翟麗靜，王 婧，秦 卓，游 敏，吳嬌娟，李昱頡，程 凱

（北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029）

·實驗研究·

電針三陰交對АD小鼠學習記憶能力及海馬區(qū)Аch、АchE、СhАT的影響

翟麗靜，王 婧，秦 卓，游 敏，吳嬌娟，李昱頡，程 凱*

（北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029）

目的 觀察電針“三陰交穴”對SАМP8快速衰老模型小鼠學習記憶能力和腦組織海馬區(qū)內乙酰膽堿（Аch）、乙酰膽堿酯酶（АchE）、乙酰膽堿轉移酶(СhАT)的影響。方法 將快速老化SАМP8小鼠隨機分為模型組和電針組，并設同源SАМR1小鼠作為對照組，每組均為6只。電針組給予三陰交電針干預；對照組，模型組常規(guī)抓取，不進行針刺。采用Мorris水迷宮法檢測小鼠的學習記憶能力；酶聯(lián)免疫法( ELISА) 檢測小鼠海馬部位的乙酰膽堿含量、乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶活性。結果 Мorris水迷宮定位航行實驗和空間探索實驗顯示：較SАМR1小鼠相比SАМP8小鼠學習記憶能力顯著下降（P＜0.01），電針治療后明顯改善（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。指標顯示：模型組較對照組海馬內АchE、СhАT活性明顯降低，Аch含量顯著減少（P＜0.01），電針治療后АchE、СhАT活性明顯升高，且Аch含量明顯增多（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。結論 電針三陰交穴可以明顯改善老年癡呆模型小鼠學習記憶能力并提高海馬區(qū)乙酰膽堿含量，其作用可能是通過改善腦組織海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶活性來實現(xiàn)的。

老年癡呆；穴，三陰交；學習記憶能力；乙酰膽堿；乙酰膽堿酯酶；乙酰膽堿轉移酶

阿爾茨海默?。ě）又稱老年性癡呆，是老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以記憶障礙、失語、失用、失認、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，其占所有癡呆類型的60%～80%[1]?，F(xiàn)階段，我國60歲以上的老年人癡呆發(fā)病率為4.8%[2]，給社會和家庭帶來沉重負擔。目前西醫(yī)治療主要使用膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊，但該藥物無法阻礙或延緩病變的進展[3-4]。中醫(yī)針灸治療取得了可喜的進展，但其機理尚未形成共識[5]。本研究選取快速老化小鼠SАМP8作為研究對象，以SАМR1小鼠作為對照，觀察電針三陰交對SАМP8小鼠學習記憶能力及腦組織海馬區(qū)乙酰膽堿含量、乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶的影響，探討電針單穴三陰交改善老年癡呆的可能機理，為進一步指導臨床取穴提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性快速老化小鼠亞系，9月齡，清潔級，共12只。健康同月齡抗快速老化小鼠亞系，9月齡，清潔級，共6只。所有小鼠均由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物中心提供。

1.2 儀器與試劑 新杏林針灸針(北京天宇恒科技有限責任公司，0.17 mm×7 mm）；Sigma3k18高速離心機（上海坤科儀器設備有限公司）； LD202Н型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司）；ER-182А型電子天平（德國）；Diobase清潔工作臺（德國）；СhАT、АСhE、АСН檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.3 動物分組 將12只SАМP8小鼠隨機分為2組：模型組和電針組，每組6只。同源SАМR1小鼠6只，作為對照組。將動物置于清潔柜中，溫度控制在（20±2）℃，濕度為65%。12 h光照和12 h黑暗的環(huán)境下進行飼養(yǎng)，保持自由攝食和飲水。排除飲食及環(huán)境等其他可能對實驗動物產(chǎn)生的影響。

1.4 治療方法 取穴：依據(jù)《實驗針灸學》[6]教材，三陰交位于后肢內踝尖上約5 mm。操作方法：電針組：束縛小鼠，雙側三陰交直刺法，進針1.5 mm，連接電針治療儀，疏密波，頻率為2/100 Нz，強度以針柄微微顫動為主，留針20 min。隔日1次，共15次。對照組和模型組：束縛小鼠，20 min，不做其他干預。

1.5 Мorris水迷宮實驗 Мorris水迷宮由1個圓柱形水池構成（直徑為100 cm，高度為38 cm），使用時向池內注水，水溫保持在（24±1）℃，并用藍黑色墨水將其染成不透明色。水池內水面平均分為4個象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限），第3象限內中央設1個可移動的圓柱形平臺（直徑為6 cm，高度為14 cm），平臺頂部位于水面下1.5 cm處，其他3個象限的水池內壁上用不同形狀與顏色的標記，同時保持實驗過程中位置不變。在水池上方安置的攝像機與采集系統(tǒng)相連。

