余芳，呂嘉櫪，張軍蒙，田延楚

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021）

幾株乳酸菌的抗氧化活性研究

余芳，呂嘉櫪＊，張軍蒙，田延楚

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021）

選用來自傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)品中分離的10株乳酸菌，研究了它們與抗氧化活性相關(guān)的清除DPPH自由基和O2－自由基的能力以及SOD酶、CAT酶和GSH－PX酶的產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示：10株乳酸菌對DPPH自由基和O2－自由基都有一定的清除能力，其中LB菌株對DPPH清除能力較強(qiáng)，清除率達(dá)到80.56%，BL菌株對O2－清除能力較強(qiáng)，清除率達(dá)到36.78%；10株乳酸菌均具有產(chǎn)生這3種酶的能力，LCP和LA產(chǎn)生較多的SOD酶和CAT酶，其中SOD酶活力達(dá)到91.29，90.56U／mL，CAT酶活力達(dá)到41.31，39.94U／mL，LC產(chǎn)生較多的GSH－PX酶，活力可達(dá)到65.45酶活力單位。

乳酸菌；自由基；抗氧化酶

氧化損傷是誘發(fā)多類疾病的一個重要原因，例如導(dǎo)致癌癥、關(guān)節(jié)炎、心血管等疾?。?］，因此，開發(fā)抗氧化劑，加強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，對氧化損傷所引起的疾病有重要的預(yù)防和治療意義。隨著人們對抗氧化劑研究的深入，對人工合成抗氧化劑的安全性問題提出質(zhì)疑［2］。天然抗氧化劑現(xiàn)已成為當(dāng)今研究熱點［3］。近年來，國內(nèi)外一些研究結(jié)果顯示：一些乳酸菌菌體及其代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性［4］。乳酸菌作為一種天然的抗氧化劑，具有安全、無毒副作用、穩(wěn)定、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等重要優(yōu)勢。有些乳酸菌不但能清除自由基，而且在發(fā)酵過程中還能分泌具有抗氧化活性的酶類，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等［5，6］。其中超氧化物歧化酶是可以清除超氧陰離子自由基的酶，過氧化氫酶是作用于過氧化氫和羥自由基的酶，谷胱甘肽過氧化物酶是清除過氧化氫和羥自由基的酶。

基于此，本研究對從傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)品中分離的10株乳酸菌抗氧化活性進(jìn)行分析，研究選用DPPH和O2－自由基的清除率作為評價乳酸菌清除自由基的指標(biāo)，并且研究了它們是否產(chǎn)生抗氧化酶，包括SOD酶、CAT酶和GSH－PX酶，這為開發(fā)功能性乳酸菌產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

從傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品中篩選的10株乳酸菌，分別為：保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，簡稱LB）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，簡稱LA）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，簡稱LP）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis，簡稱BL，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，簡稱LCR）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，簡稱LCP）、糞鏈球菌（Enterococcus faecalis，簡稱SF）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，簡稱ST）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，簡稱LC）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri，簡稱LR）、由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

B203LEDR生物顯微鏡、AC－0629普通光學(xué)顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海佳勝實驗設(shè)備有限公司；LS－C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；UV－2600紫外分光光度計 龍尼柯上海儀器有限公司；HHW21－600電熱恒溫水箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 MRS培養(yǎng)基

蛋白胨10g，牛肉膏5g，檸檬酸二胺2g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，Tween－80 1mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，蒸餾水1000mL，pH值6.0，在121℃滅菌20min。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

荸薺300g，蒸餾水1000mL，煮沸后文火保持30min，過40目篩，再稱取玉米粉10g，乳清粉10g，酵母粉10g，105℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后以備用。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將10株乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)為1%的比例接種到滅過菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)48h，按照相同步驟再重復(fù)活化1次，備用。

1.4.2 10株乳酸菌的生長曲線

將活化好的乳酸菌菌種按1%的接種量分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)，取0，8，16，24，32，40，48h的培養(yǎng)液測定其活菌數(shù)。分別以時間（t）為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)的對數(shù)值（1gn）為縱坐標(biāo)做圖，得出乳酸菌活菌數(shù)的生長曲線。活菌數(shù)的測定方法為高層瓊脂柱計數(shù)［7］。

1.4.3 10株乳酸菌發(fā)酵上清液的制備

將活化好的菌種接種到以滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)48h，發(fā)酵液經(jīng)4000r／min離心10min，收集上清液備用。

1.4.4 10株乳酸菌發(fā)酵上清液對DPPH清除率的研究方法

DPPH的自由基比較穩(wěn)定，在519nm處有最大的吸收，其溶于甲醇，呈紫色，通過樣品對DPPH自由基的作用可使溶液顏色發(fā)生變化，通過測定其吸光度的變化可以來表示樣品對其的清除率。方法參考文獻(xiàn)［8］略有改動，取2mL樣品加入2mL的0.2mmol／mL DPPH，設(shè)置樣品空白組與對照組，分別用等量甲醇代替DPPH與等量甲醇代替樣品。均以甲醇為空白調(diào)零，黑暗中37℃反應(yīng)20min，經(jīng)4000r／min離心后于519nm處測定吸光率。清除率計算公式如下：

