諶馥佳，王春弘，李大紅，李恩中(黃淮學院生物與食品工程學院，河南 駐馬店 463000)

動物生產(chǎn)層

miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育中的功能

諶馥佳，王春弘，李大紅，李恩中
(黃淮學院生物與食品工程學院，河南 駐馬店 463000)

MicroRNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性的非編碼RNA，以影響靶基因表達的方式來調(diào)節(jié)機體功能。miRNA能調(diào)控哺乳動物性腺(睪丸和卵巢)的發(fā)育，促進精子與卵母細胞的分化成熟，影響受精卵的發(fā)育過程，并可能作為診斷生殖疾病卵巢癌的重要指標。本文對miRNA的生物合成過程，miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育以及卵巢癌變過程中的調(diào)控功能進行了綜述，提出該領域主要發(fā)展方向是miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育中的體內(nèi)功能研究，希望以分子生物學和生物信息學手段，從分子、系統(tǒng)等不同角度闡明單一某種miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育及卵巢癌變過程中的具體調(diào)節(jié)機制和信號通路情況。這為研究哺乳動物生殖疾病，選育畜牧生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)品種提供了新的思路和途徑。

miRNA；哺乳動物；睪丸；卵巢；精子；卵巢癌；性腺發(fā)育

MicroRNA(miRNA)作為近年來新興的研究熱點，是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，長21～24個核苷酸，通常與靶mRNA 3′端的非翻譯區(qū)結(jié)合，從而誘導靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的表達，它們廣泛存在于植物、微生物、線蟲、動物和人類的細胞中[1]。1993年人們首次在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發(fā)現(xiàn)了控制線蟲時序性發(fā)育的小分子miRNA：lin4基因[2]。接著在線蟲中發(fā)現(xiàn)了let7基因，該miRNA具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能[3]。之后許多miRNA被相繼發(fā)現(xiàn)[4]。在人類基因組中，2/3左右的人類基因由miRNA調(diào)控，在人體內(nèi)形成錯綜復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，這些靶基因與miRNA存在著“一對多”或者“多對一”的關系[5]。目前發(fā)現(xiàn)miRNA可以有效調(diào)控生物體的生長、發(fā)育和凋亡等過程，多種生物的miRNA已由miRBase收錄[6]。同生物體其他器官和組織一樣，哺乳動物的性腺及其發(fā)育也受miRNA的調(diào)控。miRNA能夠在哺乳動物的性腺及其組織中廣泛表達，且表達量在性腺的不同發(fā)育時期呈現(xiàn)不同變化趨勢，在性腺激素的參與下共同影響性腺發(fā)育，主要是調(diào)控睪丸、卵巢的正常發(fā)育，精子與卵母細胞進一步的分化成熟，以及受精卵的整個發(fā)育過程。

1 miRNA的生物合成途徑

miRNA的生物合成途徑通常包括3個步驟[7-14](圖1)：1)在RNA聚合酶Ⅱ的催化作用下將miRNA轉(zhuǎn)錄成初級miRNA(pri-miRNA)。2)pri-miRNA被按步驟分區(qū)處理之后，最終以成熟的miRNA形式存在于細胞中；此過程中，首先pri-miRNA在核內(nèi)Ⅲ型RNA核酸內(nèi)切酶Drosha作用下，被剪切成前體miRNA(pre-miRNA)，該前體miRNA 70～90 bp，接著Drosha酶能夠與DGCR8蛋白(即雙鏈RNA結(jié)合蛋白)結(jié)合而成微型絡合物[7]；然后在Expotin-5輸出蛋白的作用下，由輔助因子Ran-GTP參與，pre-miRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)，在胞質(zhì)內(nèi)Ⅲ型RNA核酸內(nèi)切酶Dicer剪切作用下，形成一段雙鏈miRNA(約22 bp)[8]；最后雙鏈miRNA解螺旋后形成成熟的單鏈miRNA[9]。3)成熟miRNA能夠與miRISC結(jié)合發(fā)揮功效。miRISC是一種miRNP即核糖核蛋白復合體(圖1)，也是RNA誘導相關的沉默復合體。在核糖核蛋白復合體上，miRNA一般以兩種不同的方式來調(diào)控靶基因的表達，miRNA 和Argonaute家族靶基因結(jié)合蛋白的互補程度決定了抑制翻譯或降解靶mRNA的方式：部分互補抑制靶mRNA的翻譯，完全互補則會使其降解[10-11]，具體機制尚不清楚。miRNA或被羈留在核糖體上[12]，或被補充到Pbodies中，Pbodies為細胞質(zhì)處理小體，最后該miRNA被降解[13]。

