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        質(zhì)譜快速分析豬肉中痕量沙丁胺醇及克倫特羅

        2017-04-25 22:49:24肖義坡盧海艷呂邵軍謝少賢王兆征
        分析化學(xué) 2016年11期
        關(guān)鍵詞:瘦肉精沙丁胺醇

        肖義坡 盧海艷 呂邵軍 謝少賢 王兆征 陳煥文

        摘要采用內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜(iEESIMS)技術(shù),在無需樣品預(yù)處理的前提下,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法直接對(duì)豬肉組織中沙丁胺醇與克倫特羅進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬肉組織中沙丁胺醇與克倫特羅具有較高的靈敏度,單個(gè)樣品單一指標(biāo)的檢測(cè)時(shí)間少于30s。在0.01~1000μg/kg濃度范圍內(nèi),信號(hào)強(qiáng)度對(duì)數(shù)(Y)與濃度對(duì)數(shù)(X)具有較好的線性關(guān)系,定量限分別為6.2和9.8ng/kg。本方法分析速度快、樣本耗量少、靈敏度高,適用于豬肉中痕量沙丁胺醇與克倫特羅等“瘦肉精”的快速檢測(cè)。

        關(guān)鍵詞內(nèi)部萃取電噴霧電離;沙丁胺醇;克倫特羅;“瘦肉精”;組織分析

        1引言

        “瘦肉精”是指一類具有相似結(jié)構(gòu)的β激動(dòng)劑化合物,常見的主要有沙丁胺醇與克倫特羅,臨床上一般用于治療休克和哮喘等疾病[1\]。由于該類藥物具有抑制動(dòng)物脂肪的合成、促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)和重新分配家畜脂肪與瘦肉比例等作用,常被非法添加在家畜的飼料中來提高畜牧生產(chǎn)效率。根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào),沙丁胺醇與克倫特羅為禁用物質(zhì),在食品(肉中)不得檢出。常規(guī)情況下豬肉中“瘦肉精”檢測(cè)為陽性的含量水平在0.1~100μg/kg之間。人食用含沙丁胺醇與克倫特羅等“瘦肉精”成分的肉類產(chǎn)品后,會(huì)導(dǎo)致血壓升高、心率加快等反應(yīng),甚至影響水上及部分田徑運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的成績(jī),長(zhǎng)期服用也對(duì)心血管系統(tǒng)帶來嚴(yán)重的危害,甚至導(dǎo)致生命危險(xiǎn)[2\]。因此,建立一種肉質(zhì)食品中“瘦肉精”的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,對(duì)保障食品安全具有重要意義[3~6\]。

        目前,動(dòng)物組織中“瘦肉精”的檢測(cè)方法主要包括膠體金免疫層析法[7,8\]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELSA)[9,10\]和表面等離子體共振生物芯片[11,12\]、氣相色譜質(zhì)譜法(GCMS)[13,14\]、高效液相色譜質(zhì)譜法(HPLCMS)[15~17\]、高效液相色譜法[18,19\]等。膠體金免疫層析法,主要用于大量篩查,但檢測(cè)結(jié)果因受環(huán)境或者人為因素的影響而存在一定誤差,適合初步判定;酶聯(lián)免疫吸附法,雖然靈敏度較高,但存在假陽性結(jié)果,重現(xiàn)性與特異性較差;HPLCMS法與GCMS法操作過程繁瑣檢測(cè)效率較低,難以滿足大批量的樣品檢測(cè)要求。