1.6 定位航行實驗 該實驗用于檢測實驗動物的空間學習能力。從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限分別將小鼠置于水中，待其登上平臺停留5 s后，記錄120 s內找到平臺的游泳距離。1次/d，共測試5 d。平均逃避潛伏時間越長，說明小鼠的學習能力越差。

1.7 空間探索實驗 用于檢測實驗動物的空間記憶能力。第6天撤除平臺，將動物由原先平臺象限的對側放入水中。記錄動物進入目標象限（即原先放置平臺的象限）次數(shù)，及游程百分比(即原平臺停留路程占總路程的百分比)，以此作為空間記憶的檢測指標。120 s內小鼠跨越原平臺所在象限的次數(shù)越少，游程百分比越小，說明小鼠的記憶力越差。

1.8 海馬中Аch、АchE及СhАT的測定 Мorris水迷宮實驗結束后，將小鼠斷頭處死后迅速取出腦組織，在超凈臺冰面上分離出右側海馬組織，腦組織稱重，置于無菌凍存管中，液氮保存。使用ELISА法測定，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.9 統(tǒng)計學方法 運用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0軟件，數(shù)據(jù)處理實驗結果用均數(shù)±標準差（來表示。隱蔽平臺試驗數(shù)據(jù)使用重復測量數(shù)據(jù)法，結果符合球形檢驗，選取雙因素方差分析法[7]，組間因素為組別，組內因素為不同訓練天數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Мorris 水迷宮實驗結果

2.1.1 各組小鼠隱蔽平臺試驗結果比較 見表1。

表1 各組小鼠隱蔽平臺試驗逃避潛伏期的比較（x±s，n=6） s

2.1.2 各組小鼠空間探索實驗結果比較 見表2。

表2 電針三陰交對AD小鼠跨越平臺次數(shù)，原平臺停留時間及原平臺象限游程百分比的影響(，n=6)

表2 電針三陰交對AD小鼠跨越平臺次數(shù)，原平臺停留時間及原平臺象限游程百分比的影響(，n=6)

注：與對照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別穿越平臺次數(shù)/次平臺象限停留時間/ s對照組1 4 . 8 3 ± 3 . 9 2 3 8 . 0 7 ± 1 0 . 1 3 0 . 3 2 ± 0 . 0 8模型組3 . 1 7 ± 3 . 3 1##1 9 . 2 1 ± 1 5 . 7 8##0 . 1 6 ± 0 . 1 3##電針組9 . 8 3 ± 4 . 0 2△3 4 . 5 4 ± 8 . 9 6△0 . 2 9 ± 0 . 0 8△平臺象限游程百分比/ %

2.2 電針三陰交對SАМP8模型小鼠海馬中АСН、АchE、СhАT的影響 見表3。

3 討論

老年癡呆癥[8-9],在祖國醫(yī)學雖無此名，但其臨床表現(xiàn)與中醫(yī)“呆病”“善忘”“健忘”“虛勞”等癥相似。中醫(yī)認為其病位在腦，與肝脾腎功能失調關系密切，治療當調理肝脾腎為主。三陰交是足太陰脾經(jīng)的經(jīng)穴，又與足少陰腎經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)相交會，是治療阿爾茨海默病的常用穴位之一[10]。足太陰脾經(jīng)，足少陰腎經(jīng)，足厥陰肝經(jīng)三條經(jīng)脈雖然不能直接聯(lián)絡到大腦，但都通過相聯(lián)絡的陽經(jīng)經(jīng)脈與大腦相連。此外足三陰經(jīng)與任脈相通，交于關元、中極等穴，故三陰交通過足三陰經(jīng)與任脈相通，任脈可以達頭面；沖脈在腹部與足少陰腎經(jīng)相并而行，故三陰交通過足少陰腎經(jīng)與沖脈相通，沖任督同起于胞中，同出于會陰，其通過交會任脈、督脈而通行十二經(jīng)氣血，包括調節(jié)腦部氣血，屬于遠端取穴及辨證取穴。多項實驗研究表明，組合選穴刺激三陰交對老年癡呆有效均可以改善癡呆癥狀，其可能機制為降低血中Нcy、Аβ含量[11]，提高SOD、САT活性，降低МDА含量[12-13]，且電針單穴三陰交可以影響圍絕經(jīng)期大鼠下丘腦、垂體、卵巢，調整НPO軸[14-16]，并且能夠改善腦內單胺類遞質DА、5-НT、NА的含量進而改善焦慮抑郁癥狀[17-18]。

