肖義坡 盧海艷 呂邵軍 謝少賢 王兆征 陳煥文

摘要采用內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜（iEESIMS）技術(shù)，在無需樣品預(yù)處理的前提下，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法直接對(duì)豬肉組織中沙丁胺醇與克倫特羅進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬肉組織中沙丁胺醇與克倫特羅具有較高的靈敏度，單個(gè)樣品單一指標(biāo)的檢測(cè)時(shí)間少于30s。在0.01～1000μg/kg濃度范圍內(nèi)，信號(hào)強(qiáng)度對(duì)數(shù)（Y）與濃度對(duì)數(shù)（X）具有較好的線性關(guān)系，定量限分別為6.2和9.8ng/kg。本方法分析速度快、樣本耗量少、靈敏度高，適用于豬肉中痕量沙丁胺醇與克倫特羅等“瘦肉精”的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞內(nèi)部萃取電噴霧電離；沙丁胺醇；克倫特羅；“瘦肉精”；組織分析

1引言

“瘦肉精”是指一類具有相似結(jié)構(gòu)的β激動(dòng)劑化合物，常見的主要有沙丁胺醇與克倫特羅，臨床上一般用于治療休克和哮喘等疾病[1＼]。由于該類藥物具有抑制動(dòng)物脂肪的合成、促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)和重新分配家畜脂肪與瘦肉比例等作用，常被非法添加在家畜的飼料中來提高畜牧生產(chǎn)效率。根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)，沙丁胺醇與克倫特羅為禁用物質(zhì)，在食品（肉中）不得檢出。常規(guī)情況下豬肉中“瘦肉精”檢測(cè)為陽性的含量水平在0.1～100μg/kg之間。人食用含沙丁胺醇與克倫特羅等“瘦肉精”成分的肉類產(chǎn)品后，會(huì)導(dǎo)致血壓升高、心率加快等反應(yīng)，甚至影響水上及部分田徑運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的成績(jī)，長(zhǎng)期服用也對(duì)心血管系統(tǒng)帶來嚴(yán)重的危害，甚至導(dǎo)致生命危險(xiǎn)[2＼]。因此，建立一種肉質(zhì)食品中“瘦肉精”的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)保障食品安全具有重要意義[3～6＼]。

目前，動(dòng)物組織中“瘦肉精”的檢測(cè)方法主要包括膠體金免疫層析法[7，8＼]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELSA）[9，10＼]和表面等離子體共振生物芯片[11，12＼]、氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）[13，14＼]、高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLCMS）[15～17＼]、高效液相色譜法[18，19＼]等。膠體金免疫層析法，主要用于大量篩查，但檢測(cè)結(jié)果因受環(huán)境或者人為因素的影響而存在一定誤差，適合初步判定；酶聯(lián)免疫吸附法，雖然靈敏度較高，但存在假陽性結(jié)果，重現(xiàn)性與特異性較差；HPLCMS法與GCMS法操作過程繁瑣檢測(cè)效率較低，難以滿足大批量的樣品檢測(cè)要求。

內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜（iEESIMS）技術(shù)直接將萃取劑導(dǎo)入到組織樣品內(nèi)部，可實(shí)現(xiàn)組織樣品內(nèi)部小分子代謝產(chǎn)物等組分的直接質(zhì)譜分析[20～23＼]。本研究基于iEESIMS技術(shù)，開發(fā)能直接判斷肉質(zhì)食品內(nèi)部沙丁胺醇與克倫特羅的內(nèi)部萃取電噴霧電離線性離子阱質(zhì)譜（iEESILTQMS）檢測(cè)平臺(tái)，建立對(duì)豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅進(jìn)行準(zhǔn)確定性及快速定量的檢測(cè)方法，并用于分析豬肉實(shí)際樣品。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

內(nèi)部萃取電噴霧電離源（iEESI）為本實(shí)驗(yàn)室自制；LTQXL線性離子阱質(zhì)譜儀并配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)ThermoScientific公司）；石英毛細(xì)管（內(nèi)徑0.10mm，外徑0.19mm，美國(guó)Agilent公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)ROE公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

標(biāo)準(zhǔn)品：克倫特羅（批號(hào)00435479）、沙丁胺醇（批號(hào)103578453245）均來自LaboratorienBerlinAdlershofGmbH公司。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量沙丁胺醇與克倫特羅各標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水使溶解，各制成10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，

18℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)品溶液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制成濃度為0.01，0.1，1，10，100和1000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2節(jié)操作，供iEESIMS檢測(cè)使用。

