程吟文，谷成剛，劉總堂，朱夢(mèng)榮，劉 暢，葉 茂，卞永榮，楊興倫，蔣 新

(1 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

PBDEs好氧微生物降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程及熱力學(xué)機(jī)制研究①

程吟文1,2，谷成剛1*，劉總堂1,2，朱夢(mèng)榮1,2，劉 暢1,2，葉 茂1，卞永榮1，楊興倫1，蔣 新1

(1 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

多溴聯(lián)苯醚 (PBDEs)是一種曾在全球范圍內(nèi)被廣泛使用的溴代阻燃劑，具有半揮發(fā)性、生物蓄積性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和人體健康安全。本研究選擇典型好氧降解菌伯克氏菌屬LB400，對(duì)環(huán)境中普遍檢出的中低溴聯(lián)苯醚開(kāi)展了降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究，探討了外加碳源作為共代謝底物對(duì)降解性能的影響，模擬計(jì)算了降解中關(guān)鍵反應(yīng)路徑熱力學(xué)狀態(tài)函數(shù)性質(zhì)變化，以揭示其與表觀降解速率常數(shù)k之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明：聯(lián)苯作為共代謝底物時(shí)PBDEs的去除效率最高，在降解菌的作用下，0 ~ 120 h內(nèi)中低溴代PBDEs均能夠發(fā)生降解，降解過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。羥基化反應(yīng)可能是PBDEs微生物降解過(guò)程的速控步驟，相比于間/對(duì)位取代，活性氧自由基如·OH更傾向于攻擊苯環(huán)碳原子的鄰/間位置，這為揭示PBDEs好氧微生物降解的分子作用機(jī)制，促進(jìn)土壤中高效好氧降解菌的選育與污染修復(fù)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

多溴聯(lián)苯醚；共代謝；降解動(dòng)力學(xué)；羥基化；熱力學(xué)機(jī)制

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs) 作為一種典型的添加型溴代阻燃劑，由于其熱穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，曾被大量應(yīng)用于各種電子電器、建材紡織和石油化工等工業(yè)領(lǐng)域中[1–2]。然而，隨著溴代阻燃劑使用量的不斷上升，目前全球范圍內(nèi)包括土壤、水、大氣、沉積物與底泥，以及不同生物組織等多種環(huán)境介質(zhì)中均有PBDEs的檢出[3–8]。PBDEs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有半揮發(fā)性和生物蓄積性，可通過(guò)食物鏈傳遞作用進(jìn)入人體并產(chǎn)生生物累積與生物放大效應(yīng)[9–10]。據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，PBDEs作為一種典型的內(nèi)分泌干擾物[11]，可干擾生物體雌激素和甲狀腺激素代謝水平[9–10]，且具有神經(jīng)毒性[12–16]、生殖毒性和胚胎毒性等[17–19]，嚴(yán)重威脅人體健康安全。由于商用五溴聯(lián)苯醚和八溴聯(lián)苯醚在2009年《斯德哥爾摩公約》中被新增列入“持久性有機(jī)污染物(POPs)”受控名單，PBDEs污染所帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題備受關(guān)注。

