01-0006-04