趙 晨 史 競(jìng) 汪 洋 張 倩 張曉琳（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

清除玉米赤霉烯酮菌株的篩選、鑒定及機(jī)理初探

趙 晨 史 競(jìng) 汪 洋 張 倩 張曉琳
（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

通過(guò)對(duì)我國(guó)赤霉病高發(fā)區(qū)田間取樣，篩選具有清除玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）活性的菌株。獲得2株清除效果較好的細(xì)菌A5、D6，其中D6活性較高。通過(guò)生理特征分析、16S rDNA序列比對(duì)、G含量及BIOLOG分析等方法，2株菌都被鑒定為紅球菌，DNA-DNA同源性分析表明，這2株菌均為Rhodococ cus qingshengii。滅活細(xì)胞與ZEN共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞無(wú)清除ZEN能力，證明A5、D6不具有吸附ZEN的活性；菌液上清液及細(xì)胞內(nèi)容物與ZEN共培養(yǎng)，證明D6菌株中具有清除ZEN的活性成分為胞內(nèi)蛋白類物質(zhì)。同時(shí)通過(guò)HPLC熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)疑似ZEN代謝產(chǎn)物峰。通過(guò)篩選獲得了2株可通過(guò)胞內(nèi)酶活降解ZEN的紅球菌為生物法清除真菌毒素提供參考。

玉米赤霉烯酮 紅球菌 ZEN清除

玉米赤霉烯酮（ZEN，又名F-2毒素）最初由Baldwin等從發(fā)霉玉米中分離得到，是鐮刀菌屬真菌所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有二羥基苯甲酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，目前已知有11種以上的衍生物［1］。ZEN在自然界中廣泛存在，是污染范圍最廣泛的一種毒素，在谷物以及農(nóng)副產(chǎn)品中都能檢測(cè)到。ZEN主要具有雌激素毒性，影響家畜、家禽的生殖性能，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。研究表明，ZEN也具有強(qiáng)致癌性，可引起食道癌、乳腺癌等［2］。因此，ZEN污染將給人類的健康及經(jīng)濟(jì)帶來(lái)雙重威脅，如何對(duì)其進(jìn)行清除具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前清除ZEN的方法主要分為物理法、化學(xué)法、生物法等。物理法主要包括熱處理、物理吸附及輻照法［3］，化學(xué)法包括有機(jī)溶劑及臭氧處理等［4-5］。這些方法雖然能清除部分毒素，但高溫會(huì)使原料營(yíng)養(yǎng)成分損失；吸附法在清除ZEN的同時(shí)也吸附一定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且清除不徹底會(huì)造成二次污染；化學(xué)試劑的添加具有潛在危害性，這些傳統(tǒng)處理方法存在不可避免的局限性，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。生物法清除毒素主要指通過(guò)微生物吸附及降解的方法對(duì)真菌毒素進(jìn)行降解或脫毒。微生物利用自身產(chǎn)生的活性物質(zhì)（蛋白類物質(zhì)）使真菌毒素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，成為低毒或無(wú)毒的降解產(chǎn)物。這種脫毒方式不會(huì)破壞原料中其他成分，因此生物降解脫毒是有效去除ZEN的可行方法。

許多微生物都具有降解真菌毒素的能力。ZE可被不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.SM04）［6］及惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida ZEA-1）［7］降解。對(duì)粉紅螺旋聚孢霉（Clonastachys rosea IFO7063）降解ZE機(jī)理的深入研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)C．rosea降解的ZEN產(chǎn)物無(wú)任何雌激素活性，是由一種水解酶zhd101起到降解作用［8］。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)很多曲霉（黑曲霉米曲霉）及根霉菌具有轉(zhuǎn)化ZEN結(jié)構(gòu)活性，其中有些菌株可將ZEN轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低雌激素活性結(jié)構(gòu)，而有些將其轉(zhuǎn)化為毒性更高的結(jié)構(gòu)［9-10］。

本研究通過(guò)對(duì)赤霉病病情較重地區(qū)的田間土壤或植物取樣，從中篩選具有清除ZEN能力的菌株，成功獲得能高效降解ZEN的菌株A5、D6。進(jìn)而對(duì)菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)及生理生化鑒定，并對(duì)其清除ZEN的特性進(jìn)行初步研究，為ZEN的生物脫毒及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