微生物降解是環(huán)境中有機(jī)污染物自然消減的主要方法，也是PBDEs污染消除的重要途徑之一，包括好氧、厭氧與混合功能微生物降解技術(shù)[20–25]。其中，好氧微生物降解周期短、成本低、能夠徹底開(kāi)環(huán)并礦化完全，已成為微生物降解研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。研究表明，好氧微生物如鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. PH-07[26]、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[27]、紅球菌Rhodococcusjostii RHA1和伯克氏菌Brkholderia xenovorans LB400[28]均可在聯(lián)苯醚等不同碳源存在的情況下，發(fā)生共代謝降解PBDEs，其降解性能除受底物水溶性、溫度、pH和外加碳源種類的影響外[29]，更取決于PBDEs中溴原子取代位置和數(shù)量：隨著溴取代基數(shù)目的增加，PBDEs降解性能下降，且降解開(kāi)環(huán)反應(yīng)更容易發(fā)生在沒(méi)有溴原子取代的苯環(huán)上[28]。與結(jié)構(gòu)相似的多氯聯(lián)苯(PCBs)類似，PBDEs好氧微生物降解過(guò)程亦可能受聯(lián)苯代謝基因(bph途徑)及其編碼酶——聯(lián)苯雙加氧酶(BPDO)的催化調(diào)控而優(yōu)先羥基化，繼而脫氫，環(huán)裂解和水解礦化為小分子物質(zhì)[30–31]。然而，由于現(xiàn)已分篩的PBDEs高效降解菌相對(duì)匱乏，加之實(shí)際降解過(guò)程復(fù)雜、影響因素繁多而使得降解產(chǎn)物和中間體捕獲鑒定分析困難，PBDEs好氧降解機(jī)理的認(rèn)識(shí)還處于初始階段，尤其羥基化反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制與意義也不清晰。因此，本研究選擇對(duì)中低溴代聯(lián)苯醚具有一定降解能力的伯克氏菌Brkholderia xenovorans LB400，開(kāi)展典型 PBDEs好氧微生物降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程和底物影響研究，模擬計(jì)算關(guān)鍵反應(yīng)路徑的熱力學(xué)函數(shù)性質(zhì)變化，探討微生物表觀降解性能與羥基化、脫氫等反應(yīng)熱力學(xué)函數(shù)變化之間的關(guān)系，并闡釋相關(guān)作用機(jī)制，以期從熱力學(xué)受控性角度反映羥基化反應(yīng)對(duì)于整個(gè)好氧降解通道的決定性意義，從而為PBDEs高效好氧降解菌的選育與污染修復(fù)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

試驗(yàn)選取6種典型PBDEs，包括2-一溴聯(lián)苯醚(BDE-1)，2,2'-二溴聯(lián)苯醚(BDE-4)，2,4,4'-三溴聯(lián)苯醚(BDE-28)，2,2',4,4'-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)，2,2',3, 4,4'-五溴聯(lián)苯醚(BDE-85)和 2,2',3,4,4',5'-六溴聯(lián)苯醚(BDE-138)，純度均為99.5%，購(gòu)于美國(guó)AccuStandard公司；色譜純正己烷購(gòu)于德國(guó)Merck KgaA公司；試驗(yàn)中使用的無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、無(wú)水硫酸鈉等試劑，均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用菌種選擇對(duì)PCBs具有廣譜降解能力的優(yōu)勢(shì)菌B. xenovorans LB400[32]，購(gòu)自德國(guó)菌種保藏中心(DSMZ no. 17367)。LB400菌株活化和培養(yǎng)采用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)作為碳源，購(gòu)自青島希望生物技術(shù)有限公司。稱取6 g TSB，加水200 ml配制TSB液體培養(yǎng)基，滅菌后取少量加入安瓿瓶?jī)?nèi)，活化LB400凍干粉末。稱取6 g TSB、3 g 瓊脂，加入200 ml水于三角燒瓶中，滅菌冷卻后于超凈工作臺(tái)中倒平板，制作TSB固體培養(yǎng)基。用平板劃線法將菌株接種至 TSB固體培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后，取一環(huán)單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行放大培養(yǎng)(30℃ 恒溫水浴，150 r/min)。當(dāng)微生物生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取菌液離心(20 min、3 000 r/min)，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗2遍，接種至無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(DSMZ medium no.457)中，加入共代謝底物在恒溫水浴中條件下繼續(xù)培養(yǎng)(30℃，150 r/min)。培養(yǎng)基中其他無(wú)機(jī)鹽化合物均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。所有培養(yǎng)基在使用前均經(jīng)過(guò) 121℃、20 min高溫高壓滅菌處理。菌液生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(OD600)獲得。

