肖青川 蘭天罡 兌丹華

(1 武警四川總隊(duì)醫(yī)院肝膽一外科，樂山，614000； 2 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰外科，遵義，563003)

清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠胰腺損傷的保護(hù)作用

肖青川1蘭天罡2兌丹華2

(1 武警四川總隊(duì)醫(yī)院肝膽一外科，樂山，614000； 2 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰外科，遵義，563003)

目的：觀察清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑對(duì)重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)大鼠胰腺損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。方法：將18只SD大鼠隨機(jī)等分為假手術(shù)組(A組)、SAP組(B組)、治療組(C組)。以30 g/L?；悄懰徕c逆行注入胰膽管制作大鼠SAP模型。C組以250 g/L清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑灌胃給藥(10 mL/kg)，1次/6 h，A組、B組用同等劑量生理鹽水以相同方式灌胃。制模后24 h取材，用real-time PCR檢測(cè)胰腺組織中Hmgb1 mRNA表達(dá)，ELISA測(cè)定胰腺組織中一氧化氮和內(nèi)皮素-1濃度，同時(shí)觀察胰腺組織病理改變，測(cè)定胰腺組織濕/干重比值。結(jié)果：B組有胰腺組織損傷改變，Hmgb1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，一氧化氮和內(nèi)皮素-1濃度升高；清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑可下調(diào)胰腺組織中Hmgb1mRNA的表達(dá)，降低一氧化氮及內(nèi)皮素-1濃度，減輕胰腺病理損害程度。結(jié)論：Hmgb1、一氧化氮及內(nèi)皮素-1在SAP胰腺損傷中可能具有重要作用，清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑可能通過下調(diào)胰腺組織中Hmgb1 mRNA的表達(dá)，降低一氧化氮和內(nèi)皮素-1濃度，減輕胰腺組織的病理改變，從而保護(hù)胰腺損傷。

高遷徙率族蛋白-1；內(nèi)皮素-1；一氧化氮；重癥急性胰腺炎；大鼠

重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)發(fā)生時(shí)，首要出現(xiàn)的是胰腺自身的病理生理變化，包括胰腺的充血、水腫、出血及壞死，內(nèi)外分泌功能的紊亂等，胰腺損傷是發(fā)生這些變化的基礎(chǔ)。普遍認(rèn)為SAP胰腺損傷發(fā)生機(jī)制是胰腺微循環(huán)障礙[1]。而多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子在胰腺微循環(huán)障礙中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀測(cè)清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑干預(yù)措施下，SAP大鼠胰腺組織病理學(xué)變化、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)濃度變化及胰腺組織中高遷徙率族蛋白-1(high mobility group box 1，Hmgb1)mRNA表達(dá)改變，探討清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑對(duì)SAP大鼠胰腺損傷是否有保護(hù)作用，及其可能的作用機(jī)制，以便為該藥的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠18只，購自第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物室(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK-(軍)2012008)，體質(zhì)量150～200 g，雌雄不拘。

1.1.2 藥物 ?；悄懰徕c(美國Sigma公司)。清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院研制)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠ET-1、NO定量ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑、RNAiso Reagent、PCR反應(yīng)試劑(大連寶生物工程有限公司)，熒光定量PCR儀器(iCycler iQ，Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將18只大鼠等分為假手術(shù)組(A組)、SAP組(B組)、治療組(C組)。參照文獻(xiàn)[2]的方法復(fù)制SAP模型：100 g/L水合氯醛注射腹腔麻醉大鼠，上腹正中切口進(jìn)腹。

