黃 湘 鐘裕恒 譚家余 吳學(xué)威 梁 睿 梁少霞 趙 婧

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,中山528403)

PSMA7對A549細(xì)胞中RB途徑的影響①

黃 湘 鐘裕恒 譚家余②③吳學(xué)威 梁 睿 梁少霞 趙 婧

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,中山528403)

目的：探究高表達(dá)和干擾PSMA7對A549細(xì)胞周期以及RB途徑中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響。方法：將pcDNA3.1-PSMA7高表達(dá)和pGPU6/Hygro-PSMA7-265干擾載體分別瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測PSMA7對細(xì)胞周期的影響，再通過Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平。結(jié)果：和對照組相比，PSMA7高表達(dá)時周期時相分布無明顯差異，但Cyclin D1、CDK4的蛋白表達(dá)水平明顯降低，P16、Rb的表達(dá)明顯增高；和對照組相比，干擾PSMA7后細(xì)胞的G0/G1、G2/M期比例均降低，而S期的值增高，均具有差異，而Cyclin D1、CDK4的蛋白表達(dá)水平明顯增加，P16、Rb的表達(dá)明顯降低，以上結(jié)果與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：PSMA7在A549肺腺癌細(xì)胞中能夠影響RB途徑中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平的表達(dá)，干擾PSMA7使A549細(xì)胞較早進(jìn)入S期。

HSPC238;RB途徑;細(xì)胞周期;免疫印跡

PSMA7基因編碼人類蛋白酶體α7亞基(Proteasome subunit，alpha type 7，PSMA7)，該蛋白是20S蛋白酶體核心復(fù)合體的一個α亞基，它參與HBV、HCV和HIV病毒的復(fù)制及多種蛋白質(zhì)的降解[1-3]，并與HIF-1、c-Abl及Arg等多種腫瘤相關(guān)的重要蛋白質(zhì)相互作用[4，5]，但與腫瘤的相關(guān)性仍知之甚少。我們的前期研究顯示PSMA7可抑制A549細(xì)胞的增殖能力和成瘤性[6]，但具體機(jī)制不清楚。RB途徑主要包括Cyclin D1、CDK4、P16、Rb等蛋白，與細(xì)胞的增殖存在密切關(guān)系。PSMA7抑制腫瘤的作用是否通過RB途徑起作用，還不得而知。本研究通過過表達(dá)和敲除A549細(xì)胞中的PSMA7，觀察其對A549細(xì)胞周期以及對Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響，探討PSMA7抑制A549細(xì)胞增殖和成瘤性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 肺腺癌細(xì)胞株A549由本實(shí)驗(yàn)室保存；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；RPMI1640粉及新生牛血清均購自Gibco BRL公司；pcDNA3.1和pcDNA3.1-PSMA7由本實(shí)驗(yàn)室保存和構(gòu)建；pGPU6/Hygro-PSMA7-265和pGPU6/Hygro-SHNC質(zhì)粒購于GenePharma公司；PSMA7、Cyclin D1、CDK4、P16和Rb抗體和相應(yīng)二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞在含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基中，以3×105細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合。按照LipofectamineTM2000說明書，將上述質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法導(dǎo)入A549細(xì)胞系中。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 0.25%胰酶分別消化轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞并提取其總蛋白，用分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白定量，以GAPDH為內(nèi)參。分別取50 μg細(xì)胞總蛋白電泳，然后將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，加相應(yīng)一抗(1∶500)反應(yīng)1.5 h,最后加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，發(fā)光顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 將轉(zhuǎn)染了PSMA7高表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒的細(xì)胞按4×105個/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，在合適條件下的孵箱中培養(yǎng)至80%以上的細(xì)胞融合度，加入1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用0.25%胰酶消化細(xì)胞后收集12 000個上機(jī)，DNA周期分析用美國PHEONIX公司的MULTYCYCLE軟件，最后計(jì)算出細(xì)胞各期的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 PSMA7的表達(dá) 如圖1和表1，與A549/pcDNA3.1細(xì)胞(0.732±0.058)相比，A549/pcDN-A3.1-PSMA7細(xì)胞(1.690±0.101)中的PSMA7表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。如圖1和表2，與轉(zhuǎn)染shNC細(xì)胞(0.765±0.077)相比，轉(zhuǎn)染shPSMA7細(xì)胞(0.287±0.058)的PSMA7表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。

