李志龍

摘 要：目的：就六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜開(kāi)展研究分析。方法：選用Dikma Diamonsil C18色譜柱，流動(dòng)相梯度洗脫為乙腈-水，其中乙腈內(nèi)所含磷酸的比例為0.05%，水中所含磷酸的比例為0.05%。研究中將柱溫控制在40℃并掌握好流速。在不同的時(shí)間段內(nèi)檢測(cè)波長(zhǎng)也存在一定差異，以20μL為進(jìn)樣量。本次實(shí)驗(yàn)研究中選取規(guī)范的色譜峰指認(rèn)方法，即Q-TOF-MS-IDA-MS/MS。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，此種方法能夠?qū)灿蟹逯械?8個(gè)色譜峰進(jìn)行定性鑒別，具有良好的精密度和穩(wěn)定性。以此種方式對(duì)六味地黃濃縮丸進(jìn)行測(cè)定，可見(jiàn)相似度在0.96以上。結(jié)論：本次HPLC指紋圖譜研究為六味地黃濃縮丸的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：六味地黃濃縮丸；HPLC；指紋圖譜；質(zhì)量評(píng)價(jià)

六味地黃是中藥中的經(jīng)典名方，以滋陰補(bǔ)腎受到廣泛關(guān)注，該方主要由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉等成分依照標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量比所組成。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，現(xiàn)代藥理研究也更為深入，發(fā)現(xiàn)六味地黃方對(duì)內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)具有良好的調(diào)節(jié)作用，其優(yōu)良的藥理作用主要體現(xiàn)在抗氧化、抗衰老以及改善腎功能等多個(gè)方面，以此方位基礎(chǔ)不斷改進(jìn)后所形成的六味地黃加減方，在臨床醫(yī)學(xué)上發(fā)揮著重要的作用。為加強(qiáng)六味地黃丸質(zhì)量控制，本文旨在通過(guò)對(duì)六味地黃濃縮丸進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，以提高色譜峰指認(rèn)的合理性，為六味地黃濃縮丸的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 材料

本次研究中所選用的儀器設(shè)備主要有高效液相色譜儀、超聲清洗器、電子天平以及數(shù)據(jù)傳力軟件。研究中所選用的六味地黃濃縮丸是來(lái)自河南某制藥公司的不同批次藥品。丹皮酚購(gòu)自食品藥品檢定研究院，水為純凈水，乙腈和甲醇為色譜純，磷酸與甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備單味藥材供試品溶液

自S1-S10號(hào)中分別稱(chēng)取0.5g六味地黃濃縮丸樣品，置于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的錐形瓶?jī)?nèi)，在50℃條件下，進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)15min的超聲提取三次，第1次加甲醇進(jìn)行提取，后兩次分別加入甲醇提取，在2500r·min-1離心條件下，25min后對(duì)提取液進(jìn)行合并定容。

精密吸取上述溶液1.0mL并加以濃縮除醇厚，以1.0mL純水進(jìn)行復(fù)溶，之后對(duì)該溶液進(jìn)行精密吸取100μL，加入至完全活化的3.0mLSPE柱中，分別以1.0mL水和甲醇進(jìn)行洗脫處理，可以得到甲醇洗脫液，待0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后方可進(jìn)行HPLC分析。除此之外，茯苓、山藥、澤瀉、熟地黃等在粉碎后稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)量藥材粉末，依照上述方法進(jìn)行操作，即可制得單味藥材供試品溶液。

2.2 色譜條件

DikmaDiamonsilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈（A，含0.05%磷酸）-水（B，含0.05%磷酸），梯度洗脫，0～5.5min，4%A；5.5～10min，4%～5%A；10～26min，5%～30%A；26～33min，30%～32%A；33～42min，32%～80%A；42～53min，80%～90%A。柱溫40℃；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)276nm（0～10min），236nm（10～40min），276nm（40～60min）；進(jìn)樣量20μL。

2.3 質(zhì)譜條件

本次實(shí)驗(yàn)研究中，以ESI源作為離子源，為保證正負(fù)離子數(shù)據(jù)采集的可靠性，采用一級(jí)全掃描的方式，并掌握好數(shù)據(jù)采集速度，最好在5Hz左右，將掃描范圍控制在m/z100-1000。以最多對(duì)一級(jí)質(zhì)譜圖中10個(gè)母離子的MS/MS質(zhì)譜圖作為信息采集工作模式開(kāi)展數(shù)據(jù)收集，源溫度為600℃最佳，霧化氣應(yīng)當(dāng)為414Pa，卷簾氣為214Pa。除此之外，在操作中應(yīng)當(dāng)保持動(dòng)態(tài)背景扣除處于開(kāi)啟狀態(tài)。