樣品采自四川、河北、河南、江蘇等赤霉病高發(fā)地區(qū)土壤樣品215個(gè)。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：每升中 NH4NO31 g，（NH4）2SO 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.41 g，KH2PO40.5 g，K2HPO1.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.037 g，pH 7.0～7.2，121℃滅菌30 min；LB瓊脂培養(yǎng)基：每升中含Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，121℃滅菌30 min。

1.1.3 主要化學(xué)試劑

Tryptone、Yeast extract：英國(guó)Oxoid公司；色譜純乙腈、甲醇：Dikma公司；BUG培養(yǎng)基：美國(guó)BIOLOG；ZEN（純度約為97%）：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)宋淵老師贈(zèng)予。

1.2 儀器與設(shè)備

自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Biolog MicroStation：美國(guó)BIOLOG公司；515／474高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；Synergy HT微孔板讀數(shù)儀：美國(guó)Biotek公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮降解菌株的富集、初篩與復(fù)篩

取樣品5 g，加45 mL無(wú)菌水，高速勻漿5 min后靜置10 min，取上清以10%的接種量接種于裝有600 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的96深孔板中，以10 μg／mL ZEN為唯一碳源。在30℃、200 r／min條件下培養(yǎng)72 h后再以10%接種量轉(zhuǎn)接至含有ZEN濃度遞增（ZEN濃度分別為20、40、80、100 μg／mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，取上清檢測(cè)ZEN含量，同時(shí)以未接菌的含有相同ZEN濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。將對(duì)ZEN有降解效果的96深孔板中的混合菌液涂布于LB平板上，30℃倒置培養(yǎng)72 h后，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落接種于含10 μg／mL ZEN的600 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72 h后HPLC檢測(cè)ZEN含量，初步篩選具有清除ZEN活性的菌株。

將初篩得到的ZEN降解菌株用含10 μg／mL ZEN的600 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，離心后用等體積的無(wú)菌水重懸菌體，以10%接種量接種于以10 μg／mL ZEN為唯一碳源的2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，同時(shí)以未接菌的相同ZEN濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白陰性對(duì)照，培養(yǎng)72 h取樣，HPLC檢測(cè)ZEN含量，進(jìn)一步確定具有清除ZEN毒素能力的菌株。

1.3.2 玉米赤霉烯酮的HPLC檢測(cè)

前處理：取300 μL待測(cè)菌液，加入300 μL甲醇，劇烈震蕩后4℃靜置1 h。于14 000 r／min離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

檢測(cè)條件：安捷倫 C18柱（5.0 μm，150 mm× 4.6 mm）；流動(dòng)相為乙腈∶水∶甲醇=46∶46∶8；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.3.3 16S rDNA序列分析

采用通用引物對(duì)菌株的基因組進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，引物由Invitrogen公司合成，F(xiàn)9：GAGTTTGATCCTGGCTCAG；R1544：AGAAAGGAGGTGATCCA。使用LA Taq（Takara）試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)Mega 6.0分析軟件構(gòu)建基于紅球菌特征菌株與A5、D6菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

（G+C）含量及DNA-DNA同源性分析均交由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）測(cè)定。菌株基因組DNA的（G+C）含量測(cè)定使用溶解溫度（Tm）法，以大腸埃希氏菌（E．coil K12，CGMCC 1.365）為參比對(duì)照，所用儀器為Perkin／Elmer公司Lambda35 UV／VIS Spectrometer；用PTP-1數(shù)字溫度控制儀控溫。步驟如下：

1）菌株經(jīng)活化后在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，4 000 r／min離心20 min，收集菌體2～3 g，加入1×TES溶液（Tris-HCl 10 mmol／L，EDTA 1 mmol／L，SDS 0.1 mmol／L）懸浮菌體，同樣條件下離心洗滌菌體3～4次；