圖1 哺乳動物miRNA生物合成途徑 Fig. 1 The biosynthetic pathway of miRNA of mammals

注：其中前體miRNA壽命短暫，miRNA的5′端被磷酸化，細胞質(zhì)中miRNA*在進入核糖核蛋白復合體前被降解。

Note:The life of pre-miRNA is short, with the 5′ end of miRNA phosphorylated. The miRNA*is degradated before entering the miRISC in cytoplasm.

2 miRNA在睪丸發(fā)育中的功能

2.1 睪丸miRNA的表達與表達調(diào)控

睪丸miRNA表達情況存在著物種差異性和階段特異性。Yan等[15]以恒河猴(Macacamulatta)、人(Homosapiens)等靈長類動物的睪丸組織為材料，研究miRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn),共有66個(占總數(shù)的26.4%)miRNA在恒河猴睪丸中差異性表達，如hsa-miR-493-3p、hsa-miR-376b、hsa-miR-222等，其中有23個miRNA表達上調(diào)，其余的miRNA下調(diào)；而在人睪丸組織中檢測到76個(占總數(shù)的31.3%)miRNA差異表達，如hsa-miR-181c、hsa-let-7e、hsa-miRNA-219等，其中有28個miRNA表達上調(diào)，48個miRNA表達下調(diào)；另外miRNA的表達在靈長類睪丸的不同發(fā)育階段存在著階段特異性差異，例如hsa-miR-154、hsa-miR-181c、hsa-miR-181d和hsa-miR-487b等在未成熟的睪丸中表達上調(diào)，在成熟的睪丸組織中表達下調(diào)。這些miRNAs可能通過調(diào)控精母細胞、精細胞的形成及分化過程來調(diào)控整個精子的發(fā)生過程。在研究不同miRNAs在豬睪丸發(fā)育過程中的作用時發(fā)現(xiàn)，miR-122在睪丸發(fā)育成熟的過程中表達量升高，而miR-221卻表達量下調(diào)，這說明miR-122與miR-221功能不同[16]。接著建立了關于豬睪丸的小RNA文庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬睪丸組織中共有122個miRNAs可以進行差異性表達[17]，目前已經(jīng)逐步開展其功能驗證工作。采用生物信息學與實時熒光定量PCR(Real-time PCR)等手段探討綿羊(Ovisaries)妊娠胎兒中睪丸miRNA在各妊娠時期的表達特點時發(fā)現(xiàn)，30種miRNA的表達呈現(xiàn)出顯著性差異，有13種miRNA(如miRNA-99b、miRNA-149等)在妊娠初期(即第42天)的表達量顯著升高，另外17種miRNA(如miRNA-19b、miRNA-204等)在妊娠中期(即第75天)的表達量顯著升高[18]。在細胞內(nèi)外因素的調(diào)控下，睪丸miRNA的表達受到影響，睪丸基因表達乃至睪丸的發(fā)育和精子形成過程也受到miRNA的調(diào)控。這些細胞內(nèi)外因素包括激素、轉(zhuǎn)錄因子、酶和蛋白等。例如人們發(fā)現(xiàn)小鼠(Musmusculus)睪丸細胞miRNA的表達是由雄激素、酶或蛋白質(zhì)共同調(diào)節(jié)的[19]。另有研究表明，雄性生殖腺如果缺乏第2類的核糖核酸酶Ⅲ，可能會對成熟miRNA的形成過程產(chǎn)生阻礙作用，最終導致雄性不育[20]。

