劉芳，王立紅， 董惠峰，趙晶晶，張俊霞，劉鼎闊1，，通信作者

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黃連解毒湯對大鼠亞慢性毒性試驗研究

劉芳2，3，王立紅2，3， 董惠峰3，趙晶晶2，3，張俊霞3，劉鼎闊1，2，3，通信作者

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京100094；2. 天津市飼用微生物制劑企業(yè)重點(diǎn)實驗室，天津300383；3. 鼎正動物藥業(yè)（天津）有限公司，天津300383）

研究黃連解毒湯連續(xù)灌服情況下對于SD大鼠的亞慢性毒性作用，揭示其臨床安全性。SD 大鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分為對照組和黃連解毒湯 20、10、5 mL/kg 劑量組，每組 30 只，連續(xù)給藥6周，以SD大鼠的體重、血液學(xué)、血液生化學(xué)、組織病理學(xué)檢查作為檢查指標(biāo)，全面評價連續(xù)灌服對大鼠的毒性作用。連續(xù)給藥42 d后，與對照組相比，黃連解毒湯試驗組大鼠的血常規(guī)及各項血液生化檢測指標(biāo)結(jié)果相近（＞0.05）。組織病理學(xué)切片結(jié)果顯示，黃連解毒湯20 mL/kg組大鼠肝臟和腎臟出現(xiàn)了輕微損傷，10 mL/kg和5 mL/kg 劑量組SD大鼠的的脾、肺、肝、腎、胃等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。黃連解毒湯在10 mL/kg和5 mL/kg 劑量下連續(xù)灌服情況下對SD大鼠無不良影響。

黃連解毒湯；大鼠；亞慢性毒性

黃連解毒湯方出《外臺秘要》引崔氏方，其方劑由黃連、黃芩、黃柏、桅子四味藥組成，為清熱解毒的代表方劑，具有多種藥理活性，但是中藥成分復(fù)雜，可由其所產(chǎn)生的安全問題不容忽視[1-2]。據(jù)報道，黃連解毒湯的君藥黃連已引起了錐體外系反應(yīng)，導(dǎo)致呼吸衰竭，肝功能損害，嚴(yán)重心律失常，甚至導(dǎo)致死亡[3-5]。然而，大多數(shù)研究僅涉及到黃連生物堿的細(xì)胞毒性和急性毒性、小檗堿的遺傳毒性等，對黃連解毒湯在安全性全面的研究較少[6]。本研究主要通過臨床觀察、血液學(xué)和血液生化檢測、病理檢查等手段對黃連解毒湯連續(xù)應(yīng)用情況下的亞慢性毒性作用進(jìn)行研究，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

黃連解毒湯，由鼎正動物藥業(yè)（天津）有限公司提供。

1.2 實驗動物

4周清潔級SD大鼠120只，雌雄各半，體重在120～150 g之間，由中國人名解放軍軍事醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供，動物合格證號為：SCXK（軍）2014-0001。

1.3 試驗方法

試驗動物隨機(jī)分為4組，分別為黃連解毒湯20 mL/kg劑量組（20 mL/kg）、10 mL/kg劑量組（10 mL/kg）、5 mL/kg劑量組（5 mL/kg）和生理鹽水對照組，每組動物30只，雌雄各半，分開飼喂。組內(nèi)動物個體體重相差應(yīng)不超過平均體重的10%，組間平均體重相差不超過5%。試驗組大鼠每天均灌胃給藥1次。連續(xù)給藥42 d（即共6周）。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 臨床表現(xiàn)

每天觀察試驗大鼠的健康狀況、采食及飲水、體重等。分別于第1、2、3、4、5、6周稱量體重，給藥結(jié)束后計算平均攝食量和飼料利用率（動物每食入100 g飼料所增長的體重克數(shù)）。將給藥劑量組與對照組進(jìn)行比較和統(tǒng)計學(xué)處理。及時記錄和分析大鼠的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間。

