林明明 劉文利 王尚明 谷 穎 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

試驗(yàn)研究

中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”的急性毒性研究

林明明 劉文利 王尚明 谷 穎 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

為了驗(yàn)證家禽抗病毒中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”的安全性，參照《獸藥注冊(cè)資料匯編》中獸藥急性毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則的要求，進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明，中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”單次灌服給藥的LD50＞30000mg/kg，按照毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，LD50＞10000mg/kg即屬于無毒性物質(zhì)，從而表明中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”安全無毒。小鼠最大耐受量(MTD)測(cè)定結(jié)果為39600mg/kg，相當(dāng)于家禽臨床用量的100倍。結(jié)論，中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”安全無毒。

中藥復(fù)方制劑 雞傳染性支氣管炎 小鼠急性毒性 LD50 MTD。

雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化系統(tǒng)[1～3]。IB是阻礙養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要病毒性疾病，由于IBV毒株具高度變異和多血清型的特點(diǎn)，給IB的免疫和防治帶來了很大困難，免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[4]。目前，臨床上用于IB治療的藥物很多，藥效也各不相同，有些藥物使用后會(huì)在動(dòng)物體中殘留[5]。西藥雖然見效快但毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，許多中草藥及其多種成分都有很好的抗病毒作用，且具有作用獨(dú)特，抗病毒譜廣、毒副作用小、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)，正日益成為抗病毒新藥研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，復(fù)方中藥制劑能增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體的抗病力和抵抗力，對(duì)防治禽類傳染病具有較高療效[6,7]。中藥在對(duì)動(dòng)物機(jī)體生理機(jī)能進(jìn)行綜合調(diào)理、提高機(jī)體免疫力、抗病力和抗病毒等方面，具有獨(dú)到之處，可有效防控和治療該病[8]。因此，根據(jù)中醫(yī)辨證理論，并以宜降肺氣、化痰止咳和提高機(jī)體免疫力為治療原則，選用板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿等清熱解毒藥物組方，組成新型復(fù)方純中藥口服液“優(yōu)凈”，通過對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其在家禽上的安全性，為該藥在防治雞傳染性支氣管炎病的臨床應(yīng)用中提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明系清潔級(jí)小鼠90只，雌雄各半，體重18～22g，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入。在通風(fēng)良好的情況下，飼養(yǎng)在室溫20～25℃的鼠籠中，自由飲水及采食，觀察5d。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿購自安國市立建中藥材經(jīng)營(yíng)有限公司；復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”由山東迅達(dá)康獸藥有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室研制。

1.1.3 試驗(yàn)器材 HX302T電子天平(慈溪市天東衡器廠)；12號(hào)灌胃針，1ml注射器；小鼠籠；小燒杯，外科器械等。

1.1.4 藥液的制備 將板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿4味中藥按照篩選的最佳工藝進(jìn)行提取，比例為1∶2∶1∶1，加水煎煮2次，2h/次，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25(70～80℃測(cè))的清膏，冷至40℃時(shí)緩緩加入乙醇，充分?jǐn)嚢?，使含醇量?0%，靜置12h使沉淀，濾取上清液，遺留沉淀再加60%乙醇適量，充分?jǐn)嚢瑁o置12h，濾取上清液，合并2次上清液，回收乙醇至無醇味，濃縮至1ml含1.5g生藥，收集濃縮液，濾過，灌裝，滅菌，即得，性狀為棕褐色液體。

1.2 方法

1.2.1 小鼠口服(灌胃)急性毒性預(yù)試驗(yàn)[9]將40只小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，雌雄各半，給藥前禁食12h，各組分別將配好的藥液按照1875、3750、7500、15000、30000mg/kg(按原生藥材計(jì))灌胃給藥，給藥劑量以每只不超過0.4ml為標(biāo)準(zhǔn)，以確定試驗(yàn)小鼠的0和100%死亡的劑量的范圍。給藥后4h內(nèi)禁食，但不禁水。給藥后先觀察30min，在給藥后的4h再觀察1次，以后每天上午、下午各觀察1次，連續(xù)觀察7d。對(duì)小鼠全身精神狀態(tài)觀察的主要內(nèi)容有被毛組織光滑度、眼角膜是否有血絲、紅腫現(xiàn)象、小鼠活動(dòng)是否有異常行為，以及小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等[4]，并記錄各組小鼠死亡數(shù)和存活數(shù)。當(dāng)給藥劑量按體質(zhì)量計(jì)大于5000mg /kg時(shí)小鼠沒有出現(xiàn)死亡，表明LD50大于5000mg/kg，進(jìn)一步對(duì)復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”進(jìn)行最大耐受量的測(cè)定。

1.2.2 最大耐受量(MTD)的測(cè)定[10]將50只小鼠平均分成5組，每組10只，雌雄各半，試驗(yàn)前禁食12h，一組為空白對(duì)照，其他組按照等比間距設(shè)置4個(gè)劑量組，每組給小鼠灌胃藥劑量分別為36000、39600、43560、47916mg/ kg，單次給藥體積以每只不超過0.4ml為標(biāo)準(zhǔn)，若超過標(biāo)準(zhǔn)，8h內(nèi)給藥2次(間隔8h)，給藥后記錄小鼠的精神、飲食、飲水情況，連續(xù)觀察14d，對(duì)死亡的小鼠和觀察期滿的小鼠進(jìn)行解剖，觀察各組織器官的變化，無小鼠死亡的劑量組為中藥組方的最大耐受量。動(dòng)物在給藥前與給藥后l周及2周稱量小鼠體質(zhì)量[11]。