1.3 PBDEs共代謝底物篩選與降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

PBDEs好氧微生物降解一般是通過(guò)外加碳源共代謝的方式來(lái)完成的。分別以10 mmol/L的聯(lián)苯、乙醇和乙酸乙酯作為外加碳源加入降解體系中，并設(shè)置一組不加共代謝底物的空白對(duì)照。設(shè)置BDE-47在降解體系中的初始濃度為100 μg/L，分別在降解體系建立后的0、3、9、24、48、72 h進(jìn)行取樣，測(cè)定溶液體系中 BDE-47隨時(shí)間變化的降解殘留，并計(jì)算BDE-47在不同底物存在下的去除效果。

在PBDEs好氧降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)體系中，以10 mmol/L的聯(lián)苯作為底物，利用好氧降解菌LB400對(duì)BDE-1、BDE-4、BDE-28、BDE-85和BDE-138進(jìn)行降解動(dòng)力學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)中選用單標(biāo)化合物溶于異辛烷中并調(diào)節(jié)溶液濃度為50 μg/ml，用移液槍移取10 μl于12 ml玻璃樣品瓶中，置通風(fēng)櫥中待溶劑揮發(fā)。5 min后，接種無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液(OD600約為0.26 ~ 0.27)5 ml于樣品瓶中，無(wú)菌透氣封口膜封口，降解初始濃度為100 μg/L。設(shè)置空白對(duì)照組，在污染物中加入5 ml滅菌后的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，使?jié)舛韧瑯訛?00 μg/L。為了避免偶然誤差，所有處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行。所有的樣品置于恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)(30℃，150 r/min)[28]。由于不同溴代模式PBDEs降解周期不同，對(duì)于每種化合物的取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置也不相同。

1.4 測(cè)定方法

降解體系中PBDEs殘留的提取采用正己烷(1︰1，v/v)液–液萃取方法。待萃取完全，轉(zhuǎn)移2 ml有機(jī)相至離心管中，加入0.5 ml無(wú)水硫酸鈉，12 000 r/min下離心1 min以去除水分和細(xì)菌殘留，靜置30 min，轉(zhuǎn)移1 ml至GC棕色進(jìn)樣瓶中，等待進(jìn)樣測(cè)定。PBDEs定量分析采用Aglilent 7890A-ECD氣相色譜儀。選擇DB-5毛細(xì)管色譜柱(30.0 m ′ 0.32 mm ′ 0.25 μm)，進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別設(shè)為265℃ 和 300℃，設(shè)計(jì)升溫程序如下：初始溫度為140℃，保持2 min；后以 5℃/min的速度升至 180℃，保持 5 min；再以5℃/min的速度升至 260℃，保持 2 min；最后以15℃/min的速度升至315℃，保持 21 min。載氣為N2，采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1 μl。試驗(yàn)中 PBDEs的殘留濃度采用外標(biāo)法測(cè)定，獲得各單標(biāo)PBDEs化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2均大于0.999。溶液體系中PBDEs的回收率在84% ~ 128%。

1.5 理論計(jì)算與數(shù)據(jù)分析

為揭示PBDEs好氧微生物降解過(guò)程的熱力學(xué)受控性，圍繞降解過(guò)程中關(guān)鍵反應(yīng)步驟，假定鄰(ortho)/間(meta)位-、間(meta)/對(duì)(para)位–雙加氧，即羥基親核加成反應(yīng)和脫氫反應(yīng)歷經(jīng)通道分別如圖1(a ~ c)，采用量子化學(xué)半經(jīng)驗(yàn)分子軌道 AM1計(jì)算方法對(duì)PBDEs與活性氧自由基HO·以及反應(yīng)中間體IM1、IM2和 IM1￠等(圖 1)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率分析，并計(jì)算熱力學(xué)狀態(tài)函數(shù)——反應(yīng)吉布斯自由能變化(ΔrG)，即ortho/meta-羥基化和脫氫反應(yīng)吉布斯自由能變?chǔ)G1和ΔrG2，以及 meta/para-羥基化反應(yīng)吉布斯自由能變?chǔ)G1。其中，ΔrG為產(chǎn)物吉布斯自由能與反應(yīng)物吉布斯自由能的差值，即ΔrG=Σ(ε0+Gcorr)products–Σ (ε0+Gcorr)reactants(ε0和Gcorr分別為總電子能和吉布斯自由能校正值)。結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率分析以Gaussian 03軟件完成[33]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異性比較分析采用t檢驗(yàn)或單因子方差分析方法(ANOVA)，以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成。

