王希東，李文俊，郝少君，范莉莉，張正臣

HPLC法測(cè)定雙烏鎮(zhèn)痛膠囊中青藤堿的含量＊

王希東，李文俊，郝少君，范莉莉，張正臣＊

HPLC法；雙烏鎮(zhèn)痛膠囊；青藤堿；含量測(cè)定

雙烏鎮(zhèn)痛膠囊系陜西神珠醫(yī)藥科技制品有限公司根據(jù)陳崇尚的發(fā)明專利與371醫(yī)院合作開發(fā)研制。該藥是由制川烏、制草烏、青風(fēng)藤、木瓜、獨(dú)活、黨參、當(dāng)歸、紅花組成，具有散寒除濕，祛風(fēng)止痛，活血通絡(luò)之功能，用于因風(fēng)寒濕引起的頭寒頭痛諸證，尤其適用于偏頭痛、三叉神經(jīng)痛及肢體、肌肉、關(guān)節(jié)疼痛見上述征候者。方中青風(fēng)藤中含有有效成分青藤堿，為更好的控制藥品的質(zhì)量，有關(guān)測(cè)定青藤堿含量的文獻(xiàn)很多，但是測(cè)定雙烏鎮(zhèn)痛膠囊中青藤堿含量尚未見報(bào)道。本文以HPLC法測(cè)定雙烏鎮(zhèn)痛膠囊中的青藤堿的含量，操作方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于雙烏鎮(zhèn)痛膠囊的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC-2010A型高效液相色譜儀，UVVIS紫外-可見檢測(cè)器，CLASS-VP色譜工作站。試劑：甲醇為色譜試劑，水為純凈水；其他試劑均為分析純。藥品：青藤堿對(duì)照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：774-9402，供含量測(cè)定用），雙烏鎮(zhèn)痛膠囊（由解放軍371醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20120304）。

2 方法與結(jié)果

圖1 青藤堿紫外全波長(zhǎng)掃描圖

圖2 青藤堿對(duì)照品HPLC色譜圖

圖3 雙烏鎮(zhèn)痛膠囊樣品HPLC色譜圖

圖4 雙烏鎮(zhèn)痛膠囊陰性樣品HPLC色譜圖

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取青藤堿對(duì)照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果，青藤堿在262nm處有最大吸收，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為262nm。見圖1。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（40∶60∶0.2，用三乙胺調(diào)pH至9.0）；流速：1.0 ml/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl，理論塔板數(shù)按青藤堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。見色譜圖2、3、4。

2.3 線性范圍、最小檢出量精密稱取青藤堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含56 μg的溶液，即得。精密吸取對(duì)照品溶液5、10、15、20、25 μl，按“色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)用最小二乘法進(jìn)行線性

取線性關(guān)系試驗(yàn)項(xiàng)下的1號(hào)溶液，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，色譜圖中，信噪比＞10∶1，所以最小檢出量＜0.056 μg/ml。

2.4 溶液的制備

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取青藤堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含56 μg的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物約0.46 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加入甲醇約20 ml，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率20 kHz）20 min，放冷，用甲醇定容至25 ml，搖勻，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液（56 μg/ ml）10 μl和供試品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果RSD為0.79%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)精密稱取供試品（批號(hào)：20120304）5份，按正文含量測(cè)定方法，制備供試品溶液，按含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定峰面積，計(jì)算得供試品中青藤堿含量的平均值為0.7224 mg/粒，RSD為1.22%，結(jié)果見表2。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)按擬定的含量測(cè)定方法，吸取供試品（批號(hào)：20120304）溶液和對(duì)照品溶液10 μl進(jìn)樣，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表3。青藤堿峰面積的RSD為1.09%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品（批號(hào)：050316）6份，約0.23 g，精密稱定，分別加入濃度為0.56 mg/ml對(duì)照品儲(chǔ)備液1.2、1.2、1.5、1.5、1.8、 1.8 ml，照“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，測(cè)定，青藤堿的平均回收率為99.37%，RSD為1.43%?；厥章视?jì)算方法：回收率（%）=［（測(cè)得總量-樣品中量）/加入對(duì)照品量］×100%。結(jié)果見表4。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果按擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)3批樣品中的青藤堿進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品含量，由結(jié)果可知，此含量測(cè)定方法可運(yùn)用于雙烏鎮(zhèn)痛膠囊的含量測(cè)定。結(jié)果見表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10 不同超聲處理時(shí)間的比較精密稱取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20120304）4份，每份約0.46 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超聲處理不同時(shí)間，放冷后，甲醇定容，搖勻，靜置，取適量上清液離心，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/min。取上清液，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，精密量取續(xù)濾液10 μl進(jìn)樣，測(cè)定其含量。由結(jié)果可以看出，超聲處理20 min，含量不再增加，為了保證提取完全故確定超聲處理時(shí)間為20 min。結(jié)果見表6。

表6 不同超聲處理時(shí)間的比較

3 討論

本方中含有制川烏，制草烏，其主要有效成分為生物堿類，包括烏頭堿等雙酯型烏頭堿、苯甲酰單酯型生物堿、氨基醇類生物堿，其中后兩類為雙酯型烏頭堿的水解產(chǎn)物，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，以上生物堿類均具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，但亦有較強(qiáng)的毒性，以雙酯型烏頭堿的毒性最強(qiáng)，為苯甲酰單酯型生物堿毒性的50～500倍，氨基醇類生物堿毒性的1000～4000倍，故質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)立了烏頭堿限量檢查項(xiàng)，以保證臨床用藥安全有效。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，雙烏鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)小白鼠的最大耐受量為20 g/kg（116 g生藥/kg），按體重劑量計(jì)算相當(dāng)于臨床日劑量的666倍；按體表面積劑量計(jì)算，相當(dāng)于臨床日劑量的55.5倍。表明雙烏鎮(zhèn)痛膠囊無明顯急性毒性。

此實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定雙烏鎮(zhèn)痛膠囊中青藤堿的含量，處理方法簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，不受其他成分干擾，可用于雙烏鎮(zhèn)痛膠囊的質(zhì)量控制。

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［2016－08－23收稿，2016－09－20修回］［本文編輯：劉一洋］

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河南新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（ZG14013）

453000河南新鄉(xiāng)，解放軍371醫(yī)院（王希東，李文俊，郝少君，范莉莉，張正臣）

張正臣，Email：xxzzc2010@126.com回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，回歸方程為Y= 781149X-110771，相關(guān)系數(shù)R=0.9999，結(jié)果表明，青藤堿濃度在0.28～1.4 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

10.14172/j.issn1671-4008.2017.03.023