豬肉樣品由江西省體育科學(xué)研究所提供，經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)不含沙丁胺醇與克倫特羅等β受體激動(dòng)劑。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

iEESIMS原理如圖1所示。將石英毛細(xì)管插入組織樣品內(nèi)部，毛細(xì)管尖端與樣品頂端相距2mm；樣品頂端到質(zhì)譜進(jìn)樣口的距離為4～5mm；實(shí)驗(yàn)選擇甲醇水（1KG-3∶KG-51，V/V）作為萃取劑，將萃取溶劑由毛細(xì)管直接導(dǎo)入到豬肉樣品內(nèi)部，流速為1μL/min。

在微量進(jìn)樣針的鋼針部位施加正高電壓，在電場(chǎng)的作用下，豬肉樣品尖端產(chǎn)生大量承載豬肉化學(xué)組分的微小帶電液滴（電噴霧），微小帶電液滴中的分析物去溶劑化后得到待測(cè)物離子，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜儀設(shè)置為正離子檢測(cè)模式，PS05351.eps，Y，PZ#TS（（1HT5”SS

（iEESIMS））TS）質(zhì)量掃描范圍m/z50～400，離子源電壓為5kV，離子傳輸管溫度設(shè)置為150℃。在進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)，母離子隔離寬度為1Da，碰撞能量為16%～25%，碰撞時(shí)間為50ms；離子透鏡電壓及其它檢測(cè)參數(shù)由LTQTune系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。JP

2.3定性與定量分析

選擇采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[24，25＼]及iEESIMS方法均檢測(cè)不到沙丁胺醇或克倫特羅信號(hào)的豬肉為空白樣品；其次采用加標(biāo)法處理樣品，將空白豬肉樣本切成體積一致的小長(zhǎng)條（20mm×2mm×2mm，155mg）浸泡在沙丁胺醇與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液中，浸泡10h后進(jìn)行iEESIMS分析，獲得沙丁胺醇與克倫特羅的特征碎片，完成定性分析；最后采用加標(biāo)濃度法結(jié)合目標(biāo)離子的二級(jí)特征碎片離子信號(hào)進(jìn)行定量分析，建立在0.01～1000μg/kg范圍內(nèi)待測(cè)物離子特征碎片強(qiáng)度的對(duì)數(shù)（Y）與加標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)（X）之間的關(guān)系曲線，并采用此曲線完成定量分析。

3結(jié)果與討論

3.1豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的定性分析

圖2為在m/z50～400質(zhì)量范圍內(nèi)豬肉樣品的iEESIMS一級(jí)化學(xué)指紋譜圖。在實(shí)驗(yàn)條件下，沙丁胺醇（MW239）與克倫特羅（MW277）都能夠在iEESI過程中形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子，分別在一級(jí)質(zhì)譜中形成準(zhǔn)分子離子峰m/z240及277。但是，豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的含量遠(yuǎn)小于其它豬肉中常見組分，如氨基酸、磷脂等，所以在一級(jí)質(zhì)譜中（圖2），二者的信號(hào)幾乎淹沒在其它大量組分物質(zhì)的信號(hào)中。因此，僅依賴一級(jí)質(zhì)譜難以對(duì)豬肉中是否含有微量沙丁胺醇與克倫特羅進(jìn)行判斷。

為避免假陽性結(jié)果，按照實(shí)驗(yàn)條件對(duì)離子m/z240＼[Salbutamol+H＼]+和m/z277＼[Clenbuterol＼]+進(jìn)行CID實(shí)驗(yàn)，所獲得的MS/MS譜圖如圖3所示。在CID條件下，母離子m/z240主要碎片離子為m/z222，166和148，碎片離子m/z222是由母離子丟失一個(gè)水分子得到的，這與文獻(xiàn)＼[26＼]報(bào)道一致。經(jīng)分析推斷，碎片離子m/z166可能是由m/z222繼續(xù)失去＼[-C（CH3）3＼]（m/z57）得到，碎片離子m/z148是由m/z166失去一個(gè)水分子得到的。同樣地，選擇質(zhì)子化的m/z277進(jìn)行CID實(shí)驗(yàn)，主要碎片離子為m/z259和203，碎片離子m/z259由母離子丟失一個(gè)水分子后產(chǎn)生，該碎片離子不穩(wěn)定，繼續(xù)丟失＼[-C（CH3）3＼]（m/z57）得到碎片離子m/z203，這與文獻(xiàn)＼[27＼]報(bào)道一致。

3.2豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的定量分析

3.2.1線性范圍和檢出限實(shí)驗(yàn)配制10倍遞增的系列梯度濃度0.01～1000μg/L的沙丁胺醇與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定5次，以其凈響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度平均值與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)曲線。實(shí)驗(yàn)表明，在0.01～1000μg/L范圍內(nèi)，二級(jí)離子信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)數(shù)（Y）與加標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)（X）具有較好的線性關(guān)系。其中，沙丁胺醇線性回歸方程為Y=0.2314X+1.9076，相關(guān)系數(shù)R2=0.9940；克倫特羅線性回歸方程為Y=0.2223X+1.8940，相關(guān)系數(shù)R2=0.9938。