1.2.2 給藥方法 A組進(jìn)腹后僅翻動(dòng)腸管即關(guān)腹；其余2組大鼠開腹后提起十二指腸，用血管夾分別夾住肝門部胰膽管和十二指腸端，向胰膽管內(nèi)逆行緩慢注入30 g/L牛磺膽酸鈉溶液2 mL/kg，時(shí)間1 min，后保持2 min再關(guān)腹。制模后1 h每組大鼠灌胃：A、B組喂飼生理鹽水10 mL/kg，C組喂飼等量250 g/L清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑。其后，重復(fù)灌胃1次/6 h。24 h后處死大鼠，取材檢測(cè)各相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察和濕/干重比值測(cè)定：處死大鼠后，取胰腺組織做常規(guī)HE染色。采用盲法，由專人在光學(xué)顯微鏡鏡下觀察胰腺組織病理改變，并進(jìn)行病理評(píng)分[3]。用吸水紙吸干新鮮胰腺組織水分，電子天平稱量濕重。再置于干燥箱中，60 ℃干燥72 h，稱量干重，計(jì)算濕/干重比值。胰腺組織中Hmgb1基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定和相對(duì)定量分析：以real-time PCR法檢測(cè)胰腺組織內(nèi)Hmgb1及β-actin的mRNA表達(dá)水平[1]。以β-actin作為內(nèi)參，引物上游序列：5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′，下游序列：5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度104 bp(大連寶生物合成)。Hmgb1基因引物，上游序列：5′-TGGGAAACTGGAGCAAAACC-3′，下游序列：5′-ACCACAAGACACCCCTCACC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度123 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，10 sec，1個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)：95 ℃，5 sec，60.2 ℃(內(nèi)參基因?yàn)?1.6 ℃)，20 sec，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：55 ℃開始采集信號(hào)，60次。用Bio-rad公司提供的基因表達(dá)分析軟件Genex.xls進(jìn)行相對(duì)定量分析、處理數(shù)據(jù)。胰腺組織中ET-1和NO濃度的測(cè)定：取每組相同質(zhì)量的胰腺組織進(jìn)行勻漿，離心分離后取上清，-20 ℃保存。各樣品中ET-1和NO的含量，依照大鼠ET-1、NO定量ELISA試劑盒中提供的方法分別進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布且方差齊同，進(jìn)行方差分析。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)而行兩兩比較的q檢驗(yàn)。資料呈偏態(tài)分布或方差不齊，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，將數(shù)據(jù)經(jīng)秩轉(zhuǎn)換后，作兩兩比較的q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察和病理學(xué)評(píng)分比較 光學(xué)電子顯微鏡下胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察：A組胰腺組織偶見炎性細(xì)胞浸潤，無明顯水腫、出血、壞死，腺泡結(jié)構(gòu)完整。制模后的B組胰腺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫、結(jié)構(gòu)破壞，組織大片出血、壞死，腺泡腫脹。而清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑干預(yù)后的C組胰腺組織炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫、出血、壞死及腺泡的破壞程度均較B組減輕。量化后的B組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分高于A組(P<0.01)，C組胰腺病理學(xué)評(píng)分小于B組(P<0.05)。見表1。

2.2 胰腺組織濕/干重比值比較 3組中，B組胰腺組織濕/干重比值明顯高于A組(4.84±0.23 VS 3.37±0.22，P<0.01)。而C組胰腺組織濕/干重比值明顯低于B組(4.39±0.29 VS 4.84±0.23，P<0.01)。

2.3 其他各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) 與A組比較，B組胰腺組織中Hmgb1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，ET-1、NO濃度均顯著升高(均P<0.01)。與B組比較，C組胰腺組織中Hmgb1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)，且ET-1、NO濃度均明顯降低(均P<0.01)。見表1。

表1 各組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分、NO及ET-1濃度、Hmgb1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：**P<0.01 vs A組；△△P<0.01 vs B組；▲P<0.05 vs B組。

