何榮軍,施俊妃,孫培龍

(浙江工業(yè)大學 海洋學院,浙江 杭州 310014)

機械活化法制備抑菌材料及其對草魚的涂膜保鮮作用

何榮軍,施俊妃,孫培龍

(浙江工業(yè)大學 海洋學院,浙江 杭州 310014)

通過機械活化法對淀粉和ε-聚賴氨酸的混合物進行球磨處理得到球磨共混物,利用掃描電子顯微鏡(SEM)、X-射線衍射儀(XRD)、差示掃描量熱儀(DSC)、紅外光譜儀(FTIR)等對其晶體結構、顆粒形貌、熱特性和化學結構進行表征,并初步探討了它對草魚的涂膜保鮮效果.結果表明:在機械活化過程中,淀粉和ε-聚賴氨酸的晶體結構和顆粒形貌發(fā)生變化、粒徑減小、結晶度下降、糊化溫度降低,但是其化學結構沒有改變.(4±1) ℃條件下對草魚魚肉進行涂膜處理,結果表明:球磨共混物涂膜處理組的揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)和丙二醛(TBA)含量顯著低于物理混合物涂膜處理組,可減緩pH的變化,并可使菌落總數(shù)指標在10 d之內(nèi)不超過5 (lg CFU/g).這些結果表明,機械活化法制備抑菌膜材料在保鮮方面有潛在的應用價值.

淀粉;ε-聚賴氨酸;機械活化;性能表征;涂膜保鮮

塑料包裝因其優(yōu)越的機械性能被廣泛應用于食品包裝和保鮮領域,但是帶來的環(huán)境污染問題迫使人們尋求能取代塑料制品的“綠色包裝”材料.在眾多的“綠色包裝”材料中,可食性膜在近年來備受關注[1].探索具有良好成膜性能并且具有抑菌活性的膜材料已成為食品科技工業(yè)發(fā)展的一個重要方向,也是今后食品包裝工業(yè)發(fā)展的主要趨勢[2-3].

淀粉作為一種天然高分子材料[4],來源豐富,具有價格低廉、易生物降解、天然可再生等特點,是一種理想的綠色包裝材料.但是由于淀粉具有較強的親水性,容易滋生細菌等微生物,且其高晶結構致使淀粉基可食性膜的機械性能較差,這些缺點限制了淀粉在食品保鮮及食品包裝行業(yè)的應用[5].因此,往往在淀粉中加入增塑劑[6]、抑菌劑[7-9]或對淀粉進行改性[10-12]來改善淀粉基可食性包裝材料的性能.ε-聚賴氨酸是一種天然抑菌劑,具有廣譜抑菌性,對酵母菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都具有顯著的抑菌效果[13],并且其安全性和熱穩(wěn)定性良好,在食品保鮮中具有巨大的應用前景[14].機械活化(Mechanical activation),是指固體顆粒物質在摩擦、碰撞、沖擊、剪切等機械力作用下,晶體結構及物化性能發(fā)生改變,部分機械能轉變成物質的內(nèi)能,從而引起固體的化學活性增加[15].機械活化法條件控制簡單、綠色環(huán)保、安全高效.目前對機械活化在超微細化、納米粉末、輔助提取技術、有機材料合成方面的研究日益廣泛[16-18].本試驗將淀粉及ε-聚賴氨酸充分混合,采用機械活化法對其進行球磨處理,制備一種具有抑菌活性的淀粉膜材料.為了深入掌握機械活化反應本質及淀粉與ε-聚賴氨酸在機械活化過程中的變化,本研究采用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy, SEM)、X-射線衍射(X-Ray diffraction, XRD)、差示掃描量熱儀(Differential scanning calorimetry, DSC)、紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)對球磨共混物(MASP)進行表征分析,并初步探討其對草魚涂膜保鮮的效果,進而為機械活化在變性淀粉領域上的應用提供理論和現(xiàn)實依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉(NS),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;ε-聚賴氨酸(ε-PL),浙江新銀象生物工程有限公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,杭州微生物試劑有限公司;NaOH、EDTA、高氯酸、三氯乙酸、甲基紅、次甲基藍、硫代硫酸鈉、硫酸、硫代巴比妥酸,國產(chǎn)分析純,上海凌峰化學有限公司.