1.4.2 血液學(xué)和血液生化檢測

給藥結(jié)束后，對大鼠心臟采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化指標(biāo)的檢測。

血液學(xué)檢測包括：血紅蛋白（Hg）、紅細(xì)胞計數(shù)（Ec）、白細(xì)胞計數(shù)（Lc）、嗜中性（NL）、嗜酸性（AL）、嗜堿性（BL）、淋巴（LM）、單核（ML）。

血液生化檢測包括：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)換酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）。

1.5 病理檢查

1.5.1 大體剖檢

給藥結(jié)束后，各組取10只大鼠（雌雄各半）進(jìn)行剖檢（結(jié)合采血進(jìn)行）。做好記錄，并將重要器官和組織固定保存。

1.5.2 臟器稱重

剖檢試驗大鼠的同時，稱取大鼠體重及各主要臟器（包括脾、肺、肝、腎、胃、腸、睪丸及卵巢）重量，做好記錄。計算各臟器的相對重量（臟器重/體重），即臟器系數(shù)。

1.5.3 組織病理學(xué)檢查

對20 mL/kg劑量組及對照組大鼠的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較5 mL/kg劑量組大鼠的相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。組織病理學(xué)檢測項目包括：脾、肺、肝、腎、胃、腸。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表現(xiàn)

各組大鼠灌胃給藥期間各組均無死亡，20 mL/kg劑量組第2天出現(xiàn)稀便，10 mL/kg劑量組和5 mL/kg劑量組與對照組相比無明顯變化，其他臨床表現(xiàn)均屬正常。各試驗組給藥結(jié)束，與對照組相比，雌性大鼠在3、4周，雄性大鼠在3、4、5周體重增重的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），提示黃連解毒湯在20 mL/kg劑量可明顯的抑制大鼠體重增長，10 mL/kg劑量、5 mL/kg劑量對大鼠體重增長無明顯的影響（＞0.05）（表1）。

表1 黃連解毒湯對大鼠體重增重的影響（s，n=10） g

表1 黃連解毒湯對大鼠體重增重的影響（s，n=10） g

檢測指標(biāo)20 mL/kg劑量組10 mL/kg劑量組5 mL/kg劑量組對照組 初重♂♀107. 03±4. 02101. 90±4. 47101. 43±2. 62109. 87±6. 16101. 13±7. 71110. 83±3. 57105. 80±4. 47111. 50±6. 67 1周♂♀140. 53±2. 22128. 20±4. 64142. 83±6. 04141. 47±6. 44188. 73±10. 98*139. 17±5. 64148. 67±6. 71145. 50±9. 60 2周♂♀177. 63±5. 04156. 27±12. 33173. 10±5. 33167. 93±3. 91188. 73±4. 98166. 23±4. 33198. 77±8. 78178. 73±10. 96 3周♂♀211. 53±4. 71176. 13±13. 64*218. 63±12. 79193. 80±2. 73233. 43±11. 31197. 90±2. 93245. 83±8. 82212. 30±13. 13 4周♂♀251. 67±7. 96*195. 37±6. 82*252. 20±11. 40218. 63±7. 89276. 13±10. 11221. 93±3. 16292. 80±9. 53230. 97±11. 58 5周♂♀282. 27±12. 38*218. 63±8. 56*291. 63±14. 64239. 63±3. 64319. 43±21. 96249. 90±2. 53338. 40±12. 13256. 60±8. 53 6周♂♀332. 53±17. 89*277. 47±20. 78329. 23±20. 98289. 73±5. 84357. 70±21. 60290. 97±9. 82371. 23±19. 16288. 63±7. 36

注：*為差異顯著（0.01＜＜0.05）

與對照組相比，藥物組各組的攝食量無明顯的差異（＞0.05），但是20 mL/kg劑量組飼料利用率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），10 mL/kg劑量、5 mL/kg劑量對大鼠飼料利用率無明顯的影響（＞0.05）（表2）。