2）參考文獻(xiàn)［11］的方法提取菌株DNA，將待測(cè)DNA稀釋至OD260 nm值于0.3～0.4之間；

3）在波長(zhǎng)260 nm首先記錄25℃的OD值，然后設(shè)定升溫程序，從65℃開(kāi)始到95℃，期間每分鐘升高1℃；

4）OD值上升表示變性開(kāi)始，記錄比色皿溫度和OD值，直至OD值不變表示變性完畢；

5）根據(jù)熱變性曲線，得出熔鏈溫度（Tm），計(jì)算（G+C）含量。在0.1×SSC溶液中計(jì)算公式為：

（G+C）=（G+C）1.365+2.08（Tm未知-Tm1.365）

國(guó)內(nèi)女性主義翻譯研究主題多樣、視角豐富、成果顯著,為便于分析與描述,下面按照研究主題將筆者整理出的559篇期刊論文大致分為理論研究、實(shí)證研究和譯史研究三種類型,見(jiàn)表4。

DNA-DNA同源性分析采用液相復(fù)性速率方法測(cè)定，所使用儀器與（G+C）含量測(cè)定相同。步驟如下：

1）將提取的DNA樣品置于水浴中，超聲波處理24 min，將DNA樣品剪切成為2～5×105Da的片段，稀釋使其 OD260 nm值處于1.8～2.0之間，樣品間OD260 nm值須一致；

2）分光光度計(jì)檢測(cè)DNA。進(jìn)入U(xiǎn)V Winlab程序，在方法窗口選擇時(shí)間驅(qū)動(dòng) TD方法，通過(guò)Timed.Inst.Sample.設(shè)置頁(yè)來(lái)設(shè)定合適的測(cè)定參數(shù)。測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm，測(cè)定時(shí)間30 min。按照已經(jīng)測(cè)定的（G+C）含量計(jì)算最適復(fù)性溫度（optimal renaturation temperature，TOR），將比色皿的溫度穩(wěn)定在最適復(fù)性溫度。按照公式：TOR=0.51×（G+ C）+47計(jì)算。

3）取2株菌DNA樣品各400 μL分別裝在2個(gè)離心管中，另取2株菌DNA樣品各200 μL進(jìn)行混合。單一和混合DNA樣品測(cè)試前分別通過(guò)PTP-1控溫系統(tǒng)設(shè)置100℃變性15 min，然后降溫至最適復(fù)性溫度。記錄OD260 nm值，待反應(yīng)30 min時(shí)停止讀數(shù)，全部過(guò)程樣品的溫度都不得低于TOR，最終獲得隨時(shí)間延長(zhǎng)光吸收值減少的直線。

4）根據(jù)UV Winlab，在其中的Algotithm欄中選擇Slope，得出復(fù)興數(shù)率（V），根據(jù)公式計(jì)算同源雜交率（H）=4Vm-（Va+Vb）／2×100%。

1.3.5 BIOLOG細(xì)菌鑒定

將待測(cè)菌株接種到BUG培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)36 h，傳代2～3次，充分活化菌株。用接種液（購(gòu)自BIOLOG公司）潤(rùn)濕的無(wú)菌棉輕輕擦下培養(yǎng)基上的菌落，制成菌懸液，使用BIOLOG濁度儀測(cè)定濁度，將濁度控制在標(biāo)準(zhǔn)的±3.0%之內(nèi)。將菌懸液分裝在GENⅢ鑒定板的各孔中，蓋上鑒定板蓋，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于4～6 h和16～24 h時(shí)取出鑒定板放入BIOLOG檢測(cè)儀器中，讀取碳源利用狀況，系統(tǒng)將自動(dòng)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。

1.3.6 ZEN清除試驗(yàn)

1.3.6.1 細(xì)胞ZEN吸附試驗(yàn)

將菌株在裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)至OD600 nm=2.0，將菌液在 121℃條件下濕熱滅菌30 min，冷卻到室溫后，使用生理鹽水洗5次，再用等體積含有20 μg／mL ZEN的PBS緩沖液懸浮，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)上清液ZEN殘留量。

1.3.6.2 清除ZEN活性物質(zhì)的定位與定性

定位：將菌株在裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)至OD600 nm=2.0，離心收集上清液；細(xì)胞沉淀用等體積Tris-HCl緩沖液洗3次后懸浮，使用高壓破碎儀破碎3次，并于4℃12 000 r／min離心，收集破碎細(xì)胞上清液。將菌液上清液及破碎細(xì)胞上清液分別經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，加入20 μg／mL ZEN共培養(yǎng)，定時(shí)檢測(cè)殘留情況。

