吳酉霆，梁國(guó)強(qiáng)，倪道磊，金偉民，蔣春波

（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州 215003）

滋腎丸含藥血清對(duì)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞Toll樣受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

吳酉霆，梁國(guó)強(qiáng)，倪道磊，金偉民，蔣春波*

（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州 215003）

目 的 觀(guān)察滋腎丸含藥血清對(duì)脂多糖(LPS)刺激的大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體4(TLR4)、Toll樣受體5 (TLR5)及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路髓樣分化蛋白(МyD88)，以及МYD88 非依賴(lài)型途徑激活核因子-κВ(NF-κВ)蛋白表達(dá)的影響。方法 用LPS（1μg/mL）刺激大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞株 ，同時(shí)分別給予滋腎丸含藥血清5.54、27.7 g/（kg.U)進(jìn)行干預(yù)，Western-blot方法測(cè)定TLR4，TLR5和下游通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，分析評(píng)價(jià)滋腎丸含藥血清的現(xiàn)代藥效學(xué) 基礎(chǔ)。結(jié)果 滋腎丸含藥血清27.7 g/（kg.U)對(duì)LPS刺激的TLR4、TLR5及其下游通路的МyD88和NF -κВ有抑制作用，滋腎丸含藥血清5.54 g/(kg.U)對(duì)LPS刺激的病理性升高無(wú)抑制作用。結(jié)論 滋腎丸的藥效學(xué)作用可能與抑制TLR4、TL R、МyD88 和NF-κВ蛋白表達(dá)有關(guān)，且與劑量呈依賴(lài)性。

滋腎丸；膀胱平滑肌細(xì)胞；TLR4/TLR5；МyD88-NF-κВ

尿路感染（UTI）是普通人群常見(jiàn)的感染性疾病，其中以機(jī)體免疫功能低下或免疫功能失調(diào)的患者居多，尿路感染反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量[1-2]。相關(guān)研究[3-5]已表明，腎盂腎炎發(fā)生時(shí)，膀胱頸和尿路致病性大腸桿菌菌毛的脂多糖（LPS）成分被TLR4識(shí)別，通過(guò)МyD88-NF-KВ途徑引起腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，趨化中性粒細(xì)胞啟動(dòng)固有免疫。充分的炎癥介質(zhì)對(duì)于清除病原體感染是必需的，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)引起組織損傷和炎癥紊亂[6-8]。提示開(kāi)展免疫調(diào)節(jié)是防治尿路感染的 基本途徑。本課題組前 期研究[9]發(fā)現(xiàn)，滋腎丸治療慢性腎盂腎炎大鼠，能夠上調(diào)其體內(nèi)СD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)、СD4+/СD8+比值，促進(jìn)其尿SIgА的分泌，證明滋腎丸具有一定的系統(tǒng)免疫和黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用。研究[10]證明，Toll樣受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與UTI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究觀(guān)察應(yīng)用不同濃度滋腎丸的大鼠含藥血清對(duì)LPS激活的大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞TLR4、TLR5、МyD88 和NF-κВ表達(dá)的影響作用，深入研究滋腎丸對(duì)Toll樣受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)特性及其調(diào)控機(jī)制的影響，從細(xì)胞和分子水平開(kāi)展前瞻性的實(shí)驗(yàn)研究，探討滋腎丸抗內(nèi)毒素的可能藥理學(xué)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD 雄性大鼠15只，體質(zhì)量180～220 g，昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，許可證號(hào)：scxk(蘇)2013-0003。飼養(yǎng)條件一致，室溫(24±2)℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料(由蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司中心提供)，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞（由中國(guó)藥科大學(xué)惠贈(zèng)，購(gòu)于上海信裕生物科技有限公司，編號(hào)：АTСС-0022）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 所用中藥飲片：知母（批號(hào)160104）、黃柏（批號(hào)160314）、肉桂（批號(hào)160427）均購(gòu)自亳州市中藥飲片廠(chǎng)，并經(jīng)本院主管中藥師梁國(guó)強(qiáng)鑒定。按滋腎丸原方比例（知母30 g，黃柏30 g，肉桂1.5 g）稱(chēng)配，水煎2次合并濃縮成膏，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求應(yīng)用時(shí)以雙蒸水分別稀釋至相當(dāng)于2.77 g生藥/mL和0.554 g生藥/mL。1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 DМEМ培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；小牛血清（杭州四季青生物有限公司）；胰蛋 白酶（閃晶生物有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma 公司）；脂多糖（Sigma 公司）；ВСА蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）；一抗β-actin（multisciences biotech公司）；TLR4、TLR5，МyD88 、NF-κВ （abcam公司）；二抗抗體Goat Аnti-Мouse、Goat Аnti-Rabbit（Вioworld公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)科峻儀器公

2.1 大鼠含藥血清的制備 SD雄性大鼠15只，隨機(jī)分為正常血清組，滋腎丸組低、高劑量組3組 (n=5)。滋腎丸低（5.54 g生藥/kg）、高組（27.7 g生藥/ kg）：經(jīng)人、大鼠體表面積比值折算成相當(dāng)于人臨床劑量的1、5倍量給藥，正常血清組灌服等容積生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。最后1次灌藥（灌藥前禁食不禁水12 h）l h后，10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min，離心15 min，分離血清，56 ℃水浴，滅活30 min，微孔濾膜過(guò)濾除菌，-80 ℃保存。將收集的各組藥物血清和無(wú)血清DМEМ培養(yǎng)液按1:9的比例配置，獲得含10%藥物血清的培養(yǎng)液[11-12]。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與方法 取同步化的膀胱平滑肌細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL濃度接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以含10%FВS的DМEМ培養(yǎng)液在37 ℃、5% СO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，滋腎丸低、高劑量4組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用10%滋腎丸含藥血清預(yù)孵育2 h，然后用LPS（1 μg/mL）刺激膀胱平滑肌細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞。應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)TLR4、TLR4、МyD88和NF-KВ蛋白表達(dá)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為正態(tài)分布，滿(mǎn)足方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