圖1 PBDEs好氧降解中理論假定起始反應(yīng)通道Fig. 1 Initial reaction routes theoretically hypothesized for PBDEs aerobic biodegradation

2 結(jié)果與討論

2.1 PBDEs好氧微生物降解的底物選擇性與降解動(dòng)力學(xué)

前人研究表明，選擇合適的外加碳源作為共代謝底物能夠顯著提高微生物對(duì)PBDEs的降解效率[34]。10 mmol/L聯(lián)苯、乙醇和乙酸乙酯分別作為底物時(shí)，BDE-47的加標(biāo)回收率分別在87.1% ~ 93.7%，如表1所示。方差分析顯示，3種底物對(duì)BDE-47的回收率不存在顯著性差異(P>0.05)，表明加入底物不會(huì)對(duì)PBDEs的提取效率造成顯著影響。然而，加入底物能夠?qū)?BDE-47的降解效率產(chǎn)生顯著影響。在 72 h范圍內(nèi)，較BDE-47為唯一碳源時(shí)，加入不同的底物能夠提高BDE-47的降解效率(圖2)，這可能是由于BDE-47的水溶性較低，LB400難以直接利用其作為生長(zhǎng)底物而進(jìn)行自身代謝增殖，相反加入水溶解度較大的乙醇等底物時(shí)，可以作為能量碳源而為微生物生長(zhǎng)利用，促進(jìn)BDE-47的降解。不同底物相較而言，聯(lián)苯最能提高BDE-47的降解效率(53.07%)，其次分別為乙醇(37.39%)和乙酸乙酯(25.28%)(表1)，這可能是由于聯(lián)苯作為代謝底物時(shí)，其與BDE-47的結(jié)構(gòu)相似性能夠激發(fā)微生物降解反應(yīng)中相關(guān)酶的活性，從而提高降解效率[34]。

表1 共代謝底物選擇對(duì)BDE-47降解效率的影響(%)Table 1 Degradation ratios of BDE-47 under different substrates

圖2 降解周期內(nèi)BDE-47在不同共代謝底物作用下的降解動(dòng)力學(xué)Fig. 2 Biodegradation kinetics of BDE-47 under different substrates in its degradation period

在未經(jīng)微生物處理的空白對(duì)照組中，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)下PBDEs殘留量進(jìn)行了測(cè)定。根據(jù)單因素方差分析，隨著時(shí)間推移，各空白對(duì)照組溶液體系中PBDEs的殘留量沒(méi)有顯著性變化(P>0.05，圖 3)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)PBDEs的化學(xué)轉(zhuǎn)化與揮發(fā)作用等因素可以忽略不計(jì)；相反，在微生物處理下PBDEs的殘留變化，可推斷其源自微生物的降解作用。LB400處理下，不同PBDEs異構(gòu)體化合物的殘留濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降(P<0.05)，其降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程如圖4所示。圖4顯示，PBDEs好氧微生物降解過(guò)程在120 h范圍內(nèi)均能夠達(dá)到平衡狀態(tài)；然而，隨著溴代程度的提高，降解平衡時(shí)間延長(zhǎng)，降解效率下降，如從 BDE1到BDE138，降解效率從100% 降低為48.4%，與前人的研究結(jié)果相一致[28]。這可能是由于溴原子取代使PBDEs分子體積增大，與聯(lián)苯雙加氧酶BphA1蛋白接觸并發(fā)生有效親合作用的難度增大，從而導(dǎo)致降解效率降低，降解周期相對(duì)延長(zhǎng)。