定性：將獲得的細(xì)胞內(nèi)容物等分，一份于121℃濕熱滅菌30 min，另一份用50 μg／mL蛋白酶K處理30 min，處理過(guò)后的細(xì)胞內(nèi)容物再分別與20 μg／mL ZEN共培養(yǎng)24 h，不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)ZEN含量。

1.3.7 ZEN代謝產(chǎn)物雌激素檢測(cè)

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae BLYES（購(gòu)自美國(guó)490BioTech公司），BLYES培養(yǎng)方法及待測(cè)樣品稀釋梯度按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行［12-13］。樣品為D6菌株與20 μg／mL ZEN共培養(yǎng)8 h菌液，將20 μL待測(cè)物稀釋液置于白色96孔板中，立即加入200 μL培養(yǎng)好的BLYES培養(yǎng)液（OD600 nm=0.6～0.8），于30℃200 r／min下培養(yǎng)6 h，使用微孔板讀數(shù)儀對(duì)發(fā)光值讀數(shù)采集。陽(yáng)性參照為添加20 μg／mL ZEN的LB培養(yǎng)基，陰性參照為D6菌株與LB培養(yǎng)基，陽(yáng)性及陰性參照的培養(yǎng)條件及稀釋梯度與待測(cè)樣品相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除ZEN菌株的篩選

將采集的樣品與無(wú)菌水混合后，按一定比例接種于僅含有ZEN為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)。通過(guò)初篩和復(fù)篩后獲得兩株清除ZEN能力較好的細(xì)菌（表1）。

表1 具有清除ZEN活性的菌株復(fù)篩結(jié)果及樣品來(lái)源

2.2 ZEN降解菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)分析

通過(guò)革蘭氏染色及顯微鏡觀察，A5、D6菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌株，菌體呈桿狀，在固體培養(yǎng)基平板上菌落為圓形（圖1、圖2）。主要生理特性如表2所示。A5、D6菌株生理特性較相似，需要進(jìn)一步對(duì)菌株種屬進(jìn)行鑒定。

圖1 A5菌落形態(tài)與顯微形態(tài)

圖2 D6菌落形態(tài)與顯微形態(tài)

表2 菌株A5、D6主要生理特征

2.2.2 16S rDNA序列分析

以菌株的總DNA為模板，使用特異性引物經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩株菌序列同源性為99%。將兩株菌的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，表現(xiàn)出與紅球菌較高的相似性（最高為97%），可能歸屬于紅球菌屬。進(jìn)一步選取紅球菌特征菌株（Type strain）及同源性較高菌株的16S rDNA序列與A5、D6菌株的16S r DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖中可發(fā)現(xiàn)A5、D6親緣性接近，且與Rhodococcus qingshengii、Rhodococcus jialingiae在同一分支上。

2.2.3 （G+C）含量測(cè)定

A5、D6的Tm值及（G+C）含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 A5、D6（G+C）含量

（G+C）含量是細(xì)菌分類鑒定中的基本標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)種屬親緣關(guān)系的判定原則：1株菌的（G+C）含量差異在2%以內(nèi)是無(wú)意義的，由以上結(jié)果得出A5、D6菌株的（G+C）含量差異為0.25%，因此這2株菌很可能為同一種菌。紅球菌的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)范圍是58.5%～73%，結(jié)合16S rDNA結(jié)果，2株菌可判定為紅球菌。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2.4 BIOLOG系統(tǒng)鑒定

通過(guò)BIOLOG檢測(cè)，2株菌均被鑒定為馬紅球菌（R．equi）。但從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，R．equi 與A5、D6菌株親緣較遠(yuǎn)。由于BIOLOG系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)中并沒(méi)有R．qingshengii或R．jialingiae信息，可能沒(méi)有準(zhǔn)確反映出待測(cè)菌株的種屬。

表4 菌株的BIOLOG系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2.2.5 DNA-DNA雜交同源性驗(yàn)證