2.2 臟器檢測結(jié)果

與對照組相比，黃連解毒湯20 mL/kg劑量組、10 mL/kg劑量組、5 mL/kg劑量組臟器相對體質(zhì)量均無顯著變化（＞0.05）（表3）。

表2 黃連解毒湯對大鼠進(jìn)食量及食物利用率的影響（s，n=10）

表2 黃連解毒湯對大鼠進(jìn)食量及食物利用率的影響（s，n=10）

檢測指標(biāo)20 mL/kg劑量組10 mL/kg劑量組5 mL/kg劑量組對照組 攝食量/g♂♀10 453. 858 165. 3210 847. 308 152. 1410 126. 508 135. 2310 256. 238 215. 36 飼料利用率/%♂♀29. 16*27. 2731. 2429. 9431. 5630. 4533. 5430. 96

表3 黃連解毒湯對大鼠臟器相對體質(zhì)量的影響（s，n=10） %

檢測指標(biāo)20 mL/kg劑量組10 mL/kg劑量組5 mL/kg劑量組對照組 心♂♀0. 37±0. 060. 37±0. 080. 35±0. 050. 32±0. 02 0. 42±0. 060. 33±0. 050. 41±0. 050. 40±0. 03 肝♂♀4. 00±0. 803. 90±0. 403. 60±0. 703. 60±0. 20 4. 30±0. 903. 70± 0.603. 50±0. 404. 30±0. 20 脾♂♀0. 34±0. 020. 30±0. 040. 20±0. 020. 18±0. 05 0. 18±0. 040. 21±0. 060. 15±0. 030. 17±0. 02 肺♂♀0. 56±0. 020. 48±0. 020. 49±0 .040. 45±0. 02 0. 58±0. 030. 47±0. 060. 49±0. 040. 50±0. 07 腎♂♀0. 83±0. 090. 82±0. 040. 75±0. 040. 79±0. 12 0.73±0. 030. 70±0. 090. 72±0. 050. 88±0. 11 睪丸♂10. 08±1. 159. 18±1. 0411. 09±1. 2310. 67±1. 41 卵巢♀0. 27±0. 090. 27±0. 020. 22±0. 070. 22±0. 05

表4 黃連解毒湯對大鼠血液學(xué)檢測指標(biāo)的影響（s，n=10）

表4 黃連解毒湯對大鼠血液學(xué)檢測指標(biāo)的影響（s，n=10）

組別白細(xì)胞數(shù)白細(xì)胞種類/%紅細(xì)胞血紅蛋白 109個·L-1嗜堿嗜酸中性淋巴單核102 g·L-1g·L-1 20 mL/kg劑量組♂♀11. 16±0. 980. 10±0. 021. 10±0. 1357. 70±3. 2463. 70±3. 543. 40±0. 566. 28±0. 44135. 00±4. 21 9. 21±1. 120. 20±0. 031. 24±0.1961. 40±4. 5665. 10±5. 143. 60±0. 485. 13±0. 52144. 00±1. 83 10 mL/kg劑量組♂♀9. 28±0. 890. 50±0. 061. 10±0. 2060. 70±3. 5258. 00±3. 144. 50±0. 246. 83±0. 43101. 00±10. 21 9. 99±0. 780. 20±0. 021. 40±0. 1358. 60±4. 2166. 30±3. 545. 20±0. 495. 01±0. 56127. 00±8. 76 5 mL/kg劑量組♂♀10. 57±1. 220. 10±0. 021. 12±0. 2158. 10±4. 2162. 80±4. 124. 30±0. 546. 91±0. 64129. 00±4. 28 9. 17±0. 840. 20±0. 021. 36±0. 2462. 10±3. 8460. 20±5. 024. 50±0. 757. 36±0. 59110. 00±5. 62 對照組♂12. 37±1. 020. 20±0. 031. 25±0. 3163. 20±3. 5168. 60±3. 154. 80±0. 626. 93±0. 71131. 00±10. 54 ♀11. 77±1. 420. 10 ±0. 031. 10±0. 1565. 10±4. 5366. 60±3. 244. 30±0. 695. 71±0. 24112. 00±4. 14