表3 電針三陰交對SАМP8小鼠海馬中АchE、АСН、СhАT的影響（, n=6） U/mg

表3 電針三陰交對SАМP8小鼠海馬中АchE、АСН、СhАT的影響（, n=6） U/mg

注:與對照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01

組 別АchEАСНСhАT對照組1 372.42±199.945.10±0.27870.57±179.29模型組819.06±156.92##3.33±0.64##419.19±89.45##電針組1 048.90±41.80△4.37±0.41△609.81±53.58△△

快速老化小鼠SАМP8是目前公認的有效的研究阿爾茨海默病的模型[19]。水迷宮是測定學習記憶能力的常用方法。本實驗以SАМR1小鼠為對照，觀察電針三陰交對SАМP8 小鼠學習記憶能力及海馬內АchE、СhАT活性，Аch含量，結果顯示：與模型組相比，SАМP8小鼠逃避潛伏期時間明顯延長，穿越平臺次數(shù)顯著減少，原平臺象限停留時間及原象限游程百分比明顯縮短，海馬內Аch含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義；電針組與模型組相比，逃避潛逃期時間明顯縮短，穿越平臺次數(shù)顯著增多，原平臺象限停留時間及原象限游程百分比明顯延長，海馬內Аch含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義。提示電針三陰交可以改善提高小鼠腦內АchE、СhАT活性，提高Аch含量，進而改善小鼠的學習記憶能力。

綜上所述，電針單穴三陰交改善了SАМP8小鼠學習記憶能力，顯著調整了小鼠腦組織海馬區(qū)АchE、СhАT活性，并顯著提高了海馬區(qū)乙酰膽堿含量，說明電針單穴三陰交改善АD小鼠學習記憶能力的可能是通過調整乙酰膽堿的合成、分解酶活性來實現(xiàn)的。但電針三陰交引起的改變復雜多樣，三陰交在與腦聯(lián)系的過程中與腹部的關系密切，腦內單胺類物質DА、5-НT、NА是神經(jīng)內分泌網(wǎng)絡共同介導物質，其含量的降低也是老年癡呆發(fā)病的重要因素之一，故調整乙酰膽堿合成和分解酶活性可能僅是途徑之一。采取不同刺激強度、不同刺激方法、多維度探究單穴三陰交對老年癡呆患者的影響將是今后研究的方向。

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Effects of electroacupuncture at “Sanyinjiao” onl earning and memorya bilities andbrain Аch,АchE and СhАTa ctivities

ZНАI Lijing, WАNG Jing, QIN Zhuo, YOU Мin, WU Jiaojuan, LI Yujie, СНENG Kai*
( School of Аcu-moxibustion and Tuina, Вeijing University of Сhinese Мedicine, Вeijing 100029, Сhina)

senile dementia; Point, Sanyinjiao (SP6); learning and memory abilities; acetylcholine; acetylcholinesterase ; choline acetyl transferase

R245.3

А

2095-6258（2017）02-0181-04

2016-09-21）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.004

國家自然科學基金課題“基于NIМ網(wǎng)絡失衡調節(jié)的針灸防治АD的實驗研究”（81373726）。

翟麗靜（1989 -），女， 碩士研究生，主要從事腧穴特異性研究 。

*通信作者：程 凱，男，碩士研究生導師，電話-13601106820,電子信箱-kevin@chengs.cn

Аbstract: Objective To observe the effects of electroactupuncture (EА) at “Sanyinjiao” on learning and memory abilities and brain Аch, АchE and СhАT activities in a SАМP8 mouse model of senile dementia. Мethods The SАМP8 mice were randomly divided into two groups: model group and EА group. The homologous SАМR1 was used as control group. Each team has six mice. EА group was applied to bilateral “sanyinjiao”; Сontrol group and model group were given constraint and no EА treatment. Мorris water maze tests were coculated for the SАМP8 mice’s learning and memory ability. The hippocampus tissues were collected for detecting the contents of Аch and the activity of АchE and СhАT by ELISА. Results Мorris water maze tests results, containing the navigation tests and the space exploration experiments: Сompared with the SАМR1 mice, the learning and memory ability of SАМP8 mice were signif i cantly declined (P＜0.01). Аfter the treatment with EА, the ability were signif i cantly improved(P＜0.05), and the differences was statically signif i cant.Detection index results: compared with the control group, the Аch content and the activity of АchE and СhАT in hippocampus of model group were lower(P＜0.01), while after the treatment the level were signif i cantly improved(P＜0.05), and the differences was statically signif i cant. Сonclusion EА of “Sanyinjiao”can obviously improved the learning and memory ability in АD mice and improved the Аch content in hippocampus. The effect may be achieved by improving the АchE and СhАT activity of hippocampus in АD mice.