3 討論

既往實(shí)驗(yàn)研究表明，在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中，由于胰腺組織微循環(huán)障礙進(jìn)而導(dǎo)致的胰腺組織缺血損傷是一個(gè)重要因素[4]。SAP時(shí)，引發(fā)胰腺損傷的涉及因素眾多，而胰腺組織局部體液因素的調(diào)節(jié)作用尤其重要。ET-1和NO是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的2種重要的血管活性物質(zhì)。NO由L-精氨酸和分子氧在NO合酶的催化下生成。作為一種內(nèi)源性血管舒張劑、炎性反應(yīng)遞質(zhì)、血小板聚集抑制因子和神經(jīng)遞質(zhì)，NO最主要的生物學(xué)功能是傳遞信息、舒張血管和細(xì)胞毒作用。有研究顯示，NO可能主要通過擴(kuò)張血管、提高胰腺血流量、改善胰腺微循環(huán)，以減輕SAP時(shí)胰腺的亞細(xì)胞器損害，特別是減輕對(duì)線粒體和溶酶體的氧化損傷[5]。同時(shí)，NO可以對(duì)抗異位胰蛋白酶原的激活，抑制胰腺內(nèi)胰蛋白酶和血清脂肪酶活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺的保護(hù)作用[6]。關(guān)于NO在SAP發(fā)病中的作用也有不同的認(rèn)識(shí)。Hossam等[7]以蛙皮素誘發(fā)大鼠水腫型急性胰腺炎，觀察到用L-NNA阻斷內(nèi)源性NO后，胰腺組織水腫減輕，同時(shí)代表血管通透性的Evans blue漏出減少，而NO底物L(fēng)-精氨酸能逆轉(zhuǎn)L-NNA的作用，因此，NO導(dǎo)致胰腺損傷的機(jī)制是增加了蛋白的滲出和血管通透性。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，復(fù)制大鼠SAP模型后，胰腺組織中NO含量明顯增高，反映胰腺組織損傷的病理學(xué)指標(biāo)如濕干重比值、病理學(xué)評(píng)分明顯改變，胰腺損傷明顯，表明高濃度的NO可能介導(dǎo)了SAP時(shí)的胰腺損傷。ET-1是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的長(zhǎng)效縮血管物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)ET-1反應(yīng)最明顯的血管是微動(dòng)脈分枝部，ET-1可使其收縮甚至使血管腔完全閉塞，ET-1的血管選擇性作用對(duì)調(diào)節(jié)微循環(huán)血流量具有重要意義[8]。還有動(dòng)物研究顯示，靜脈注射ET-1可使胰腺血流量明顯下降，而胰腺血流量明顯增加則出現(xiàn)在給予選擇性ET-1受體拮抗劑后，表明在胰腺組織缺血缺氧的損傷過程中ET-1發(fā)揮了重要作用[9]。目前認(rèn)為，急性胰腺炎時(shí)，ET-1引發(fā)胰腺損傷的主要機(jī)制是：血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的ET-1使胰腺小動(dòng)脈痙攣，胰腺供血不足，胰腺組織缺血，而缺血又可導(dǎo)致產(chǎn)生更多ET-1，從而形成急性胰腺炎性反應(yīng)細(xì)胞因子ET-1正反饋的病理生理過程，這一惡性循環(huán)的直接后果就是加重胰腺組織的損傷[10]。在我們的研究中，也觀察到，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生SAP后，胰腺組織中ET-1的含量顯著增加，胰腺損傷明顯。而給予清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑干預(yù)后，出現(xiàn)相反的變化。

急性胰腺炎時(shí)，一定濃度的ET-1可刺激NO產(chǎn)生增加。合適水平的NO通過對(duì)抗ET-1縮血管作用，改善胰腺微循環(huán)，減輕白細(xì)胞-內(nèi)皮的相互作用等，對(duì)胰腺損傷有保護(hù)作用。而過多釋放的NO不但對(duì)胰腺損傷無保護(hù)作用，反而會(huì)介導(dǎo)胰腺組織損傷的發(fā)生和發(fā)展：一是高水平的NO可引起血管過度擴(kuò)張，血液瘀滯，組織氧利用減少，直接導(dǎo)致胰腺損傷發(fā)生；二是NO還有自由基性質(zhì)的細(xì)胞毒性作用，促使胰腺組織損傷加重。

Hmgb1是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白，在人體分布十分廣泛?？稍趩魏司奘杉?xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板、肝細(xì)胞等細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。在炎性反應(yīng)發(fā)生時(shí)，由于其相對(duì)于IL、TNF-α等早期炎性反應(yīng)遞質(zhì)出現(xiàn)的晚，而以晚期炎性反應(yīng)遞質(zhì)著稱。有研究顯示，用純化的Hmgb1加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中，可明顯刺激NO、IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α的產(chǎn)生，且呈劑量依賴性[11]。這表明作為晚期炎性反應(yīng)遞質(zhì)的Hmgb1，反過來又可以增加早期炎性反應(yīng)遞質(zhì)的大量釋放。近年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎發(fā)生時(shí)，體內(nèi)的Hmgb1水平升高，且升高程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而用Hmgb1阻滯劑丙酮酸乙酯干預(yù)后，肝、肺、腎功能及胰腺、肺等病理組織學(xué)改變得到明顯改善，病死率降低，表明Hmgb1是急性胰腺炎急性炎性反應(yīng)和器官損傷的重要遞質(zhì)[12-14]。在我們的研究中亦發(fā)現(xiàn)，SAP發(fā)生后，胰腺組織中Hmgb1mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)。