淀粉和ε-聚賴氨酸的物理混合物稱為NSP,采用機械活化法球磨處理之后的產(chǎn)物稱為MASP.

1.2 儀器與設備

自制球磨機(兩個不銹鋼球磨罐內(nèi)徑Φ為65 mm,高為50 mm,有效容積為166 mL,球磨介質為φ10 mm的不銹鋼磨球).

VEGA 3 SBH臺式鎢燈絲掃描電子顯微鏡,捷克TESCAN公司;X’Pert PRO型X-射線衍射儀,荷蘭Pnalytical公司;DSC-Q2000差示掃描量熱儀,美國TA公司;Nicolet 6700傅立葉變換紅外光譜儀,美國熱電尼高力公司;PHS-3C型數(shù)顯酸度計,上海精科儀器有限公司;K9840自動凱氏定氮儀,濟南海能儀器股份有限公司;UV 762紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 MASP的制備

將干燥的淀粉和ε-PL混合均勻,置于球磨罐中,加入球磨介質,在一定的球磨功率條件下進行球磨處理,一定時間后將產(chǎn)物與球磨介質分開,得到球磨共混物MASP,烘干,密封保存?zhèn)溆?

1.3.2 MASP的表征

1) 顆粒形貌觀察.取適量樣品用雙面膠固定在樣品臺上噴金,使用TESCAN VEGA 3 SBH臺式鎢燈絲掃描電子顯微鏡觀察MASP的顆粒形貌.

2) 晶體結構測定.采用X-射線衍射儀對MASP進行結晶結構的表征分析.測定條件:管電壓40 kV;Cu靶;管電流40 mA;掃描范圍2θ=10～40°;掃描速率:4 (°)/min.

3) 熱特性測定.使用差示掃描量熱儀對MASP在糊化過程中的熱特性進行表征.測試方法:用樣品鋁盒稱取約4.0 mg樣品,按1∶4比例加入去離子水,密封后放置平衡4 h,以空盒作為參比,從30 ℃加熱掃描至150 ℃;掃描速率10 ℃/min;樣品室氮氣流量30 mL/min.

4) 紅外光譜測定.將1～2 mg MASP在紅外燈輻射下與干燥的KBr粉末(1∶100)一起研細混勻,壓片后用紅外光譜儀進行測試,以NSP作對照,掃描范圍400～4000 cm-1.

1.3.3 草魚涂膜保鮮

1) 涂膜液的制備.將MASP和NSP分別制成30 g/L的淀粉糊液,其中,ε-PL的等價質量分數(shù)為0.1%,沸水浴糊化30 min,加入質量分數(shù)1.5%的甘油溶液,磁力攪拌1 min,真空脫氣,冷卻至室溫備用.

2) 草魚處理方法.選用新鮮草魚在4 ℃的清水中暫養(yǎng)1～2 h,冰溫放血后去頭、尾、鱗和內(nèi)臟,預冷水清洗干凈后剔除魚骨,分割成約3 cm×3 cm×2 cm左右的魚塊(25 g左右)備用.魚塊分別放入兩種涂膜液中浸泡2 min,取出瀝干后放入無菌培養(yǎng)皿上,分別標記為MASP組和NSP組,在清水中浸泡2 min的魚塊作為空白對照組,于(4±1) ℃培養(yǎng)箱中敞口貯藏10 d.每兩天測定魚肉的pH值、細菌總數(shù)、TVB-N值以及TBA值等品質指標,每次實驗重復3次,取平均值,并分析不同處理組的差異.