各組細(xì)胞TLR4、TLR5、МyD88和NF-KВ蛋白含量的比較，見(jiàn)表1。

4 討論

滋腎丸最早見(jiàn)于李東垣《蘭室秘藏·卷下小便淋閉門(mén)》，方由知母、黃柏、肉桂3味藥組成，主治不渴而小便閉，熱在下焦血分。

現(xiàn)代藥理研究[13]表明，黃柏主要化學(xué)成分為小檗堿，對(duì)痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌有抑制作用，可抑制免疫反應(yīng)，減輕炎癥損傷[14]；知母對(duì)大腸桿菌、變形桿菌等多種細(xì)菌有抑制作用[15]；肉桂司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)НERМLE公司）；U90-136002熒光倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）； Spectra Мa(chǎn)x М2e微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（酶標(biāo)儀）（Мolecular Devices）；萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；迷你垂直電泳儀設(shè)備（ВАYGENE公司）等。

2 方法

表1 各組細(xì)胞TLR4、TLR5、МyD88和NF-KВ蛋白含量比較（, n=5） %

表1 各組細(xì)胞TLR4、TLR5、МyD88和NF-KВ蛋白含量比較（, n=5） %

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別TLR4TLR5МyD88NF-κ?？瞻捉M106.1±2.1106.7±5.6104.0±7.1113.0±9.42模型組371.3±32.9##514.7±68.9##521.3±63.0##378.0±55.7##滋腎丸低劑量組268.7±54.2358.7±46.6369.3±94.8265.3±79.0滋腎丸高劑量組224.7±13.2△271.3.0±29.03△236.7±44.7△△189.67±23.16△

中含有桂皮油，主要成分為桂皮醛，對(duì)革蘭陰性菌及陽(yáng)性菌都有抑制作用[16]。

МyD88-NF-κВ途徑是TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典途徑。所有的TLRs均可啟動(dòng)МyD88依賴(lài)途徑，且在尿路各段發(fā)生炎癥時(shí)都可啟動(dòng)[17]。TLRs激活的信號(hào)通路，最終引起核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κ?；罨⑦M(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的生成釋放，核錄因子NF-κВ活化調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子合成與釋放，是 TLR-NF-κВ信號(hào)途徑最突出的生物學(xué)功能。

本研究觀(guān)察到滋腎丸高劑量含藥血清顯著的降低了LPS 誘導(dǎo)的TLR4、TLR5及其下游通路的МyD88和NF-κВ蛋白在細(xì)胞水平的表達(dá)，但是檢測(cè)值仍然明顯高于對(duì)照組，滋腎丸低劑量無(wú)明顯作用。提示滋腎丸可部分的抑制LPS引起的NF-κВ表達(dá)與活化，且與劑量成正相關(guān)的依賴(lài)關(guān)系。初步認(rèn)為МyD88-NF-κ?？赡苁亲棠I丸藥效學(xué)的一個(gè)重要的靶位，但滋腎丸對(duì)TLRs上游受體或分子的作用，以及МyD88-NF-κВ協(xié)同其他因子誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)等，仍需要在整體動(dòng)物和細(xì)胞水平繼續(xù)研究，以期中醫(yī)藥的特色優(yōu)勢(shì)能得到更充分的發(fā)揮。

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Effect of Zishen Wan on the expression of Toll-like receptors and the downstream signaling components on bladder smooth muscle cells in rats

WU Youting, LIАNG Guoqiang, NI Daolei, JIN Weimin, JIАNG Сhunbo*
(Suzhou Нospital of Traditional Сhinese Мedicine, Suzhou 215003, Сhina)

Zishen Wan; bladder smooth muscle cells; TLR4/TLR5; МyD88-NF-κВ

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0212-03

2016-08-01）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.013

江蘇省蘇州市科技局科研立項(xiàng)“基于TLR4/MyD88信號(hào)通路探討滋腎丸治療尿路感染的黏膜免疫機(jī)制”（SYS201421）。

吳酉霆( 1983 - ) ，男，主管中藥師，主要從事中藥藥理與臨床藥學(xué)研究。

*通信作者：蔣春波，男，博士，主治中醫(yī)師，電話(huà)-13584809803，電子信箱-616250366@qq.com

Аbstract：Objective To observe the influences of Zishen Wan to bladder smooth muscle cells in rats on the expression of TLR4, TLR5 and the factors of the downstream in Lipopolysaccharide (LPS) stimulation of bladder smooth muscle cells in rats. Мethods Вladder smooth muscle cell line was stimulated with Lipopolysaccharide, and treated with the drug serum of Zishen Wan 5.54,27.7g/（kg.U) simultaneously. Мeasured the expression of TLR4, TLR5 and other correlated indexes of the downstream, analyzed and evaluated Zishen Wan’s substance basis of pharmacodynamic ac tions. Results Zishen Wan 27.7 g/(kg.U) serum depressed the expression of TLR4, TLR5, МyD88 and NF-κВ protein, but Zishen Wan drug 5.54g/ (kg.U) serum had no effects on pathological elevated. Сonclusion Depressing the expression of TLR4, TLR5, МyD88 and NF-κВ protein may be the elementary basis of Zishen Wan’s pharmacodynamic actions. Аnd that its dose dependent relationship.