表5 黃連解毒湯對大鼠血液生化學(xué)檢測指標(biāo)（s，n=10）

表5 黃連解毒湯對大鼠血液生化學(xué)檢測指標(biāo)（s，n=10）

檢測指標(biāo)20 mL/kg劑量組10 mL/kg劑量組5 mL/kg劑量組對照組 天門冬氨酸轉(zhuǎn)換酶AST/U·L-1♂♀141. 30±19. 5489. 42±20. 47114. 10±25. 3696. 08±17. 58105. 54±15. 1276. 40±9. 28114. 70±23. 4289. 42±43. 16 肌酐Cr/μmol·L-1♂♀65. 18±2. 24*75. 16±5. 23*58. 54±7. 4545. 50±5. 6456. 22±6. 1652. 97±7. 5251. 94±5. 7458. 54±11. 04 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶ALT/U·L-1♂♀62. 27±5. 32*53. 24±2. 10*49. 78±7. 6546. 31±3. 5448. 39±4. 9542. 79±7. 5642. 03±6. 1440. 28±4. 86 血尿素氮BUN/mmol·L-1♂♀11. 57±0. 98*9. 36±1. 04*7. 56±0. 527. 13±0. 849. 12±0. 856. 24±0. 368. 45±0. 547. 24±0. 85 白蛋白ALB/kat·L-1♂♀25. 48±3. 4729. 17±2. 1532. 12±2. 5440. 21±4. 5131. 25±5. 2137. 25±4. 7535. 24±3. 1237. 56±4. 25 總蛋白TP/kat·L-1♂♀68. 12±6. 2468. 25±3. 5664. 53±4. 2767. 31±8. 4569. 67±4. 2167. 62±7. 3363. 52±3. 8970. 17±7. 21 總膽固醇CHO/mmol·L-1♂♀1. 69±0. 151. 35±0. 121. 74±80. 131. 29±0. 171. 25±0. 251. 35±0. 111. 31±0. 091. 29±0. 12 甘油三酯TG/mmol·L-1♂♀0. 49±0. 020. 58±0. 030. 56±0. 020. 55±0. 060. 65±0. 030. 41±0. 040. 44±0. 060. 34±0. 05

2.3 血液學(xué)及血液生化參數(shù)

給藥結(jié)束后，各組大鼠進(jìn)行血液學(xué)和血液生化參數(shù)測定結(jié)果均分別見表4和表5。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與對照組相比黃連解毒湯20 mL/kg劑量組BUN、Cr、ALT顯著升高（＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，而10 mL/kg劑量組和5 mL/kg劑量組的血液學(xué)和血液生化參數(shù)之間差異不顯著（＞0.05）。

2.4 病理學(xué)變化

給藥結(jié)束后，剖檢大鼠，經(jīng)肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示：10 mL/kg劑量組、5 mL/kg劑量組、空白對照試驗組的各組織器官切片結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)損傷。20 mL/kg劑量組與對照組比肝臟、腎臟、小腸出現(xiàn)了一定的病理損傷，其中肝臟出現(xiàn)輕微的肝細(xì)胞變性和灶狀壞死；腎小管被破壞，管腔擴(kuò)張[7]；小腸絨毛變短，淋巴濾泡浸潤，腸壁變薄。將黃連解毒湯20 mL/kg劑量組和對照組大鼠的脾、肺、肝、腎、胃、腸等組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片對比（圖1）。