        內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜(iEESIMS)技術(shù)直接將萃取劑導(dǎo)入到組織樣品內(nèi)部,可實(shí)現(xiàn)組織樣品內(nèi)部小分子代謝產(chǎn)物等組分的直接質(zhì)譜分析[20~23\]。本研究基于iEESIMS技術(shù),開發(fā)能直接判斷肉質(zhì)食品內(nèi)部沙丁胺醇與克倫特羅的內(nèi)部萃取電噴霧電離線性離子阱質(zhì)譜(iEESILTQMS)檢測(cè)平臺(tái),建立對(duì)豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅進(jìn)行準(zhǔn)確定性及快速定量的檢測(cè)方法,并用于分析豬肉實(shí)際樣品。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        內(nèi)部萃取電噴霧電離源(iEESI)為本實(shí)驗(yàn)室自制;LTQXL線性離子阱質(zhì)譜儀并配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)ThermoScientific公司);石英毛細(xì)管(內(nèi)徑0.10mm,外徑0.19mm,美國(guó)Agilent公司);甲醇(色譜純,美國(guó)ROE公司);實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

        標(biāo)準(zhǔn)品:克倫特羅(批號(hào)00435479)、沙丁胺醇(批號(hào)103578453245)均來自LaboratorienBerlinAdlershofGmbH公司。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取適量沙丁胺醇與克倫特羅各標(biāo)準(zhǔn)品,加蒸餾水使溶解,各制成10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,

        18℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)品溶液:將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制成濃度為0.01,0.1,1,10,100和1000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.2節(jié)操作,供iEESIMS檢測(cè)使用。

        豬肉樣品由江西省體育科學(xué)研究所提供,經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)不含沙丁胺醇與克倫特羅等β受體激動(dòng)劑。

        2.2實(shí)驗(yàn)方法

        iEESIMS原理如圖1所示。將石英毛細(xì)管插入組織樣品內(nèi)部,毛細(xì)管尖端與樣品頂端相距2mm;樣品頂端到質(zhì)譜進(jìn)樣口的距離為4~5mm;實(shí)驗(yàn)選擇甲醇水(1KG-3∶KG-51,V/V)作為萃取劑,將萃取溶劑由毛細(xì)管直接導(dǎo)入到豬肉樣品內(nèi)部,流速為1μL/min。

        在微量進(jìn)樣針的鋼針部位施加正高電壓,在電場(chǎng)的作用下,豬肉樣品尖端產(chǎn)生大量承載豬肉化學(xué)組分的微小帶電液滴(電噴霧),微小帶電液滴中的分析物去溶劑化后得到待測(cè)物離子,進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜儀設(shè)置為正離子檢測(cè)模式,PS05351.eps,Y,PZ#TS((1HT5”SS

        (iEESIMS))TS)質(zhì)量掃描范圍m/z50~400,離子源電壓為5kV,離子傳輸管溫度設(shè)置為150℃。在進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí),母離子隔離寬度為1Da,碰撞能量為16%~25%,碰撞時(shí)間為50ms;離子透鏡電壓及其它檢測(cè)參數(shù)由LTQTune系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。JP

        2.3定性與定量分析

        選擇采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[24,25\]及iEESIMS方法均檢測(cè)不到沙丁胺醇或克倫特羅信號(hào)的豬肉為空白樣品;其次采用加標(biāo)法處理樣品,將空白豬肉樣本切成體積一致的小長(zhǎng)條(20mm×2mm×2mm,155mg)浸泡在沙丁胺醇與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液中,浸泡10h后進(jìn)行iEESIMS分析,獲得沙丁胺醇與克倫特羅的特征碎片,完成定性分析;最后采用加標(biāo)濃度法結(jié)合目標(biāo)離子的二級(jí)特征碎片離子信號(hào)進(jìn)行定量分析,建立在0.01~1000μg/kg范圍內(nèi)待測(cè)物離子特征碎片強(qiáng)度的對(duì)數(shù)(Y)與加標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)(X)之間的關(guān)系曲線,并采用此曲線完成定量分析。