3) 鮮度指標測定.① pH值的測定:魚肉的pH值按照GB 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》進行測定.準確稱取各組魚肉5.00 g,絞碎后加入已滅菌的蒸餾水45 mL,攪拌后浸提30 min.過濾后取濾液測pH值,每個樣品重復測定3次取平均值.② 細菌總數(shù)測定:魚肉細菌總數(shù)的測定按照GB/T 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》進行測定.在無菌操作條件下準確稱取各組魚肉10.00 g,放入90 mL無菌生理鹽水中,將肉攪碎,取1 mL勻漿液梯度稀釋,選擇3個合適的稀釋梯度傾注平板,每個稀釋度重復3次,30 ℃培養(yǎng)72 h,菌落(CFU)計數(shù).③ TVB-N值的測定:TVB-N值的測定按照GB/T 9695.11—2008《肉與肉制品 氮含量測定》進行測定.準確稱取絞碎的魚肉5.00 g,加入45 mL浸提液(含0.6 mol/L高氯酸,4%三氯乙酸),用玻棒攪拌均勻,抽提60 min后過濾備用.濾液按照半微量定氮法測定.具體方法:25 mL錐形瓶中分別添加4%硼酸吸收液10 mL,混合指示劑2滴,30%氫氧化鈉溶液5 mL,蒸餾水10 mL,蒸餾時間5 min,吸收液立即用新配0.01 mol/L硫酸標液滴定,重復3次取平均值.④ TBA值的測定:利用硫代巴比妥酸(TBA)法測定魚肉中的丙二醛含量[19].準確稱取碾碎的魚肉5.00 g,加入45 mL已預冷的7.5% TCA溶液,勻漿2 min,4 ℃下抽提30 min,不時振蕩,8 000 r/min離心10 min,取5 mL上清液和5 mL 0.02 mol/L TBA溶液混勻,于90 ℃水浴中反應40 min,流水冷卻后,于532 nm處測定吸光度,根據(jù)標準曲線計算樣品TBA值.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與整理

通過Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件進行繪圖.方差分析使用SPSS 22.0 for Windows進行,顯著性差異檢驗使用LSD檢驗法,P<0.05表示具有顯著性差異.所有試驗平行重復3次.

2 結果與分析

2.1 MASP表征分析

2.1.1 MASP掃描電鏡分析

SEM是觀察淀粉顆粒形貌發(fā)生變化的有效途徑之一,可以分析產(chǎn)品的微觀結構.采用掃描電子顯微鏡對NS和MASP的顆粒形貌進行初步檢測分析,得到的SEM圖如圖1所示.與圖1(a)NS相比,圖1(b)中的MASP的顆粒結構發(fā)生了較大程度的變化.MASP顆粒表面粗糙,褶皺增加,部分顆粒的中部凹陷或者中空成扁平環(huán)狀,部分顆粒周邊粘連著許多結構不規(guī)則的小顆粒.由此可知,經(jīng)過機械力的碰撞、摩擦、沖擊和剪切作用[20],NS的顆粒結構受到較大程度的破壞,部分顆粒的粒徑變小,使ε-PL更容易進入NS內(nèi)部,增加了與NS之間的接觸面積.

圖1 NS和MASP的SEM圖Fig.1 SEM patterns of NS and MASP

2.1.2 MASP的X-射線衍射分析

不同的結晶結構在X-射線衍射曲線上會出現(xiàn)不同的衍射特征峰.因此,X-射線衍射可以作為研究淀粉顆粒的結晶結構和結晶度的重要手段之一.NS和MASP的X-射線衍射曲線如圖2所示.由圖2(a)可見:NS屬于典型的A型結晶結構,在2θ為15,17,18,23°處出現(xiàn)明顯的晶體衍射峰[21].而MASP的衍射曲線中,衍射峰幾乎消失,整條曲線變成一條具有饅頭峰形的平緩曲線,在2θ為19°處附近有一彌散峰,主要表現(xiàn)彌散衍射特征,此時符合V型的結晶結構.說明在機械力的作用下,NS的晶體結構遭到嚴重破壞,淀粉顆粒的無定形程度增加,部分晶體結構已經(jīng)轉化為非晶體結構.