2.4 指紋圖譜的建立以及共有指紋峰的指認(rèn)

為更好的建立指紋圖譜，應(yīng)當(dāng)取供試品溶液20μL，依照標(biāo)準(zhǔn)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，可得出不同批次下六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜，依據(jù)不同色譜峰相對(duì)保留時(shí)間，可以確定共有峰，進(jìn)一步依據(jù)特征指紋峰建立指紋圖譜，如圖1所示。

六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜中明顯顯示，共有指紋峰22個(gè)，其中16號(hào)峰為參照風(fēng)，以此為依據(jù)能夠?qū)Σ煌V峰的保留時(shí)間以及保留面積進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算，便于其與同一圖譜中參照峰的保留時(shí)間以及保留面積參數(shù)值進(jìn)行對(duì)比分析。計(jì)算后的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積見(jiàn)表1、2。

在對(duì)共有指紋峰進(jìn)行準(zhǔn)確指認(rèn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)當(dāng)對(duì)共有指紋峰的來(lái)源進(jìn)行合理確認(rèn)。這就需要研究人員對(duì)六味地黃濃縮丸提取液HPLC圖與山藥、茯苓、熟地黃等單味藥提取液HPLC圖進(jìn)行對(duì)比分析，在指紋峰保留時(shí)間的對(duì)比下可以明確不同單味藥的特征峰。其中，1號(hào)、5號(hào)和15號(hào)共有峰為熟地黃的特征峰，2號(hào)、4號(hào)共有峰為酒制山茱萸和熟地黃的特征峰，3號(hào)為酒制山茱萸和牡丹皮的特征峰，除此之外，6-9號(hào)和10-14號(hào)、18-19號(hào)為酒制山茱萸特征峰。10，16，17，21號(hào)共有峰為牡丹皮的特征峰；20號(hào)共有峰為牡丹皮和澤瀉的特征峰；22號(hào)共有峰為茯苓、山藥、澤瀉、牡丹皮的特征峰。

2.5 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)中，取同一供試品溶液連續(xù)測(cè)定5次，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.7%，相對(duì)峰面積RSD<4.0%（7，17號(hào)峰RSD為5.0%～13%），表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)中，取同一供試品溶液分別在0，2，6，12，24h測(cè)定其指紋圖譜，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.50%，相對(duì)峰面積RSD<5.0%（6，7，8，15號(hào)峰RSD為7.0%～13%），表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)中，平行處理同一批次樣品5份，分別測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.90%，相對(duì)峰面積RSD<4.0%（7，17號(hào)峰RSD為7.0%～28%），表明該方法重復(fù)性良好。

上述方法學(xué)考察試驗(yàn)中，個(gè)別色譜峰RSD，較大，分析其原因主要為六味地黃濃縮丸成分較復(fù)雜，且指紋圖譜基線(xiàn)不平穩(wěn)，同時(shí)上述色譜峰峰面積相對(duì)于其他色譜峰較小，造成工作站系統(tǒng)自動(dòng)積分誤差，采用手動(dòng)積分可盡量減小誤差。

3 討論

研究表明，中藥的質(zhì)量控制是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，由于其組成屬性為多組分，因此在質(zhì)量控制的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)全面的反映出其物質(zhì)組成屬性，也就是說(shuō)，應(yīng)當(dāng)中藥的提取、純化處理以及分析條件的選擇，都是比較重要的環(huán)節(jié)，應(yīng)當(dāng)確保中藥中所含多組分得以準(zhǔn)確表征出來(lái)，從而加強(qiáng)中藥質(zhì)量控制。中藥指紋圖譜是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步的基礎(chǔ)上所形成的一種分析方法，能夠全面、定量的將中藥中所包含的化學(xué)信息技術(shù)反映出來(lái)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍有待進(jìn)一步完善。通過(guò)本次研究可知，采用雙波長(zhǎng)切換法能夠更加準(zhǔn)確的將不同波長(zhǎng)下的色譜信息進(jìn)行記錄，提高色譜峰的豐富性，從而清晰且準(zhǔn)確的反映出六味地黃濃縮丸的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1] 高新彪，孫磊，喬善義，高松，車(chē)彥忠.六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（22）：3411-3415.

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