        3結(jié)果與討論

        3.1豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的定性分析

        圖2為在m/z50~400質(zhì)量范圍內(nèi)豬肉樣品的iEESIMS一級(jí)化學(xué)指紋譜圖。在實(shí)驗(yàn)條件下,沙丁胺醇(MW239)與克倫特羅(MW277)都能夠在iEESI過程中形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子,分別在一級(jí)質(zhì)譜中形成準(zhǔn)分子離子峰m/z240及277。但是,豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的含量遠(yuǎn)小于其它豬肉中常見組分,如氨基酸、磷脂等,所以在一級(jí)質(zhì)譜中(圖2),二者的信號(hào)幾乎淹沒在其它大量組分物質(zhì)的信號(hào)中。因此,僅依賴一級(jí)質(zhì)譜難以對(duì)豬肉中是否含有微量沙丁胺醇與克倫特羅進(jìn)行判斷。

        為避免假陽性結(jié)果,按照實(shí)驗(yàn)條件對(duì)離子m/z240\[Salbutamol+H\]+和m/z277\[Clenbuterol\]+進(jìn)行CID實(shí)驗(yàn),所獲得的MS/MS譜圖如圖3所示。在CID條件下,母離子m/z240主要碎片離子為m/z222,166和148,碎片離子m/z222是由母離子丟失一個(gè)水分子得到的,這與文獻(xiàn)\[26\]報(bào)道一致。經(jīng)分析推斷,碎片離子m/z166可能是由m/z222繼續(xù)失去\[-C(CH3)3\](m/z57)得到,碎片離子m/z148是由m/z166失去一個(gè)水分子得到的。同樣地,選擇質(zhì)子化的m/z277進(jìn)行CID實(shí)驗(yàn),主要碎片離子為m/z259和203,碎片離子m/z259由母離子丟失一個(gè)水分子后產(chǎn)生,該碎片離子不穩(wěn)定,繼續(xù)丟失\[-C(CH3)3\](m/z57)得到碎片離子m/z203,這與文獻(xiàn)\[27\]報(bào)道一致。

        3.2豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的定量分析

        3.2.1線性范圍和檢出限實(shí)驗(yàn)配制10倍遞增的系列梯度濃度0.01~1000μg/L的沙丁胺醇與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定5次,以其凈響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度平均值與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)曲線。實(shí)驗(yàn)表明,在0.01~1000μg/L范圍內(nèi),二級(jí)離子信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)數(shù)(Y)與加標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)(X)具有較好的線性關(guān)系。其中,沙丁胺醇線性回歸方程為Y=0.2314X+1.9076,相關(guān)系數(shù)R2=0.9940;克倫特羅線性回歸方程為Y=0.2223X+1.8940,相關(guān)系數(shù)R2=0.9938。

        對(duì)浸泡在濃度為c的沙丁胺醇與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品的豬肉樣本進(jìn)行測(cè)定,獲得凈相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度S(n=5),并測(cè)得3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差3σ(S/N≥3,n=5)。根據(jù)LOD=c3σ/S[28,29\],當(dāng)c值取標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)時(shí),計(jì)算本方法對(duì)兩種“瘦肉精”的檢出限。測(cè)得本方法對(duì)沙丁胺醇和克倫特羅的檢出限分別為6.2和9.8ng/kg。

        3.2.2回收率和精密度在5份155mg豬肉樣品中,向1份樣品中加入10μL蒸餾水,向2份樣品中分別加入10μL濃度均為10μg/L的沙丁胺醇和克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,向另2份樣品中分別加入10μL濃度均為100μg/L的沙丁胺醇和克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液。設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液密度為1kg/L,將濃度單位統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為μg/kg。按照本方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定10次。加標(biāo)回收率為94.5%~103.0%,精密度在7.0%~9.5%之間,見表1。采用手動(dòng)進(jìn)樣,單個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間少于30s,分析速度較快。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中精密度較大的原因可能是由于手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)的不穩(wěn)定性造成的[30,31\]。