2.2 miRNA調(diào)控精子生成過程

成熟精子是一種單倍體生殖細胞，其特殊之處在于其生成過程需要相關因子一系列的精準調(diào)控。例如在小鼠精子的精原細胞(prospermatogonia)中miR-17-92、miR-290-295家族能夠高效表達[21]。敲除了miR-17-92后，小鼠的睪丸會縮小，精子產(chǎn)生數(shù)量和質(zhì)量都會下降[22]，表明miR-17-92與miR-106b-25協(xié)作調(diào)控精子發(fā)育與成熟過程。小鼠精子細胞中的miR-34c能夠高度表達，與靶基因ATF1(活化轉(zhuǎn)錄因子)互作引起精子細胞等雄性生殖細胞凋亡[23]。現(xiàn)階段，關于miRNA在整個精子成熟過程中調(diào)控作用的研究主要集中在前期發(fā)育階段，即是由原始生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)至精原細胞的形成過程，而對從初級精母細胞(spermatocyte)至成熟精子細胞(spermatozoa)的后期發(fā)育階段研究較少[21-22,24-38](表1)。

3 miRNA在卵巢發(fā)育中的功能

3.1 miRNA在卵泡發(fā)育過程中的功能

卵泡發(fā)育、排卵等生理過程，由大量基因表達的產(chǎn)物以及miRNAs參與調(diào)控，以確保這些基因在表達和信息交流過程中的時空準確性。Tang等[39]在小鼠成熟卵細胞中發(fā)現(xiàn)miR-16、let-7等家族的多種miRNAs。后來又從女性卵母細胞顆粒和卵丘細胞中發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、miR-23a、miR-23b等多種miRNAs[40]。在牛卵巢miRNA的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA克隆共74個，其中新克隆有24個，Bta-miR-29a能夠在卵泡細胞的整個發(fā)育過程中特異性表達[41]。在小鼠新生兒(NB)的卵巢中，miRNA-let-7家族和mmu-mir-322、mmu-mir-672家族等的表達最為豐富,后兩者是一類與X染色體連鎖的miRNA，其中mmu-mir-672家族通常會在性腺中優(yōu)先表達[42]。

3.2 miRNA在卵母細胞成熟過程中的功能

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在小鼠卵母細胞發(fā)育過程中發(fā)揮著重要功能，能夠敲除內(nèi)切核糖核酸酶Dicer，從而阻止前體miRNA生成miRNA，致使原始生殖細胞發(fā)育過程受阻，減數(shù)分裂停滯[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂時期卵母細胞中共有861個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即mRNA表達上調(diào)，173個mRNA表達下調(diào)，這說明，miRNA調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的機制是通過調(diào)控這些mRNA的表達來實現(xiàn)的[45]。miRNA-224通過作用于SMAD4靶基因來調(diào)控由轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)介導的小鼠卵母顆粒細胞的增殖途徑和激素分泌過程[46]。miR-21的功能是阻礙小鼠排卵前的卵母顆粒細胞凋亡[47]。

表1 部分調(diào)控精子生成的miRNAsTable 1 Some miRNAs in the regulation of spermatogenesis

3.3 miRNA與卵巢激素的關系

性腺激素在正常生殖過程、生殖紊亂疾病以及與雌激素相關的癌癥中起著重要作用[48]。以轉(zhuǎn)染的原代人卵母顆粒細胞為材料，檢測miRNAs對性腺激素的影響，發(fā)現(xiàn)36種miRNAs抑制孕酮的產(chǎn)生，16種促進孕酮的產(chǎn)生，58種抑制睪酮的產(chǎn)生，miR-107促進睪酮的產(chǎn)生，51種抑制雌激素的生成[49]。這說明miRNAs會影響卵巢類固醇激素的生成。

然而，類固醇激素也影響miRNA 的生成。Pan等[50]用乙酸甲羥孕酮和17β-雌二醇處理原代培養(yǎng)的腺上皮細胞和人子宮內(nèi)膜間質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-20a、miR-21和miR-26a這3種miRNA的表達受到影響?；罨拇萍に厥荏w(estrogen receptor，ER)與核內(nèi)Ⅲ型RNA核酸內(nèi)切酶(Drosha)互作可以抑制pri-miRNAs的成熟，從而增大這些miRNAs的靶基因表達量[51]。在人體處于增殖期和分泌期時，miRNAs在子宮內(nèi)膜中的表達有明顯的差異，研究發(fā)現(xiàn)有12個miRNAs在分泌期時表達量顯著升高，這是由于孕酮在該時期起到了關鍵性作用[52]。