20 mL/kg劑量組脾×10??????對照組脾×10

20 mL/kg劑量組肺×10??????對照組肺×10

20 mL/kg劑量組胃×10??????對照組胃×10

20 mL/kg劑量組肝×10??????對照組肝×10

20 mL/kg劑量組腎×10??????對照組腎×10

高劑量組腸×10 ??????對照組腸×10

圖1 大鼠20 mL/kg劑量組與空白組臟器組織切片HE染色圖

3 討論

給藥后第2天，黃連解毒湯20 mL/kg劑量組大鼠糞便變稀，而10 mL/kg、5 mL/kg與對照組相比無顯著變化，分析可能是黃連解毒湯中黃連、梔子有瀉下的作用，過量使用后導(dǎo)致大鼠排便異常。這種瀉下作用導(dǎo)致20 mL/kg劑量組大鼠體重增重減少，飼料利用率降低，小腸絨毛變短，腸壁變薄。除此之外，與對照組相比，其它試驗組的體重增重、食物利用率等臨床表現(xiàn)均屬正常。連續(xù)給藥42 d后，黃連解毒湯20 mL/kg劑量組血清中BUN、Cr、ALT含量升高，說明黃連解毒湯高劑量組對大鼠的肝腎功能有影響[8]。而黃連解毒湯試驗其他組大鼠的血常規(guī)及各項血液生化檢測指標(biāo)結(jié)果相近，說明黃連解毒湯對大鼠正常生理功能不會產(chǎn)生影響。作為藥物代謝的主要場所，黃連解毒湯20 mL/kg組大鼠肝臟和腎臟出現(xiàn)了輕微損傷，分析是長期高劑量服用黃連解毒湯導(dǎo)致藥物在大鼠體內(nèi)不能被快速的代謝排出，大量蓄積而產(chǎn)生毒副作用，進(jìn)一步說明了肝臟和腎臟是黃連解毒湯所作用的主要靶器官。然而，黃連解毒湯10 mL/kg組和5 mL/kg組大鼠的脾、肺、肝、腎、胃等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化，說明黃連解毒湯在該劑量下長期服用不會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Subchronic Toxicity of Coptidis Toxin Resolving Decoction in Rats

LIU Fang2,3, WANG Li-hong2,3, DONG Hui-feng3, ZHAO Jing-jing2,3, ZHANG Jun-xia3, LIU Ding-kuo1,2,3,Corresponding Author

（1. College of Veterinary Medicine at CAU , Beijing 100094, China; 2. Enterprise Key Laboratory of Feed Microbial Preparation, Tianjin 300383, China; 3. S&E animal pharmaceutical（Tianjin）Co, Ltd. , Tianjin 300383, China）

The subchronic toxicity of Coptidis Toxin Resolving Decoction in SD rats is researched by continuous perfusion in order to expose its clinical innocuity. 120 SD rats（males and females）were randomly devivided into control group and Coptidis Toxin Resolving Decoction in 3 different dosage groups（20, 10, and 5 mL/kg, 30 in each group）. The SD rats were administered with Coptidis Toxin Resolving Decoction by continuous perfusion for 6 weeks. The body weight, hematology, blood biochemistry and histopathology examination were measured for the overall toxicity assessment to rats. After 42 days, contrasted with the control group, the test group rats blood routine examination index and blood index had an approximately result（＞0.05）. The result of histopathological slices showed that the liver and kidney of Coptidis Toxin Resolving Decoction 20 mL/kg group rats appeared slight damage, while the spleen, lung, liver, kidney and stomach of Coptidis Toxin Resolving Decoction 10 mL/kg group and 5 mL/kg group does not find abnormal histopathologic change. Conclusion With a dose of 10 mL/kg and 5 mL/kg Coptidis Toxin Resolving Decoction continuous perfusion, there is not harmful effect on SD rats.

Coptidis Toxin Resolving Decoction; rat; subchronic toxicity

1008-5394（2017）01-0023-05

S854.5

A

2016-04-25

天津市科技支撐計劃項目“中草藥在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用與開發(fā)”（13ZCZDNC00700）

劉芳（1988－），女，山東濰坊人，助理畜牧師，碩士，主要從事中獸藥新制劑開發(fā)。E-mail：liuf1201@163.com。

劉鼎闊（1981－），男，內(nèi)蒙古赤峰人，畜牧師，碩士，主要從事中獸藥新制劑開發(fā)。E-mail：liudingkuo1981@163.com。