式中：A為樣品組（含有樣品溶液以及DPPH溶液）；B為樣品空白組（含有樣品溶液不含DPPH溶液）；C為對照組（不含有樣品溶液含DPPH溶液）。

1.4.5 10株乳酸菌發(fā)酵上清液對O2－清除率的研究方法

O2－屬于人體氧自由基的一種，對O2－的清除可以減輕人體細(xì)胞的氧化損傷，防止胰島素抵抗。方法參照文獻(xiàn)［9］略有改動，取1mL樣品，加入4mL pH 8.2的Tris－HCl－EDTA緩沖液，將樣品與緩沖液于25℃水浴25min，后加入現(xiàn)配的5mmol／L鄰苯三酚溶液于25℃水浴10min，最后加0.5mL的8mol／L HCl終止反應(yīng)，由于鄰苯三酚自氧化速率過快，在420nm處有較穩(wěn)定的吸光度值，所以終止反應(yīng)后在420nm處測定其吸光度。清除率計算公式如下：

式中：A為樣品組（含有樣品溶液以及鄰苯三酚溶液）；B為樣品空白組（含有樣品溶液不含鄰苯三酚溶液）；C為對照組（不含有樣品溶液含鄰苯三酚溶液）；D為空白組（不含有樣品溶液以及鄰苯三酚溶液）。

1.4.6 10株乳酸菌產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD酶）活性變化

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)能夠清除超氧陰離子自由基的預(yù)防型抗氧化劑［10］。方法參照文獻(xiàn)［11］略有改動，發(fā)酵液經(jīng)4000r／min離心10min后，取樣品加入到黃嘌呤氧化酶法反應(yīng)體系中，室溫放置10min，于波長550nm處測定其吸光度。SOD酶活力的計算公式如下：

1.4.7 10株乳酸菌產(chǎn)過氧化氫酶（CAT酶）活性變化

過氧化氫酶（CAT酶）可催化H2O2生成水和氧，阻止H2O2與細(xì)胞有氧代謝中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基進(jìn)一步生成羥自由基，從而防止自由基對細(xì)胞的損傷。方法參照文獻(xiàn)［12］略有改動，發(fā)酵液經(jīng)4000r／min離心10min后，取樣品加入到反應(yīng)體系中，于波長405nm處測定其吸光度。CAT酶活力的計算公式如下：

1.4.8 10株乳酸菌產(chǎn)谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX酶）活性變化

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX酶）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。方法參照文獻(xiàn)［13］略有改動，取樣品加入到酶促反應(yīng)體系中，混勻，4000r／min離心10min，取上清液1mL加入到顯色反應(yīng)體系中，室溫放置15min，于波長412nm處測定其吸光度。GSH－PX酶活力的計算公式如下：

式中：A為GSH標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株乳酸菌的生長曲線

測10株乳酸菌在發(fā)酵培養(yǎng)基過程中的活菌數(shù)變化，每隔8h取樣測定，結(jié)果見圖1。

圖1 10株乳酸菌的生長曲線

由圖1可知，10株乳酸菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中均能生長，BL，LB，LR，LCR，LP在0～8h為延滯期；8～40h為對數(shù)期；40h后進(jìn)入穩(wěn)定期；LA，LC，LCP在0～8h為延滯期；8～32h為對數(shù)期；32h后進(jìn)入穩(wěn)定期；ST，SF在0～8h為延滯期；8～24h為對數(shù)期；24h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。10株乳酸菌發(fā)酵48h時，BL和LB的活菌數(shù)達(dá)到109cfu／mL，其余8株乳酸菌的活菌數(shù)均在1.3×108～9.9×108cfu／mL。

2.2 10株乳酸菌發(fā)酵上清液對DPPH自由基的清除率

圖2 乳酸菌發(fā)酵上清液對DPPH自由基的清除率

對DPPH自由基的清除可以評價乳酸菌樣品清除這類穩(wěn)定自由基的能力。由圖2可知，這10株乳酸菌的發(fā)酵上清液對DPPH自由基都有一定的清除能力，其中LB的發(fā)酵上清液對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，清除率達(dá)到80.56%，其次是LA，LCP，LR發(fā)酵上清液，清除率在50%～70%之間，其余幾株乳酸菌發(fā)酵上清液對DPPH自由基的清除率都在35%以下。

2.3 10株乳酸菌發(fā)酵上清液對O2－自由基的清除率

圖3 乳酸菌發(fā)酵上清液對O2－自由基的清除率

對O2－自由基的清除可以減少體內(nèi)的氧自由基。由圖3可知，這10株乳酸菌的發(fā)酵上清液對O2－自由基都有一定的清除能力，BL，LC，LA菌株的發(fā)酵上清液的清除率在30%以上，BL發(fā)酵上清液的清除率最高為36.78%，LP，LB，SF，LCR 4種菌株的發(fā)酵上清液對O2－自由基清除能力在20%～30%之間，其余幾株乳酸菌發(fā)酵上清液對O2－自由基清除能力在20%以下，菌株發(fā)酵上清液對O2－自由基的清除能力可能與菌株的代謝產(chǎn)物對O2－作用機(jī)制有關(guān)。對DPPH自由基的清除率與對O2－自由基的清除率之間并無對應(yīng)關(guān)系，查閱文獻(xiàn)得知可能與乳酸菌對這兩種物質(zhì)的作用原理不同有關(guān)。