2 結(jié)果

2.1 小鼠口服(灌胃)急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

用灌胃針口服灌入不同劑量復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”后，4h內(nèi)小鼠蜷縮靜伏，活動(dòng)減少。24h后觀察，40只小鼠活動(dòng)、飲水、采食均正常。連續(xù)觀察7d，無小鼠死亡(見表1)。小鼠全身精神狀態(tài)、神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等觀察未見明顯異常(見表2)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及毒性等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[12,13]，當(dāng)LD50＞10000mg/kg.bw時(shí)，為無毒性物質(zhì)。本次預(yù)實(shí)驗(yàn)將口服劑量增加到30000mg/kg，40只小鼠均健活，說明中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”無毒。

表1 小鼠口服急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 (mg/kg、%)

表2 各組小鼠給藥后觀察項(xiàng)目及結(jié)果

2.2 最大耐受量(MTD)測(cè)定結(jié)果

（1）小鼠對(duì)中藥“優(yōu)凈”最大耐受量的測(cè)定，各組給藥后，與空白對(duì)照相比，小鼠在8h內(nèi)出現(xiàn)不同程度的精神沉郁，蜷伏、活動(dòng)減少，采食飲水相對(duì)于對(duì)照組明顯減少，尿液呈淺黃色，糞便形狀良好。當(dāng)給藥劑量達(dá)到43560mg/kg時(shí)，24h內(nèi)小鼠出現(xiàn)個(gè)別死亡；47916mg/kg劑量組小鼠給藥后24h內(nèi)被毛松弛，眼微閉嗜睡，呼吸頻率加快，呈腹式呼吸，出現(xiàn)個(gè)別死亡。各給藥組小鼠24h后精神、活動(dòng)、飲水、采食恢復(fù)正常。各劑量組小鼠死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由此可知，小鼠對(duì)復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”的最大耐受量為39600mg/kg。（2）觀察期14d結(jié)束后，對(duì)死亡的小鼠和觀察期滿的小鼠進(jìn)行解剖。觀察期滿存活的各劑量組小鼠與對(duì)照組相比，心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等器官均無明顯病變。針對(duì)43560mg/kg、47916mg/kg劑量組死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟、脾臟腫大，被膜緊張、邊緣鈍圓，尤其以肝臟腫大最為明顯，顏色呈暗紫色，質(zhì)地變軟易碎；腸系膜略有充血現(xiàn)象，其他臟器未見明顯異常。（3）動(dòng)物在給藥前與給藥后第l周及第2周稱量小鼠體質(zhì)量，見表4。由表可知，各給藥組小鼠體質(zhì)量增加與對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)。說明中藥復(fù)方制劑“優(yōu)凈”對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。

表3 小鼠對(duì)“優(yōu)凈”MTD試驗(yàn)結(jié)果 (mg/kg、%)

表4 小鼠MTD試驗(yàn)前后體重變化表

3 討論

（1）雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒引起的，該病毒具有變異速度快、血清型復(fù)雜、疾病臨床差異比較大的特點(diǎn)，同時(shí)易引起其他疾病的繼發(fā)感染。目前市場(chǎng)上藥物對(duì)雞傳染性支氣管炎病的防治并不理想，抗生素控制該病繼發(fā)感染易產(chǎn)生耐藥性，且存在藥物殘留問題。文獻(xiàn)報(bào)道，中藥含有大量的天然活性成分，能提高機(jī)體非特異性免疫功能，增強(qiáng)抗病力和抗應(yīng)激能力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，與西藥相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過科學(xué)配制，對(duì)禽病防治起到很大作用[14]?！皟?yōu)凈”選用板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿四味中藥組成復(fù)方中藥制劑，通過現(xiàn)代提取工藝制備成口服液，對(duì)禽傳染性支氣管炎病的防治效果明顯。（2）通過小鼠口服(灌胃)進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)研究，按照毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[12,13]，當(dāng)口服給藥劑量按體質(zhì)量計(jì)大于10000mg/kg體重時(shí)，觀察7d，小鼠沒有出現(xiàn)死亡，即表明該藥安全無毒，而本試驗(yàn)口服劑量增加到30000mg /kg，全部小鼠仍健活，說明復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”對(duì)小鼠安全、無毒。同時(shí)也說明“優(yōu)凈”對(duì)小鼠的LD50大于30000mg/kg，進(jìn)一步進(jìn)行小鼠最大耐受量試驗(yàn)。（3）小鼠最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠對(duì)“優(yōu)凈”的最大耐受量為39600mg/kg，相當(dāng)于家禽臨床用量的100倍，并且在各給藥劑量下，“優(yōu)凈”對(duì)小鼠體重的增長(zhǎng)無明顯影響。（4）通過小鼠急性毒性試驗(yàn)和最大耐受量試驗(yàn)研究，表明復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”安全無毒，客觀評(píng)價(jià)了復(fù)方中藥制劑“優(yōu)凈”的安全性，為“優(yōu)凈”的研發(fā)及在臨床上的安全應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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S853.92

A

1007-1733(2017)04-0001-03

2016–12–21）