通過(guò)以上鑒定手段，仍無(wú)法準(zhǔn)確確定A5、D6是否為紅球菌新種，但A5、D6基本可確定為Rhodococcus中同一菌種。選取D6作為待測(cè)菌株與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上相鄰菌株 R．qingshengii、R．jialingiae、R．baikonurensis、R．erythropolis和 R．globerulus進(jìn)行DNA-DNA雜交，得出與D6菌株同源雜交率分別為84.70%、86.19%、44.32%、47.60%和31.12%，根據(jù)DNA-DNA同源雜交率大于70%即可判斷為同一菌種的原則并結(jié)合上述系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，可判定D6應(yīng)歸屬為R．qingshengii或R．jialingiae。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，R．qingshengii與R．jialingiae雖然之前被認(rèn)為是不同菌種［14-15］，但經(jīng)試驗(yàn)證明它們實(shí)為同一菌種［16］。由于R．qingshengii被鑒定在先，因此本研究中A5、D6菌株應(yīng)歸為R．qingshengii。

2.3 A5、D6菌株清除ZEN特性分析

2.3.1 菌株對(duì)ZEN清除效果分析

將2株紅球菌分別以1%接種量接入含有20 μg／mL ZEN的30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。定時(shí)取樣，發(fā)現(xiàn)ZEN濃度在與菌株共培養(yǎng)過(guò)程中有不同程度降低。其中，ZEN在D6菌株培養(yǎng)8 h后已檢測(cè)不到，而在培養(yǎng)了24 h的A5菌液中還有少量殘留（圖4）。經(jīng)過(guò)多次驗(yàn)證，D6菌株的ZEN清除的效果要優(yōu)于A5菌株。雖然這2株菌的其他生理特征很接近，但在ZEN清除能力方面存在明顯差異，而A5、D6菌株在MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)性能基本相同，因此，清除ZE能力的差異很可能與菌株來(lái)源地土樣受ZEN污染程度不同有關(guān)。

圖4 A5、D6菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中清除ZEN的曲線

2.3.2 A5、D6菌株清除ZEN方式的定性

微生物清除ZEN主要有兩方面途徑，一是生物降解或轉(zhuǎn)化；二是物理吸附（微生物細(xì)胞壁具有吸附毒素特性）。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁上含有大量肽聚糖，失活會(huì)使細(xì)胞壁孔徑變大，增加對(duì)物質(zhì)吸附能力。為驗(yàn)證A5、D6菌株對(duì)ZEN的清除是否是由于物理吸附引起的，將2株菌的失活細(xì)胞與ZEN共培養(yǎng)，對(duì)ZEN的吸附情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與含有20 μg／mL ZEN的PBS的參照（CK）比對(duì)，2株菌失活細(xì)胞菌液中ZEN濃度均未降低（圖5），表明A5、D菌株細(xì)胞對(duì)ZEN無(wú)吸附。因此，A5、D6菌株清除ZEN的方式可能是由于降解作用或使ZEN結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

圖5 A5、D6菌株對(duì)ZEN吸附能力驗(yàn)證

2.3.3 清除ZEN活性物質(zhì)的定位與定性

由于A5、D6菌株均是R．qingshengii，且D6較A5菌株清除ZEN效果更好，因此，本研究對(duì)D6菌株進(jìn)行了更加深入的探討。按照1.3.6.2準(zhǔn)備上清液及細(xì)胞內(nèi)容物。在上清液試驗(yàn)組中，ZEN濃度在培養(yǎng)前后無(wú)變化，而在細(xì)胞內(nèi)容物的試驗(yàn)組中，ZEN濃度隨時(shí)間逐漸降低，在24 h已檢測(cè)不到（圖6），由此推斷，D6菌株是通過(guò)胞內(nèi)的活性物質(zhì)清除ZEN。

細(xì)胞內(nèi)容物經(jīng)加熱失活或蛋白酶K處理后與2 μg／mL ZEN共培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)ZEN濃度在培養(yǎng)前后不變；未經(jīng)處理的細(xì)胞內(nèi)容物與20 μg／mL ZEN共培養(yǎng)24 h后已檢測(cè)不到ZEN，且有隨時(shí)間逐漸較少的趨勢(shì)（圖6）。表明D6菌株中清除ZEN的活性物質(zhì)在加熱或蛋白酶K處理?xiàng)l件下失活。因此該活性組分應(yīng)為蛋白類物質(zhì)。