2.4 10株乳酸菌產(chǎn)SOD酶活性變化

圖4 10株乳酸菌產(chǎn)SOD酶變化

SOD酶是可以清除超氧陰離子自由基的酶，由圖4可知，以不接菌為空白組，10株乳酸菌均產(chǎn)生SOD酶，其中LA產(chǎn)SOD酶量最多，活力可達(dá)到91.29U／mL，其次是LCP，LC，BL，活力依次是90.56，82.88，76.63U／mL；接著是LB，SF，LCR，LR，LP，ST，產(chǎn)生的SOD酶量相差不大，活力在60～75U／mL之間。

2.5 10株乳酸菌產(chǎn)CAT酶活性變化

圖5 10株乳酸菌產(chǎn)CAT酶變化

CAT酶是作用于過氧化氫和羥自由基的酶，由圖5可知，以不接種菌種的培養(yǎng)基為空白，10株乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基時均產(chǎn)生CAT酶，其中LA產(chǎn)量最多，活力達(dá)到41.31U／mL；其次是LCP，LR，活力依次是37.91，38.59U／mL；接著是LC，BL，活力依次是21.31，24.62U／mL；LB，SF，LCR，LP，ST產(chǎn)CAT酶較少，而且活力相差不大，活力在10～20U／mL之間。

2.6 10株乳酸菌產(chǎn)GSH－PX酶活性變化

圖6 10株乳酸菌產(chǎn)GSH－PX酶變化

GSH－PX酶是清除過氧化氫和羥自由基的酶，由圖6可知，以不接菌種的培養(yǎng)基為空白，測得其GSHPX酶的活力為19.59酶活力單位，10株乳酸菌在發(fā)酵培養(yǎng)基48h時，測得添加LC的培養(yǎng)基產(chǎn)生較多的GSH－PX酶，其酶活力可達(dá)到65.45酶活力單位，其次是LCP，LA，LR，BL，酶活力依次是41.86，34.89，41.86，38.19酶活力單位，與空白相比，添加LC的培養(yǎng)基增加46酶活力單位。

3 結(jié)論

本研究選用來自傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)品分離的10株乳酸菌，針對與抗氧化活性相關(guān)的對DPPH自由基的清除率和對O2－自由基的清除率以及SOD酶、CAT酶和GSH－PX酶的產(chǎn)生情況進(jìn)行研究，加強(qiáng)發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)品的抗氧化性。結(jié)果表明：10株乳酸菌在清除DPPH自由基和O2－自由基方面存在差異，但對DPPH自由基和O2－自由基都有一定的清除能力，其中LB對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，清除率達(dá)到80.56%；其次是LA，LCP，LR，對DPPH的清除率在45%～65%之間，BL菌株對O2－自由基清除能力較強(qiáng)，清除率達(dá)到36.78%；再次是LP，LB，SF，LCR 4種菌株，對O2－自由基清除能力在20%～30%之間；10株乳酸菌均具有產(chǎn)生這3種酶的能力，LCP和LA產(chǎn)生較多的SOD酶和CAT酶，其中SOD酶活力達(dá)到91.29，90.56U／mL，CAT酶活力達(dá)到41.31，39.94U／mL，LC產(chǎn)生較多的GSH－PX酶，活力可達(dá)到65.45酶活力單位，但10株乳酸菌產(chǎn)3種抗氧化酶方面無對應(yīng)關(guān)系，是否存在其他抗氧化活性物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

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Research on Antioxidant Activity of Several Lactic Acid Bacteria Strains

YU Fang，LV Jia－li＊，ZHANG Jun－meng，TIAN Yan－chu
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi＇an 710021，China）

10strains of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented lactic acid bacteriaproducts are studied on antioxidant activity such as the clearance ability of DPPH and O2－free radical，SOD enzyme，CAT enzyme and GSH－PX enzyme.The result shows that 10strains of lactic acid bacteria have the ability to remove DPPH and O2－free radical，LB has better ability to remove DPPH and the clearance rate is 80.56%，BL has better ability to remove O2－and the clearance rate is 36.78%；10strains of lactic acid bacteria have the ability to produce three enzymes，LCP and LA can produce more SOD enzyme and CAT enzyme.SOD enzyme activity reaches 91.29，90.56U／mL，CAT enzyme activity reaches 41.31，39.94U／mL，LC produces more GSH－PX enzyme and it can reach 65.45unit of enzyme activity.

lactic acid bacteria；free radical；antioxidant enzyme

TS261.13

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.008

1000－9973（2017）04－0032－04

2016－10－17 ＊通訊作者

余芳（1988－），女，河南永城人，碩士，研究方向：食品微生物。