1—NS;2—MASP圖2 NS與MASP的X-射線衍射圖Fig.2 X-Ray diffraction patterns of NS and MASP

2.1.3 MASP熱特性分析

NS和MASP在糊化過程中的DSC曲線如圖3所示.由圖3可見:NS在30～150 ℃存在兩個吸熱特征峰,兩峰中處于低溫的吸熱峰(Peak 1)是因淀粉加熱糊化發(fā)生了從多晶態(tài)到非晶態(tài)和從顆粒態(tài)到糊化態(tài)的雙重物態(tài)轉化引起.另一較高溫度的吸熱峰(Peak 2)的峰值溫度為129.8 ℃,是由于加熱升溫過程中NS中的水分蒸發(fā)及鏈水結晶結構的破壞吸熱而形成的.MASP的DSC曲線中,觀察到糊化相變吸熱峰消失,即已經(jīng)達到糊化狀態(tài),MASP的晶體結構受到嚴重破壞,而peak 2的峰值溫度增加到132.6 ℃,且強度有所增強,這是由于淀粉的結晶結構受到破壞,水分子易于滲入淀粉分子內(nèi)部并結合所引起的[20].這個結果也證實了XRD和SEM的分析結果.

1—NS;2—MASP圖3 NS與MASP的差示掃描量熱圖Fig.3 DSC of NS and MASP

2.1.4 MASP紅外分析

紅外光譜技術是鑒定化合物中分子組成和官能團結構的最有效手段之一.ε-PL,NS,NSP及MASP的紅外吸收光譜圖如圖4所示.在ε-PL的紅外譜圖圖4(a)中,3 442 cm-1處為NH2的非對稱伸縮振動峰,2 930 cm-1處為C—H伸縮振動峰.1 562 cm-1處為NH鍵(酰胺Ⅱ),1 646 cm-1和1 538 cm-1處的峰為羰基伸縮振動峰(酰胺Ⅰ)和N—H彎曲振動峰.1 245 cm-1處的峰是酰胺鍵的C—N伸縮振動引起的.在NS的譜圖圖4(b)中,3 342 cm-1處為羥基的伸縮振動峰,1 649 cm-1處為結合水的羥基峰.763 cm-1到1 158 cm-1的峰指的是C—O伸縮振動吸收峰.

1—ε-PL;2—NS;3—NSP;4—MASP圖4 ε-PL,NS,NSP和MASP的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of ε-PL, NS, NSP and MASP

MASP與NSP(圖4(b))的紅外譜圖相比,譜圖在氫鍵區(qū)、飽和碳氫鍵區(qū)、指紋區(qū)吸收峰的形狀、位置基本保持不變.MASP譜圖中,羰基(酰胺I)的伸縮振動峰從1 646 cm-1向高波數(shù)方向移動到1 770 cm-1處.說明在機械活化過程中,NS和ε-PL的化學結構沒有發(fā)生根本改變,只是NS與ε-PL發(fā)生了分子間非共價相互作用[22].

2.2 草魚魚肉涂膜保鮮結果分析

2.2.1 細菌總數(shù)和pH變化

魚肉的腐敗主要是由微生物作用引起的,因此,細菌總數(shù)是反映魚肉腐敗程度和鮮度的重要指標之一.從圖5(a)可知:在為期10 d的冷藏儲藏期間,各組的菌落總數(shù)均呈上升趨勢,而涂膜組的細菌總數(shù)增長相對緩慢,其中MASP處理組細菌總數(shù)增加速度最慢;NSP組在第8天時達到5.1(lg CFU/g),而MASP組在第10天仍未超過5(lg CFU/g).Huang等[23]的研究指出:魚肉中菌落總數(shù)達到了5(lg CFU/g)即達到其可食用的上限.由此可見MASP組在貯藏中后期抑制細菌生長的效果顯著優(yōu)于NSP組(P<0.05).由圖5(b)可知:冷藏鮮草魚塊貯藏期間pH值先下降后上升.冷鮮魚肉在貯藏初期糖原酵解生成乳酸導致pH值下降,到貯藏中、后期,魚體內(nèi)源組織蛋白酶被釋放出來,再加上微生物作用會導致水產(chǎn)品中蛋白質分解而產(chǎn)生氨及胺類等堿性揮發(fā)性物質,從而使pH值上升.