另外，促性腺激素也能調(diào)節(jié)miRNAs的生成。黃體生成素(LH)對人排卵期卵泡顆粒細胞中的13個miRNAs有調(diào)控作用[53]。卵泡刺激素(FSH)可以抑制小鼠卵母顆粒細胞中l(wèi)et-7a、miR-143與miR-125b這3個miRNAs的表達[54]。人絨毛膜促性腺激素(HCG)能夠下調(diào)小鼠卵母顆粒細胞和卵泡細胞中的個別miRNA的表達量[55]。

3.4 miRNAs與卵巢癌

上皮性卵巢癌(EOC)是最嚴重的女性惡性腫瘤之一[56]，每年死于該疾病的女性約有12萬人之多，現(xiàn)階段雖然在EOC的診斷與治療領域取得了一定的進展，但是對其發(fā)育過程分子機制的研究較少，目前研究表明miRNA能夠調(diào)控卵巢癌的發(fā)生過程[57]。卵巢癌中miRNA的表達通常用基因芯片表達譜來檢測，卵巢癌中的部分miRNAs其表達量明顯上調(diào)，如miR-141、miR-200a、miR-200b和miR-200c，而另外一些miRNAs(如miR-199a、miR-125b1、miR-145和miR-140)表達量則顯著下調(diào)，可以根據(jù)卵巢癌的組織病理特點對這些發(fā)生變化的miRNAs進行分類[58]。某些miRNAs的表達量上調(diào)可能是由于卵巢癌細胞中DNA的甲基化，例如miR-21、miR-205等。目前miRNA在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中屬于抑癌基因，但是其分子機制尚不清楚[59]。原代腫瘤細胞中的miRNA表達量與基因組以及表觀的變化有一定的相關性[60]，一些具有抑癌基因功能的miRNA會在卵巢癌的晚期表達，且表達量下調(diào)。

另有研究表明，某些miRNAs可能調(diào)節(jié)腫瘤的形成，如miR-214和miR-200a，miR-214是在卵巢癌中表達上調(diào)最顯著的miRNA，能夠抑制PTEN抑癌基因的表達，從而激活Akt信號通路；因為缺少3′非翻譯區(qū)的PTEN抑癌基因表達載體，Akt的抑制劑或者過表達可能會對miR-214誘導的細胞存活具有抑制效果[61]。這說明卵巢癌中某些miRNA表達量的變化，有可能是癌變信號，這些miRNA可能成為潛在診斷及治療卵巢癌的重要指標。

4 miRNA在受精卵發(fā)育過程中的功能

哺乳動物的個體發(fā)育過程由受精卵開始，miRNA在精卵結(jié)合后的受精卵發(fā)育成熟過程中，也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能。受精卵中的母源miRNAs含量最多的成員有l(wèi)et-7家族和miR-17-92家族[39]，其miRNA的表達譜在早期胚胎個體發(fā)育的各個階段呈現(xiàn)一定的差異，其表達量在卵子成熟至受精卵的形成，再到早期胚胎的發(fā)育過程中呈現(xiàn)先下降后上調(diào)的現(xiàn)象。小鼠早期胚胎發(fā)育過程受到由miR-196a調(diào)控NOBOX靶基因(新生兒卵巢同源盒基因)表達的影響，miR-196a表達量持續(xù)上升，NOBOX基因表達量下降[62]。miR-135a通過下調(diào)靶基因SIAH1A的表達實現(xiàn)對早期胚胎體外發(fā)育的調(diào)控[63]。miR-181a通過抑制NPM2(核質(zhì)，Nucleoplasm 2)基因的表達調(diào)控卵母細胞的激活與早期胚胎的發(fā)育過程，在此過程中，miR-181a與NPM2基因的表達一直呈現(xiàn)負相關性[64]。某些母源性miRNA對早期胚胎的發(fā)育至關重要，將胞質(zhì)內(nèi)Ⅲ型RNA核酸內(nèi)切酶(Dicer)突變體小鼠與正常小鼠的基因表達譜進行比較分析發(fā)現(xiàn)，miRNA以直接或間接作用對大部分母源性基因的表達進行調(diào)控[43]。