圖3 微生物空白對(duì)照組PBDEs殘留變化方差分析P值Fig. 3 p values given by One-way ANOVA of PBDEs concentration in control group

前人研究發(fā)現(xiàn)[34]，好氧降解菌施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri BFR-01能夠有效降解BDE-47，兩周內(nèi)的降解效率達(dá) 97.94%，降解過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。為此，本研究以一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程ln(C/C0)= –kt+a(式中：t為降解時(shí)間，h；C0和 C分別為PBDEs初始與時(shí)間t下的濃度，μg/L；k為一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，h–1；a為常數(shù)項(xiàng))對(duì) LB400降解PBDEs動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了擬合。從線性擬合結(jié)果來(lái)看，一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程能夠較好地反映菌株對(duì)PBDEs的降解趨勢(shì)(線性擬合決定系數(shù)R2在0.910 ~ 0.991，圖4)，LB400 對(duì)PBDEs的降解過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征，BDE-1、BDE-4、BDE-28、BDE-47、BDE-85和BDE-138降解速率常數(shù)k分別為0.754、0.218、0.028、0.009 7、0.007 5和0.006 2 h–1。與溴代數(shù)目的相關(guān)性分析可以看出，降解速率與溴代數(shù)目呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2達(dá) 0.998)，即隨溴代數(shù)的增加，呈現(xiàn)一級(jí)指數(shù)衰減趨勢(shì)。

圖4 PBDEs好氧微生物降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程及線性擬合Fig. 4 Process of aerobic biodegradation kinetics of PBDEs and their linear fit analyses

2.2 PBDEs好氧微生物降解的熱力學(xué)受控性

受聯(lián)苯調(diào)控途徑 bph基因及其編碼酶的酶促作用，PBDEs好氧微生物降解過(guò)程中也可能起始發(fā)生ortho/meta-位、meta/para-位羥基化和脫氫反應(yīng)，為此本研究計(jì)算了 PBDEs及其不同位置羥基化和脫氫反應(yīng)中間體的熱力學(xué)性質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)摩爾生成吉布斯自由能，并由此得到相應(yīng)的活化吉布斯自由能變 ΔrG。根據(jù) PBDEs好氧微生物降解反應(yīng)通道的理論假定，起始反應(yīng)步驟的吉布斯自由能變計(jì)算值見(jiàn)表2。

表2 PBDEs好氧降解過(guò)程中羥基化與脫氫反應(yīng)ΔrG計(jì)算值(kJ/mol)Table 2 Calculation of ΔrG of hydroxylation and dehydrogenation of PBDEs in aerobic biodegradation

PBDEs好氧微生物降解是由一系列復(fù)雜的基元反應(yīng)組成的，其表觀降解速率常數(shù)k是各基元反應(yīng)降解速率常數(shù)的線性或非線性組合。然而，由于調(diào)控各基元反應(yīng)發(fā)生的蛋白酶結(jié)構(gòu)不同、功能各異，其對(duì)活化能降低和整個(gè)降解過(guò)程速率的調(diào)節(jié)與貢獻(xiàn)也各不相同。類似于一般化學(xué)反應(yīng)，PBDEs好氧微生物降解具有熱力學(xué)受控性。根據(jù)反應(yīng)過(guò)渡態(tài)理論[35]，基元反應(yīng)吉布斯自由能變與其反應(yīng)速率常數(shù) lnkn之間呈線性關(guān)系，即 ，其中，n =1，2，…，是常數(shù)。