圖5 冷藏過程中草魚魚肉細菌總數(shù)及pH值變化Fig.5 Changes of total bacteria counts and pH in grass carp during cold storage

2.2.2 草魚TVB-N和TBA質量分數(shù)的變化

TVB-N是蛋白質在內(nèi)源酶和細菌的共同作用下分解產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質,通常是魚類腐敗初期的重要評價指標[24].由圖6(a)可見:草魚魚肉在貯藏過程中TVB-N質量分數(shù)逐漸上升.根據(jù)GB 2733—2005《鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標準》,淡水魚食用標準TVB-N≤200 mg/kg.涂膜處理明顯延緩了草魚塊冷藏期間TVB-N質量分數(shù)的增加,其中MASP涂膜處理組效果最好,并且顯著優(yōu)于NSP組(P<0.05).NSP組在第8天時TVB-N質量分數(shù)為214.5 mg/kg,而MASP組在第10天時仍處于可食用范圍.

圖6 冷藏過程中草魚魚肉TVB-N及TBA值變化Fig.6 Changes of TVB-N and TBA value in grass carp during cold storage

脂類食品中不飽和脂肪酸氧化降解產(chǎn)物丙二醛能與TBA試劑反應生成穩(wěn)定的紅色化合物,該物質在530 nm處有最大吸收峰值,利用該性質測定TBA值.使用TBA值反映魚肉脂肪的氧化酸敗程度,TBA值越大,魚類脂肪的最終氧化程度越高.由圖6(b)看出:草魚魚塊冷藏期間TBA含量呈現(xiàn)上升趨勢,對照組尤為明顯,10 d時的TBA含量是0 d時的4.45倍.涂膜處理組TBA值增加得相對緩慢,與TVB-N的變化趨勢類似,MASP組的效果顯著優(yōu)于NSP組(P<0.05).

3 結 論

魚肉的腐敗是一個復雜的變化過程,其中微生物的大量繁殖是最主要的原因,因此抑菌成為魚類保鮮的研究熱點.對冷鮮魚塊進行涂膜處理,結果顯示:MASP涂膜不僅能有效延緩pH的變化,抑制TVB-N和TBA值的上升,還能顯著抑制細菌的生長.冷鮮魚塊貯藏10 d后,MASP組的各項鮮度指標均達到食用標準,并顯著優(yōu)于NSP組.MASP的涂膜保鮮效果顯著提高的原因是由于機械活化作用有效破壞了淀粉致密的顆粒表面和結晶結構,淀粉從多晶態(tài)轉變?yōu)榉蔷B(tài),糊化溫度降低,粒徑減小,與ε-PL的接觸面積增大,分子間相互作用增強,從而使MASP涂膜更加致密,其阻隔性能和抑菌性能顯著提高.本文研究了機械活化過程中膜材料的結構變化和涂膜保鮮效果,展現(xiàn)出機械活化技術在淀粉改性方面的巨大研究發(fā)展空間,為機械活化技術應用到食品包裝保鮮方面提供了現(xiàn)實意義.

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(責任編輯：朱小惠)

Preparation of antibacterial coating materials by mechanical activation method and preservation of grass carp

HE Rongjun, SHI Junfei, SUN Peilong

(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

At the solvent-free and external agents-free condition, the mixture of starch and ε-Poly-L-lysine (NSP) was mechanically treated by the technology of mechanical activation method with a ball mill, and the product was named MASP. The effect of ball milling treatment on the morphology, crystal structure and molecular groups of starch was explored by scanning electron microscopy (SEM), X-Ray diffraction (XRD), differential scanning calorimetry (DSC) and fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The films of MASP were covered on grass carp. The preserving quality of grass carp during cold storage (4±1) ℃ was assessed. The results indicated that during the preparation process, the particle morphology and crystallization of starch were destroyed, but the chemical structure of starch and ε-Poly-L-lysine was almost not changed. The contents of volatile base nitrogen (TVB-N) and malondialdehyde (TBA) of the MASP coating treatment group were significantly lower than those of the NSP coating treatment group, slowed down the rate of change, meanwhile the total number of colonies didn’t exceed 5 (lg CFU/g) within 10 days. These results indicated that the preparation of antibacterial coating materials by mechanical activation method has potential application value in preservation.

starch; ε-Poly-L-lysine; mechanical activation; performance characterization; film-coating preservation

2017-02-17

浙江省自然科學基金資助項目(LY12H28007)

何榮軍(1978—),男,浙江龍泉人,副教授,碩士,研究方向為食品化學,E-mail:hrjun@zuju.edu.cn.

TS205.9

A

1674-2214(2017)01-0030-06