5 小結(jié)

miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育的各個階段均發(fā)揮著重要的功能，對一系列重要生殖活動(例如精子發(fā)生和卵泡發(fā)育過程、激素分泌和受精卵發(fā)育過程)、生殖疾病及卵巢癌的發(fā)生進行調(diào)控。miRNA通過與靶mRNA以堿基配對方式進行特異性結(jié)合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻譯過程，從而調(diào)控基因表達。研究miRNA對性腺的正常發(fā)育及生殖活動的調(diào)控功能具有重要的實踐意義，可為研究人類及其他哺乳動物生殖系統(tǒng)疾病提供理論基礎，可為畜牧生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)品種的選育提供新的思路和途徑。

鑒于性腺發(fā)育、生殖以及生殖疾病發(fā)生機制的復雜性，人們對于miRNA的研究尚處于初級階段，還存在著一些問題：1)試驗材料的廣泛性，對哺乳動物miRNA的研究不但要重點突出，如小鼠和人，而且要涉及廣泛，對其他哺乳動物的研究還有待深入；2)最好采用體外試驗與體內(nèi)試驗相結(jié)合的研究方法，目前的研究結(jié)果多是體外試驗結(jié)果，而對體內(nèi)功能研究較少；3)對于單一某種miRNA在哺乳動物生命活動中的作用及其機理也有待更深入的研究，包括具體的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡和信號通路的情況等。

與哺乳動物性腺發(fā)育相關的miRNA作為目前研究的熱點，通過大規(guī)模測序已經(jīng)有了初步的發(fā)展，但是仍有大部分miRNA靶基因尚未確定。得益于分子生物學和生物信息學技術(shù)的進步[65]，如差異表達譜分析技術(shù)、miRISC免疫共沉淀技術(shù)、生物信息學等，開發(fā)具備高靈敏度、高通量特異性的miRNA靶基因篩選鑒定方法是目前亟待解決的課題，以更先進的手段，重點研究miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育中的體內(nèi)功能，從分子、系統(tǒng)等不同角度闡明單一某種miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育及卵巢癌變過程中的具體調(diào)節(jié)機制和信號通路情況，勢必成為該領域主要發(fā)展方向。

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(責任編輯 王芳)

miRNA function in mammal gonad development

Chen Fu-jia, Wang Chun-hong, Li Da-hong, Li En-zhong
(College of Biotechnology and food Engineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000,China)

MicroRNA (miRNA), a class of endogenous noncoding RNAs, plays a role in regulation of the body’s physiological function by affecting target gene expression. miRNAs can regulate the development of gonads (testicles and ovaries), promote maturation and differentiation of sperm and oocytes, and affect the growth of oosperm. miRNAs can be used as an important index in diagnosis of ovarian cancer. This paper summarizes miRNAs’ biogenesis and its regulation in mammal gonadal development and the progress of ovarian cancer; research has mainly focused on these functions in vivo. The regulation mechanisms and signalling pathways of miRNAs in gonadal development of mammals and ovarian cancer is revealed through molecules, systems, and other aspects of biology through molecular biology and bioinformatics. We provide new thoughts and approaches for reproductive disease research and high-quality animal breeding.

miRNA; mammals; testicle; ovary; sperm; ovarian cancer; gonad development

Li En-zhong E-mail：66811648@qq.com

2016-07-15 接受日期：2016-10-24

河南省科技攻關項目“瓜蔞抗腫瘤多糖關鍵精制技術(shù)及藥物篩選模型研究”(152102210025)

諶馥佳(1985-)，女，湖北黃陂人，講師，博士，研究方向為生物制藥。E-mail：shenfujiawlqs@163.com

李恩中(1974-)，男，河南確山人，教授，博士，主要從事生物制藥的教學與科研工作。E-mail：66811648@qq.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0377

Q954.5

A

1001-0629(2017)04-0861-08

諶馥佳，王春弘，李大紅，李恩中.miRNA在哺乳動物性腺發(fā)育中的功能.草業(yè)科學,2017,34(4)：861-868.

Chen F J,Wang C H,Li D H,Li E Z.miRNA function in mammal gonad development.Pratacultural Science，2017,34(4)：861-868.