因此，以基元反應(yīng)過(guò)程的活化吉布斯自由能變來(lái)表征其反應(yīng)速率并探討與表觀速率常數(shù)之間的關(guān)系，量化其對(duì)表觀速率常數(shù)的貢獻(xiàn)，可從熱力學(xué)角度揭示降解途徑中各反應(yīng)步驟對(duì)總反應(yīng)速率的影響，有助于明晰降解途徑的分子作用機(jī)制。研究表明，bph上游基因編碼酶 BphA調(diào)控羥基化的過(guò)程是 PBDEs好氧微生物降解的起始反應(yīng)[36]。當(dāng) PBDEs苯環(huán)的ortho/meta-位置被羥基自由基進(jìn)攻時(shí)，生成溴代2,3-二羥基聯(lián)苯醚，其活化吉布斯自由能變?chǔ)G1與表觀速率常數(shù)lnk的關(guān)系如圖5a所示。從圖5a中可以看出，二者之間有著較強(qiáng)的線性關(guān)系，R2達(dá)到了0.981，暗示 ortho/meta-位羥基化反應(yīng)速率與表觀速率密切相關(guān)，對(duì) PBDEs好氧微生物降解反應(yīng)的限制與調(diào)控，具有重要意義。這可能是由于BphA，尤其是α亞基BphA1的底物選擇范圍通常窄于降解途徑中的其他酶，從而限制了羥基化反應(yīng)的進(jìn)行。PBDEs雙加氧的過(guò)程還需催化脫氫反應(yīng)步驟。由表2可知，催化脫氫反應(yīng)步驟的活化吉布斯自由能變相對(duì)較小，意味反應(yīng)進(jìn)行所需翻躍的勢(shì)能壘較低，反應(yīng)速率較快。催化脫氫活化吉布斯自由能變?chǔ)G2與表觀反應(yīng)速率常數(shù)lnk之間的關(guān)系，如圖5B所示。由圖5B分析可知，催化脫氫活化吉布斯自由能變與 lnk間無(wú)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明催化脫氫反應(yīng)步驟進(jìn)行較快，對(duì)表觀速率常數(shù)的影響較弱而不屬限速步驟；相較而言，ortho/meta-位羥基化反應(yīng)可能屬于限速步驟。

圖5 PBDEs好氧微生物降解表觀反應(yīng)速率常數(shù)與吉布斯自由能變的相關(guān)關(guān)系Fig. 5 Correlations between aerobic biodegradation kinetics constants of PBDEs and Gibbs free energy change

若 PBDEs苯環(huán)的 meta/para-位置發(fā)生羥基自由基的進(jìn)攻反應(yīng)，其反應(yīng)活化吉布斯自由能變 ΔrG1￠與表觀速率常數(shù)lnk之間沒(méi)有很好的線性相關(guān)關(guān)系，R2僅為0.008，如圖5C，說(shuō)明PBDEs好氧微生物降解速率與meta/para-位羥基化反應(yīng)速率的相關(guān)性較差。值得注意的是，當(dāng)圖5C中將BDE-138化合物剔除時(shí)，其他5種PBDEs羥基化反應(yīng)吉布斯自由能變與其lnk間的線性關(guān)系大為改善。從結(jié)構(gòu)上可以看出，相比于其他BDE化合物，BDE-138溴代程度更高、立體空間位阻更大，從而使其與BphA1蛋白的活性位點(diǎn)接觸難度變大；且 BDE-138的 meta-位有兩個(gè)位置被Br原子取代，而其他化合物中只有 BDE-85有一個(gè)meta-位被取代，·OH很難與苯環(huán)碳原子發(fā)生親核加成，導(dǎo)致meta-位羥基化反應(yīng)很難發(fā)生。