2.2 PSMA7對RB途徑的影響 如圖2、3，瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后采用Western blot法分別檢測Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PSMA7高表達(dá)時使Cyclin D1、CDK4的表達(dá)明顯降低，P16和Rb的表達(dá)明顯增高；PSMA7干擾時使Cyclin D1和CDK4的表達(dá)明顯增加，P16和Rb的表達(dá)明顯降低。

2.3 PSMA7對A549細(xì)胞生長周期的影響 使用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與A549/pcDNA3.1(-)組對比，A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7組的細(xì)胞周期時相分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見圖4、表3。和shNC細(xì)胞組對比，shPSMA7細(xì)胞組的G0/G1、G2/M期細(xì)胞比例都降低，而S期的比例較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 表明干擾PSMA7后，A549細(xì)胞提早進(jìn)入S期(圖5，表4)。

圖1 Western blot法檢測敲低或者過表達(dá)PSMA7后的蛋白表達(dá)量Fig.1 Detection of protein level of downregulated or upregulated PSMA7 by Western blotNote：1.shNC；2.shPSMA7；3.A549/pcDNA3.1；4.A549/pcDNA3.1-PSMA7.

GroupsnDensityratiotPA549/pcDNA3 1(-)30 732±0 058-14 2820 000A549/pcDNA3 1(-)/PSMA731 690±0 101

GroupsnDensityratiotPshNC30 765±0 0778 5990 001shPSMA730 287±0 058

圖2 PSMA7對Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響(Western blot法)Fig.2 Effect of PSMA7 on protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb(Western blot)Note：1.shNC；2.shPSMA7；3.A549/pcDNA3.1；4.A549/pcDNA3.1-PSMA7.

圖3 PSMA7對Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響Fig.3 Effect of PSMA7 on protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb

圖4 PSMA7高表達(dá)組A549細(xì)胞周期的流式圖Fig.4 Results of cell cycles after PSMA7 overexpress by flow cytometer

GroupsnG0/G1G2/MSA549/pcDNA3 1(-)351 73±1 428 20±0 2640 06±1 16A549/pcDNA3 1(-)/PSMA7353 63±3 977 73±0 2538 63±3 84t-0 7802 2140 619P0 4790 0910 569

3 討論

PSMA7是20S蛋白酶體核心復(fù)合體的一個α亞基，參與組成泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，目前，蛋白酶體抑制劑已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新熱點(diǎn)，如環(huán)氧酮類藥物卡非佐米、硼酸類藥物硼替佐米和正在臨床研究階段的β-內(nèi)酯類藥物Marizomib[7-9]。研究20S蛋白酶體核心復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，對于進(jìn)一步開發(fā)蛋白酶體抑制劑，促進(jìn)腫瘤疾病的防治具有重要意義。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中,癌組織胞漿中PSMA7蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織胞漿的表達(dá)[10]。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSMA7具有抑制A549肺腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的作用，同時通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)具有抑制肺腺癌形成的作用[6]。另外，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PSMA7可引起A549細(xì)胞表面黏附分子ICAM-1和VCAM-1 表達(dá)量減少，反之，干擾PSMA7可引起ICAM-1和VCAM-1 表達(dá)量增加，提示其可能通過此途徑參與肺腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]，但PSMA7在腫瘤組織中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還不清楚。

圖5 干擾組A549細(xì)胞的細(xì)胞周期流式圖Fig.5 Results of cell cycles after PSMA7 knocked out by flow cytometer

GroupsnG0/G1G2/MSshNC461 53±2 407 40±0 5831 10±2 08shPSMA7456 33±2 005 80±0 6737 93±1 47t-3 335-3 6085 353P0 0160 0110 002