        3.3實(shí)際樣品分析

        采用本方法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品在0.5min內(nèi)即獲得了檢測(cè)結(jié)果。為了獲得豬肉樣品中兩種“瘦肉精”的定量信息,單個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定10次,分別得到二級(jí)離子的凈響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度,通過工作曲線,由線性回歸方程求出“瘦肉精”含量,得到所檢測(cè)5個(gè)批次樣品中沙丁胺醇與克倫特羅的含量。并同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法(GB/T5009.1922003,動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果表明,5批豬肉樣品中兩種瘦肉精含量10次測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度在87.4%~107.6%之間,結(jié)果如表2所示。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法分析速度快、樣品耗量少、靈敏度高,在大批量肉質(zhì)食品中“瘦肉精”的快速檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。

        4結(jié)論

        本研究建立了iEESIMS串聯(lián)質(zhì)譜直接檢測(cè)豬肉中痕量沙丁胺醇與克倫特羅含量的快速質(zhì)譜檢測(cè)方法,快速準(zhǔn)確地進(jìn)行豬肉中“瘦肉精”的定性與定量分析。本方法單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間小于30s,方法定量限分別為6.2和9.8ng/kg,加標(biāo)回收率94.5%~103.0%。單個(gè)豬肉樣品檢測(cè)耗量只需毫克級(jí),可以達(dá)到“瘦肉精”檢測(cè)工作中節(jié)約樣品耗量、直接快速分析及多種類樣品檢測(cè)等基本要求,為食品監(jiān)管中“瘦肉精”檢測(cè)提供一種快速高效的質(zhì)譜分析新方法。

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        29ZhangH,ZhuL,LuoL,WangN,ChinginK,GuoX,ChenH.J.Agric.FoodChem.,2013,61(45):10691-10698

        30ZHANGYan,PANSuSu,ZHUZhiQiang,ZHANGXingLei,XUGaoSi,WEIYiPing,CHENHuanWen,DINGJianHua.ChineseJ.Anal.Chem.,2013,41(8):1220-1225

        張燕,潘素素,朱志強(qiáng),張興磊,徐高四,魏益平,陳煥文,丁健樺.HTK分析化學(xué),2013,41(8):1220-1225

        31ZHANGYan,SHENYan,HANChao,CHENHuanWen,ZHANGXingLei.Mod.Sci.Instrum.,2011,(5):86-90

        張燕,沈燕,韓超,陳煥文,張興磊.HTK現(xiàn)代科學(xué)儀器,2011,(5):86-90)

        AbstractSalbutamolandClenbuterolareoftenusedasβagonistsandillegallyaddedinpigfeed,resultinginporkcontaminatedandevenleadingathletesexcessiveexcitability.Therefore,ithasgreatsignificanceforestablishinganewrapiddetectionmethodofsalbutamolandclenbuterolinpork.Inthisstudy,internalextractionelectrosprayionizationmassspectrometry(iEESIMS)technologywasusedfordirectlyqualitativeandquantitativeanalysisofsalbutamolandclenbuterolinporktissueswithoutsamplepretreatment.Theresultsshowedthatthismethodhadahighsensitivitytosalbutamolandclenbuterolanalysiswithdetectionlimitsof(LOD)6.2and9.8ng/kg,respectively,whiletheanalysistimefordetectingsinglesampleandsingleindexwaslessthan30s.Inaconcentrationrangeof0.01-1000μg/kg,thelogarithmofsignalintensity(Y)andthelogarithmofconcentration(X)haveagoodlinearrelationship.Thismethodhasmanyadvantagessuchasrapidanalysis,lowsampleconsumptionandhighsensitivity,whichisidealforrapiddetectionoftracesalbutamolandclenbuterol.

        KeywordsInternalextractionelectrosprayionization;Salbutamol;Clenbuterol;βAgonists;Organizationalanalysis

        HQWT6JY(Received14July2016;accepted14September2016)

        ThisworkwassupportedbytheprogramforchangjiangScholarsandInnovationResearchTeaminUniversities(No.IRT13054),JiangxiProvinceScienceandTechnologyLandmarkProject(No.KJLD13051),ChinaAcademyofMetrologyScienceandTechnology(No.40AKYKF1601)

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