對(duì)浸泡在濃度為c的沙丁胺醇與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品的豬肉樣本進(jìn)行測(cè)定，獲得凈相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度S（n=5），并測(cè)得3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差3σ（S/N≥3，n=5）。根據(jù)LOD=c3σ/S[28，29＼]，當(dāng)c值取標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)時(shí)，計(jì)算本方法對(duì)兩種“瘦肉精”的檢出限。測(cè)得本方法對(duì)沙丁胺醇和克倫特羅的檢出限分別為6.2和9.8ng/kg。

3.2.2回收率和精密度在5份155mg豬肉樣品中，向1份樣品中加入10μL蒸餾水，向2份樣品中分別加入10μL濃度均為10μg/L的沙丁胺醇和克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，向另2份樣品中分別加入10μL濃度均為100μg/L的沙丁胺醇和克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液。設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液密度為1kg/L，將濃度單位統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為μg/kg。按照本方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定10次。加標(biāo)回收率為94.5%～103.0%，精密度在7.0%～9.5%之間，見表1。采用手動(dòng)進(jìn)樣，單個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間少于30s，分析速度較快。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中精密度較大的原因可能是由于手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)的不穩(wěn)定性造成的[30，31＼]。

3.3實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品在0.5min內(nèi)即獲得了檢測(cè)結(jié)果。為了獲得豬肉樣品中兩種“瘦肉精”的定量信息，單個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定10次，分別得到二級(jí)離子的凈響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，通過工作曲線，由線性回歸方程求出“瘦肉精”含量，得到所檢測(cè)5個(gè)批次樣品中沙丁胺醇與克倫特羅的含量。并同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法（GB/T5009.1922003，動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定）對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，5批豬肉樣品中兩種瘦肉精含量10次測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度在87.4%～107.6%之間，結(jié)果如表2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法分析速度快、樣品耗量少、靈敏度高，在大批量肉質(zhì)食品中“瘦肉精”的快速檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。

4結(jié)論

本研究建立了iEESIMS串聯(lián)質(zhì)譜直接檢測(cè)豬肉中痕量沙丁胺醇與克倫特羅含量的快速質(zhì)譜檢測(cè)方法，快速準(zhǔn)確地進(jìn)行豬肉中“瘦肉精”的定性與定量分析。本方法單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間小于30s，方法定量限分別為6.2和9.8ng/kg，加標(biāo)回收率94.5%～103.0%。單個(gè)豬肉樣品檢測(cè)耗量只需毫克級(jí)，可以達(dá)到“瘦肉精”檢測(cè)工作中節(jié)約樣品耗量、直接快速分析及多種類樣品檢測(cè)等基本要求，為食品監(jiān)管中“瘦肉精”檢測(cè)提供一種快速高效的質(zhì)譜分析新方法。

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AbstractSalbutamolandClenbuterolareoftenusedasβagonistsandillegallyaddedinpigfeed，resultinginporkcontaminatedandevenleadingathletesexcessiveexcitability.Therefore，ithasgreatsignificanceforestablishinganewrapiddetectionmethodofsalbutamolandclenbuterolinpork.Inthisstudy，internalextractionelectrosprayionizationmassspectrometry（iEESIMS）technologywasusedfordirectlyqualitativeandquantitativeanalysisofsalbutamolandclenbuterolinporktissueswithoutsamplepretreatment.Theresultsshowedthatthismethodhadahighsensitivitytosalbutamolandclenbuterolanalysiswithdetectionlimitsof（LOD）6.2and9.8ng/kg，respectively，whiletheanalysistimefordetectingsinglesampleandsingleindexwaslessthan30s.Inaconcentrationrangeof0.01-1000μg/kg，thelogarithmofsignalintensity（Y）andthelogarithmofconcentration（X）haveagoodlinearrelationship.Thismethodhasmanyadvantagessuchasrapidanalysis，lowsampleconsumptionandhighsensitivity，whichisidealforrapiddetectionoftracesalbutamolandclenbuterol.

KeywordsInternalextractionelectrosprayionization；Salbutamol；Clenbuterol；βAgonists；Organizationalanalysis

HQWT6JY（Received14July2016；accepted14September2016）

ThisworkwassupportedbytheprogramforchangjiangScholarsandInnovationResearchTeaminUniversities（No.IRT13054），JiangxiProvinceScienceandTechnologyLandmarkProject（No.KJLD13051），ChinaAcademyofMetrologyScienceandTechnology（No.40AKYKF1601）