因此，從羥基化反應(yīng)活化吉布斯自由能變與lnk的線性負(fù)相關(guān)關(guān)系來(lái)看，ortho/meta-位羥基化反應(yīng)發(fā)生的可能性明顯優(yōu)于meta/para-位取代模式，這在一定程度上與PBDEs好氧微生物降解中2,3-二羥基-4-苯氧基-4,6-己二烯產(chǎn)物的檢出很好地吻合[26]?？梢酝茢?，PBDEs好氧微生物降解過(guò)程中，活性氧自由基如·OH可攻擊苯環(huán)碳原子而發(fā)生親核加成并優(yōu)先在ortho/meta-位發(fā)生羥基化反應(yīng)，隨后發(fā)生催化脫氫反應(yīng)。其中，羥基化反應(yīng)為整個(gè)降解途徑各基元反應(yīng)的限速步驟。

3 結(jié)論

1) 利用LB400好氧降解菌，聯(lián)苯作為共代謝底物時(shí)，PBDEs的降解去除效率最高。LB400作用下，中低溴代PBDEs均能夠發(fā)生不同程度的降解，降解過(guò)程符合一級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，且降解效率隨著溴取代基數(shù)目的增加而降低。

2) PBDEs好氧微生物降解的熱力學(xué)受控性分析表明，羥基化反應(yīng)是PBDEs微生物降解反應(yīng)的速控步驟，這可能是由于聯(lián)苯雙加氧酶的 α亞基-BphA1的底物選擇范圍通常窄于降解途徑中的其他酶，在一定程度上阻礙了反應(yīng)的快速進(jìn)行。

3) 相比于間/對(duì)位取代，活性氧自由基如·OH更傾向于攻擊苯環(huán)的鄰/間位置而發(fā)生親核加成反應(yīng)，與 PBDEs好氧微生物降解中關(guān)鍵產(chǎn)物的檢出相吻合。這為明晰PBDEs好氧微生物降解的分子作用機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)高效好氧降解菌的選育與污染修復(fù)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Research on Aerobic Biodegradation Kinetics Process and Thermodynamic Mechanism of PBDEs

CHENG Yinwen1,2, GU Chenggang1*, LIU Zongtang1,2, ZHU Mengrong1,2, LIU Chang1,2, YE Mao1, BIAN Yongrong1, YANG Xinglun1, JIANG Xin1
(1 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are typified as kinds of brominated flame retardants which are widely used around the world. They have some characteristics like semi-volatilization, bioaccumulation, neurotoxicology and endocrine disrupting effects, which severely threaten the ecological system and human health. In this study, a typical aerobic biodegradation strain LB400 was chosen for the performance of degradation kinetics process of lower and middling PBDEs congeners, which are widely detected in the environment. The influence of extra carbon sources as the co-metabolism substrates on degradation performance was discussed. With the simulative computation of variation of thermodynamical state function of key reaction path during degradation, the relationship between the calculated thermodynamics and biodegradation kinetics constant was revealed as well. It is indicated that the highest degradation rate would be obtained if biphenyl were added as the carbon source. Within 0–120 h, all tested PBDEs could be effectively degraded by LB400, and the process could be well described by the first-order kinetics. Relatively, the initial hydroxylation of PBDEs might be the rate-limiting step in the degradation process, and such reactive oxygen radicals as ·OH prefers the nucleophilic addition at ortho/meta position to that occurred at meta/para sites of benzene ring. This study could help deeply understand the molecular mechanics of PBDEs aerobic biodegradation, provide some scientific proofs on the selection of highly efficient degradation strains in the soil as well as the application in the soil contaminated remediation.

PBDEs; Co-metabolism; Degradation kinetics; Hydroxylation; Thermodynamic mechanism

X13；X592

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.01.016

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21377138)、國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2014CB441105)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41271327和41271464)和中科院“一三五”計(jì)劃和領(lǐng)域前沿項(xiàng)目(ISSASIP1618)資助。

* 通訊作者(cggu@issas.ac.cn)

程吟文(1992—)，女，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向?yàn)镻BDEs好氧微生物降解及其分子作用機(jī)制。E-mail: ywcheng@issas.ac.cn