清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑是一種中藥復(fù)方制劑，內(nèi)含大黃、梔子、丹皮等主要成分。我們前期對(duì)SAP發(fā)病機(jī)制中相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、CD44、IL-1、IL-6、MCP-1等的作用進(jìn)行了研究[15-17]，也觀察到清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑有抑制促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子TNF-α、CD44、IL-1、IL-6等釋放的作用[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)大鼠SAP發(fā)生24 h后，胰腺組織濕/干重比值增加，胰腺炎性反應(yīng)水腫、出血壞死明顯，出現(xiàn)胰腺損傷，胰腺組織中NO、ET-1水平均升高，Hmgb1 mRNA表達(dá)上調(diào)。而經(jīng)過清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑干預(yù)后，胰腺濕/干重比值降低，胰腺病理組織學(xué)改變減輕，同時(shí)，SAP大鼠胰腺組織中的NO、ET-1水平降低，Hmgb1 mRNA表達(dá)下調(diào)。由此，我們推測(cè)清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑對(duì)SAP胰腺損傷有保護(hù)作用，除了與降低NO、ET-1等炎性反應(yīng)遞質(zhì)濃度有關(guān)外，還可能與下調(diào)胰腺組織Hmgb1 mRNA表達(dá)有關(guān)。但是，在這一過程中是否存在Hmgb1與NO及ET-1的協(xié)同作用，尚需進(jìn)一步研究。

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(2016-07-31收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

Protective Effects of Qingyi II Granules against Pancreas Injury in Rats with Severe Acute Pancreatitis

Xiao Qingchuan1, Lan Tiangang2，Dui Danhua2

(1DepartmentofHepatobiliarysurgery,SichuanArmedPoliceHospital,Leshan614000,China；2DepartmentofHepatobiliarysurgery，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003,China)

Objective:To observe the effect and mechanism of Qingyi II Granules (QY) against the pancreas injury in rats with severe acute pancreatitis (SAP). Methods:Eighteen SD rats were randomly divided into fake operation group (group A), SAP group (group B) and treatment group (group C). The rat SAP model was made by retrograde injection of 30 g/L sodium taurocholate into pancreatic duct. Group C was treated with 250 g/L Qingyi Ⅱ Granule (10 mL/kg), once per 6 h, and group A and group B were treated with the same dose of saline in the same way. The expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue was detected by real-time PCR after 24 hours of modeling. The concentration of nitric oxide and endothelin-1 in pancreas was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The pathological changes of pancreas were observed and the wet/dry weight ratio of pancreas was measured. Results:There were pancreas injury changes in group B, besides, expression of Hmgb1 mRNA was up-regulated and the levels of nitric oxide and endothelin-1 were increased; Qingyi Ⅱ Granule may cause that the expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue, the levels of nitric oxide and endothelin-1 concentration were decreased, thus reduced the degree of pathological damage of the pancreas. Conclusion:Hmgb1, nitric oxide and endothelin-1 may play an important role in SAP pancreatic injury. Qingyi II granules may reduce the expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue and decrease the concentration of nitric oxide and endothelin-1 to reduce the pathological changes of pancreatic tissue, thus protecting the pancreas injury.

High migration rate family protein-1; Endothelin-1; Nitric oxide; Severe acute pancreatitis; Rats

貴州省省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(編號(hào)：黔省專合字(2008)106號(hào))

肖青川(1974.09—)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：肝膽胰基礎(chǔ)與臨床，Email：bedllxiao@163.com

兌丹華(1957.06—)，女，本科，教授，肝膽胰科主任，研究方向：胰腺炎，Email：ddh1975@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.042