圖6 D6菌株內(nèi)容物經(jīng)不同處理及菌株上清液清除ZEN曲線

2.3.4 ZEN代謝產(chǎn)物初探

D6菌株所產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)具有特異性酶活，可將ZEN降解或?qū)⑵浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。20 μg／mL ZEN與D6菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)8 h后，發(fā)現(xiàn)已檢測(cè)不到ZEN，但在1.5 min附近雜質(zhì)峰變大，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，該雜質(zhì)峰與ZEN有“此消彼長(zhǎng)”的趨勢(shì)（圖7）。該現(xiàn)象可能是由ZEN代謝產(chǎn)物引起，其出峰時(shí)間與雜質(zhì)峰重合，所以D6菌株對(duì)ZEN的清除很可能是通過(guò)降解途徑或?qū)EN轉(zhuǎn)化為其他結(jié)構(gòu)。目前關(guān)于紅球菌（Rhodococcoci）屬多個(gè)菌株降解ZEN也有報(bào)道，這些菌株可使之轉(zhuǎn)化為無(wú)雌激素活性結(jié)構(gòu)［13］，但降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)還未被解析。本研究中使用的熒光檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分降解產(chǎn)物峰與雜質(zhì)峰，需進(jìn)一步優(yōu)化條件分離降解產(chǎn)物，以便于對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖7 D6菌株降解ZEN的HPLC圖譜

2.3.5 ZEN代謝產(chǎn)物雌激素活性驗(yàn)證

真菌毒素降解產(chǎn)物或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化物的雌激素毒性存在減少或提高的可能，因此將ZEN與D6菌株共培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物雌激素活性進(jìn)行驗(yàn)證，只有毒素活性降低才能有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。釀酒酵母BLYES為受雌激素誘導(dǎo)發(fā)光基因工程菌，發(fā)光值越高表示雌激素活性越強(qiáng)，可用來(lái)檢測(cè)環(huán)境樣品雌激素水平［12］。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，樣品組ZEN+D6的發(fā)光值與陰性對(duì)照LB+D6具有相似發(fā)光值且遠(yuǎn)低于陽(yáng)性參照LB+ ZEN。待測(cè)物稀釋范圍為 2.5×10-5～1×10-3μg／mL時(shí)，陽(yáng)性參照的發(fā)光值隨ZEN濃度提高而遞增，而樣品組與陰性參照發(fā)光值則無(wú)明顯變化，說(shuō)明經(jīng)與D6菌株共培養(yǎng)后，ZEN被降解或轉(zhuǎn)化為無(wú)雌激素活物質(zhì)（圖8）。

圖8 3種樣品在釀酒酵母BLYES檢測(cè)系統(tǒng)中的熒光值

3 結(jié)論

通過(guò)高通量篩選，從我國(guó)赤霉病發(fā)作嚴(yán)重的農(nóng)作物及土壤中篩選出可高效清除ZEN的2株細(xì)菌A5、D6。通過(guò)生理、生化及分子生物學(xué)方法，鑒定出它們?yōu)榧t球菌屬細(xì)菌R．qingshengii。通過(guò)對(duì)細(xì)胞的失活處理，證明本研究所篩選菌株對(duì)ZEN沒(méi)有吸附作用。對(duì)菌株上清液、細(xì)胞內(nèi)容物與ZEN共培養(yǎng)試驗(yàn)，證明D6菌株是通過(guò)特異性胞內(nèi)酶活清除ZEN，并可將ZEN降解或轉(zhuǎn)化為無(wú)雌激素物質(zhì)。

［1］Zinedine A，Soriano J M，MoltóJ C，et al.Review on the toxicity，occurrence，metabolism，detoxification，regulations and intake of zearalenone：an oestrogenic mycotoxin［J］. Food and Chemical Toxicology，2007，45：1-18

［2］Bennett J W，Klich M.Mycotoxins［J］.Clinical Microbiology Reviews，2003，16：497-516

［3］Ramos A J，F(xiàn)ink-Gremmels J，Hernandez E.Prevention of toxic effects of mycotoxins by means of nonnutritive adsorbent compounds［J］.Journal of Food Protection，1996，59：631-641