本研究通過探討PSMA7與RB途徑的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)干擾PSMA7使Cyclin D1和CDK4的表達(dá)明顯增加，P16和Rb的表達(dá)明顯降低；反之，PSMA7高表達(dá)時使Cyclin D1和CDK4的表達(dá)明顯降低，P16和Rb的表達(dá)明顯增高。提示PSMA7可能通過影響RB通路從而參與細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的過程。既往研究表明，Cyclin D1、CDK4、p16、pRb、E2F之間通過復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)環(huán)路[12]，調(diào)控著細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換。Cyclin D1的激活是細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的始動環(huán)節(jié)，CDK4的活性受Cyclin D1的正向調(diào)控，而p16可以通過與Cyclin D1競爭CDK4參與其負(fù)向調(diào)控。最終CDK4通過影響Rb蛋白磷酸化狀態(tài)調(diào)控E2F的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控著細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換。

由于Cyclin D1是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的[13]，PSMA7是20S蛋白酶體核心復(fù)合體的一個重要的α亞基，而我們的研究發(fā)現(xiàn)和對照組相比，PSMA7高表達(dá)時周期時相分布無明顯差異，但Cyclin D1和CDK4的蛋白表達(dá)水平明顯降低，P16和Rb的表達(dá)明顯增高；與對照組相比，干擾PSMA7后細(xì)胞的G0/G1、G2/M期比例均降低，而S期的比例高，均具有差異，而Cyclin D1和CDK4的蛋白表達(dá)水平明顯增加，P16和Rb的表達(dá)明顯降低。PSMA7高表達(dá)時周期時相分布無明顯差異可能是由于啟動了負(fù)反饋機(jī)制造成的。由以上結(jié)果我們猜測，PSMA7很可能通過影響Cyclin D1的降解從而參與調(diào)控RB途徑從而影響細(xì)胞周期。另外，有報道發(fā)現(xiàn)PSMA7可以與HIF-1α結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄[14]，而在A549細(xì)胞中，HIF-1α可以調(diào)節(jié)Cyclin D1[15]，故我們推測PSMA7也可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α從而影響Cyclin D1，進(jìn)而影響RB途徑中的其他周期蛋白的水平。不過，Cyclin D1、CDK4、p16、pRb、E2F之間有著復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，PSMA7影響RB途徑的具體機(jī)制還有待探索。我們目前正進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證這些猜想。

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[收稿2016-03-31 修回2016-07-14]

(編輯 張曉舟)

Effect of PSMA7 on RB pathway in A549 cells

HUANGXiang,ZHONGYu-Heng,TANJia-Yu,XUXue-Wei,LIANGRui,LIANGShao-Xia,ZHAOJing.

PrenatalDiagnosisCenter，BoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Zhongshan528403,China

Objective:To investigate the effect of upregulated and downregulated PSMA7 on the cell cycle and Cyclin D1，CDK4，P16，Rb of RB pathway in A549 cells.Methods：Transfected upregulated pcDNA3.1-PSMA7 vecter and downregulated pGPU6/Hygro-PSMA7-265 vecter into A549 cells,and then tested the effect of PSMA7 on the cell cycle of A549 cells by flow cytometry,and detected the protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb by Western blot.Results：Compared with the control group,the cell cycle of the A549 cells did not change significantly,and the expression of Cyclin D1，CDK4 decreased but P16，Rb increased when PSMA7 was upregulated.Compared with the control group,the proportion of phase G0/G1,G2/M of the A549 cells decreased and phase S increased,and the expression of Cyclin D1，CDK4 increased but P16，Rb decreased when PSMA7 was downregulated.There was statistical significance for those results.Conclusion：PSMA7 could affect the expression of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb protein level of RB pathway in A549 and promoted the A549 cells into phase S when it′s downregulated.

HSPC238;RB pathway;Cell cycle;Western blot

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.008

①本文受廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(A2013875)和國家自然科學(xué)基金 (81101534) 資助。

黃 湘(1971年-)，女，博士，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫及產(chǎn)前診斷研究，E-mail:340382761@qq.com。

R34

A

1000-484X(2017)04-0516-04

②南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院中心ICU,中山528403。

③通訊作者,E-mail:28242174@qq.com。