林春麗 張海波 陳紅霞 侯春燕 云雨生/內(nèi)蒙古維克生生物科技有限公司

牛腹瀉病毒的PCR檢測方法

林春麗 張海波 陳紅霞 侯春燕 云雨生/內(nèi)蒙古維克生生物科技有限公司

本研究是通過PCR技術對新生牛是否帶有牛病毒性腹瀉病毒進行檢驗，排除其患病牛，制備無病毒血清，進一步用于獸藥的研制。

一、材料與方法

（一）材料

1.主要試劑。RNAiso plus購自Takara公司；氯仿、無水乙醇、75%酒精，DEPC水、ddH2O、DNA Marker購自TakaRa公司；核酸染料購自百泰克有限公司；高速低溫離心機購自Sigma公司；PCR擴增儀為美國伯樂公司，型號為S1000；凝膠成像儀。

2.樣品。共30個樣本包括：28個未知樣本均為新生牛初血清；空白對照；陰性對照和陽性對照。

（二）方法

1.PCR檢測。PCR技術，即聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是由Saiki發(fā)明，其技術對世界生物醫(yī)學的巨大推動作用，獲得了1992年的諾貝爾醫(yī)學獎。由美國PE-Cetus公司的Kary Banks Mulis在1985年建立的。這項技術可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

二、操作步驟。

（一）樣品提取前準備

1.器材準備。1 000μl槍，200μl槍，50μl槍、1 000μl槍頭，200μl槍頭，75%酒精棉，止血鉗，EP管，EP管架等。

2.提取步驟。

（1）取2 ml無菌無酶EP管，加入RNA Siso Plus（裂解液）900μL（加液過程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品，需更換槍頭），再分別吸取待測血清樣品、陽性對照、陰性對照各200μL于EP管中，每加一次樣品換一次槍頭。輕輕上下顛倒搖勻，至底部無沉淀，顏色均一，冰盒中靜置5min。將已檢測樣品放回-20℃冷凍保存。（陰性對照放在中間順序）

（2）12 000 r/min、4℃，離心1 min。加入200μL的氯仿，上下顛倒20次混勻，至顏色均一為乳粉色，冰盒中靜置8 min。

（3）12 000 r/min、4℃、離心15 min。在離心剩余2 min時準備新1.5 ml無菌無酶EP管，加入800μl-20℃預冷的異丙醇。從離心機輕拿輕放取出EP管。（離心后液體分為三層，底層為有機溶液層，中層蛋白質，上層上清液含RNA）。吸取400μl上清液（分兩次200μl吸取，吸取上層液體時切勿碰觸或吸取中層蛋白質），放入事先加好異丙醇的新1.5 ml EP管中，輕輕上下顛倒20次搖勻，-20℃靜置20 min。

（4）12 000 r/min、4℃、離心15 min。離心機中EP管擺放方向保持一致，以使沉淀在管底同一側。若離心后不出沉淀繼續(xù)-20℃放置10～20 min后離心。棄上清，保留沉淀。沉淀即為RNA提取物，量很少，在倒上清液時注意，切勿將沉淀倒出。

（5）加入1 ml 75%乙醇（DEPC水配制，加乙醇過程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品，需更換槍頭），輕輕上下顛倒，洗滌沉淀，將沉淀懸浮起來即可。

（6）7 500 r/min、4℃、離心5 min。棄上清，保留沉淀。用200μl槍頭將管底殘余乙醇液體吸凈，吸取一個樣品換一個槍頭，注意不要碰觸和吸取到RNA沉淀。

（7）EP管中的RNA在超凈工作臺中室溫下自然干燥10 min。加入20μL的無RNase水（將水加到沉淀上），輕彈溶解沉淀，短期使用-20℃保存，長期使用保存于-70℃下。

（二）引物設計

根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫，使用引物設計軟件Primeier 5.0設計BVDV特異性引物如下。

gB1、gB2引物

FR oe rv we引ar s物red名 PP稱rrii m meerr 5 5''--TG AG CT GA AC CG核TT CC苷GT TC酸TC CA序GA CG列GC CT TG CC TC CC --33’’

gE1、gE2引物：

FR oe rv we引ras物red名 PP稱rrii m meerr 5 5''--CGTCTTTTGCTG核CGG苷TCCC酸GCAG序CA T列CT GG GA T GT CCTGT --33’’

PCR操作程序

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PCR反應參數(shù)設定

注：按照上述表格所示，反應體系配制在冰盒上進行，設定好反應程序后，將裝有上述體系液體PCR反應管，包括對照管（空白PCR體系管和水樣PCR體系管）放入Smart CycLer System中按照表格中參數(shù)設定PCR儀進行PCR反應。

圖1 PCR儀

（三）電泳分析

1.制膠。稱取1.35 g瓊脂糖粉放入錐形瓶中（注：倒入過程中避免瓊脂糖粉末粘在錐形瓶壁上。）加入90 ml 1*TBE溶液，微波爐加熱無絮狀物至完全溶解（注：至少沸騰3次），取出錐形瓶后，冷卻至60℃左右，加入17μL的核酸染料，搖至徹底混勻后倒入帶有梳子的膠槽中（輕輕混勻即可，避免氣泡產(chǎn)生），冷卻凝固40 min。

2.電泳。

（1）將制好的膠放入電泳槽中，倒入1*TBE，液位高于膠面2 mm。

（2）用移液槍取20μl 6×Loading Buffer于載玻片上，并取3μl加至PCR產(chǎn)物管中反復吹打三次混勻后吸取10μl混合液加入瓊脂糖凝膠點樣孔中，從左面第二個孔開始依次點樣品、陰性對照與陽性對照，最后取7μl marker點于第一個孔中。

（3）將電泳儀正負極對應連接，開啟電泳儀電源開關，在120V電壓下電泳50 min。將跑完的瓊脂糖凝膠從電泳槽取出，放在凝膠成像儀中，進行觀察。

三、結果判定

圖2 未感染與感染樣本對照

如圖2，12號為陰性對照，無明亮的；24號為陽性對照，出現(xiàn)明亮的條帶，證明實驗成立。剩余樣本在316 bp處，8號、9號、10號、11號、20號、21號、23號出現(xiàn)明亮的條帶，說明該樣本血清樣本染牛腹瀉病毒。

四、影響PCR檢測因素

（一）dNTP的質量與濃度

1.dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。在PCR反應中，dNTP應為50～200 umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

2.Mg2+濃度。Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200 umol/L 時，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L 為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。

3.溫度與時間的設置?；赑CR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90℃～95℃變性，再迅速冷卻至40℃～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70℃～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300 bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

4.循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

（二）影響PCR特異性的因素

通過上述內(nèi)容，可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性。

1.退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。

2.減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。

3.引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化.

4.改變MgCl2濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。

一般認為PCR產(chǎn)物應在48 h以內(nèi)完成電泳檢測，有些最好于當日電泳檢測，大于48 h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。

（略）