［4］Bauer J.M?glichkeiten zur Entgiftung mykotoxinhaltiger Futtermittel［J］.Monatshefte für Veterin?rmedizin，1994，49：175-181

［5］McKenzie K S，Sarr A B，Mayura K，et al.Oxidative degradation and detoxification of mycotoxins using a novel source of ozone［J］.Food and Chemical Toxicology，1997，35：807-820

［6］Yu Y，Qiu L，Wu H，et al.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobacter sp.SM04 liquid cultures［J］.Biodegradation，2011，22：613-622

［7］Altalhi A D，El-Deeb B.Localization of zearalenone detoxification gene（s）in pZEA-1 plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1 and expressed in Escherichia coli［J］.Journal of Hazardous Materials，2009，161：1166-1172

［8］Takahashi-Ando N，Kimura M，Kakeya H，et al.A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone：enzyme purification and gene cloning［J］.Biochemical Journal，2002，365：1-6

［9］Brodehl A，M?ller A，Kunte H J，et al.Biotransformation of the mycotoxin zearalenone by fungi of the genera Rhizopus and Aspergillus［J］.FEMS Microbiology Letters，2014，359 （1）：124-130

［10］Sun X，He X，Xue K S，et al.Biological detoxification of zearalenone by Aspergillus niger strain FS10［J］.Food and Chemical Toxicology，2014，72：76-82

［11］林萬(wàn)明，郭兆彪，高樹(shù)德.熱變性溫度法測(cè)定細(xì)菌DNA 中G+C比值在細(xì)菌分類鑒定上的應(yīng)用［J］.江西醫(yī)藥，1982，3：10-15 Lin W M，Guo Z B，Gao S D.Application of thermal denaturation temperature method in the determination of bacterial DNA G+C ratio in the taxonomic identification of bacteria ［J］.Jiangxi Medical Journal，1982，3：10-15

［12］Routledge E J，Sumpter J P.Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，1996，15：241-248

［13］Cserháti M，Kriszt B，Krifaton C，et al.Mycotoxin-degradation profile ofRhodococcus strain［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，166（1）：176-185

［14］Xu J L，He J，Wang Z C，et al.Rhodococcus qingshengii sp.nov.，a carbendazim-degrading bacterium［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（12）：2754-2757

［15］Wang Z，Xu J，Li Y，et al.Rhodococcus jialingiae sp. nov.，an actinobacterium isolated from sludge of a carbendazim wastewater treatment facility［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60 （2）：378-381

［16］Táncsics A，Benedek T，F(xiàn)arkas M，et al.Sequence analysis of 16S rRNA，gyrB and catA genes and DNA-DNA hybridization reveal that Rhodococcus jialingiae is a later synonym of Rhodococcus qingshengii［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2014，64（1）：298-301.

Screening，Identification and Mechanism of
B
acterial Strains Capable of Eliminating Zearalenone

Zhao Chen Shi Jing Wang Yang Zhang Qian Zhang Xiaolin
（Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037）

In this study，the strains capable of degrading Zearalenone（ZEN）were screened through sampling from the agricultural field where gibberellic disease occurred frequently.Two bacteria A5 and D6，showing obvious elimination activity，have been obtained where D6 demonstrated stronger effect.These two strains were identified as Rhodococcus sp．using physiological analysis，BLAST of 16S rDNA sequence，GC content and BIOLOG analysis，the DNA-DNA hybridization result showed that these two strains belonged to Rhodococcus qingshengii．The cells were proved to have no ZEN absorption activity through cultivating the inactivated cells with ZEN；and the active component of D6 strain in ZEN elimination was proved to be intracellular protein by cultivating the bacterial culture supernatant and cellular content together with ZEN.Meanwhile，the peak suspected to be ZEN metabolite was observed with fluorescence detector of HPLC.Two Rhodococcus sp.degrading ZEN via intracellular enzymatic activity were screened and isolated，which provides theoretical evidence for ZEN bio-detoxification.

Zearalenone，Rhodococcus，ZEN elimination

Q936

A

1003-0174（2017）03-0011-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（31302007）

2015-08-17

趙晨，男，1981年出生，副研究員，微生物與分子生物學(xué)

張曉琳，女，1975年出生，研究員，微生物學(xué)