王秋實 雷慧萌

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學系，北京 100069)

·基礎研究 ·

清醒小鼠腦部神經元急性細胞外記錄

王秋實 雷慧萌*

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學系，北京 100069)

目的 介紹對清醒小鼠腦部進行急性在體細胞外電生理記錄的方法及一些基本的數據處理方法。 方法 采用多通道硅電極及清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)在小鼠清醒狀態(tài)下對其腦部神經元做急性細胞外記錄。首先，在小鼠的顱骨表面粘貼一個不銹鋼頭板，術后小鼠恢復一周后，將不銹鋼頭板與清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)相連使小鼠的頭部得以固定，其四肢踩在一個漂浮的泡沫球上可以自由的活動，對小鼠進行連續(xù)3 d的適應性訓練，每天的訓練時間遞增，使之能夠逐漸熟悉并適應電生理記錄的環(huán)境，然后，將多通道急性硅電極插入小鼠腦內，應用多通道電生理記錄系統(tǒng)，記錄神經元的動作電位(spike)及局部場電位(local field potential, LFP)，并應用Offline Sorter軟件對單個神經元(Single Unit)進行劃分以及應用NeuroExplore軟件對LFP通過濾波的方法劃分出4種震蕩成分Delta、Theta、Beta和Gamma震蕩。 結果 在清醒小鼠腦內成功記錄到了神經元的動作電位及LFP，并通過軟件劃分出了Single Unit和Delta、Theta、Beta和Gamma 4種震蕩成分。結論 應用清醒小鼠神經元急性細胞外記錄的方法，能夠很好的記錄到動作電位及LFP。

清醒；急性；在體；細胞外；電生理

通過在體細胞外電生理記錄的方法對神經元的活動進行記錄是研究神經元電生理特性及活動情況的一項基本方法[1-4]。以往的細胞外電生理記錄方法主要是將電極植入到動物腦內，進行神經元電活動的觀察，由于電極植入后位置便固定，因此很難實現(xiàn)在短時間內在較大深度跨度的腦區(qū)進行神經元電活動的監(jiān)測。而近些年來通過硅電極結合清醒動物頭部固定技術則可以展開對清醒動物腦部神經元進行急性的電生理監(jiān)測,其不但可以實現(xiàn)在短時間內在較大深度跨度的腦區(qū)內進行電信號的記錄，在尋找單個神經元的動作電位(即Single Unit)方面，以及對動物實施某些特定的行為學操控的便利性等方面，亦有著較大的優(yōu)點。因此，清醒動物急性細胞外記錄在研究神經活動方面有著較重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J SPF級小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2015-0001，所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學SPF級動物房。

1.2 材料及試劑

清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)、小鼠頭部立體定位儀、小鼠頭部固定用不銹鋼頭板(千奧星科生物科技有限公司)；微操縱器(Siskiyou 公司，美國)；16通道急性細胞外電生理記錄硅電極(NeuroNexus公司，美國)；多通道電生理記錄系統(tǒng)(BlackRock公司，美國)；C&B-Metabond(Parkell公司，美國)；DiI(Molecular Probes公司，美國)；手術顯微鏡(World Precision Instruments公司，美國)；電鉆(韓國世新公司，韓國)；銀線(A-M Systems, 美國)；不銹鋼眼鏡螺絲；數顯焊臺(益誠達電子設備廠)；焊錫絲(璽力，中國)；蠕動泵(蘭格恒流泵有限公司，中國)；冰凍切片機(Leica公司, 德國)；正置熒光顯微鏡(尼康公司，日本)；Offline Sorter軟件、NeuroExplore軟件(Plexon公司，美國)；Matlab軟件(Mathworks公司，美國)；水合氯醛(天津市光復精細化工研究所)；多聚甲醛(天津市福晨化學試劑廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 多通道電生理記錄裝置的連接

多通道電生理記錄系統(tǒng)包括以下設備，并按下圖紅色箭頭所指的順序連接在一起(圖1)。實驗所采用的急性多通道記錄電極由2部分組成，上方的連接包和下方的電極陣列，電極陣列由硅制作，上有多個電極記錄位點，而連接包內則包含有各個電極位點所連接的傳輸線路以及與電極適配器的連接接口。電極陣列是電極下入腦組織的部分，為了減小電極的插入對腦組織造成的損傷，電極陣列制作的非常細非常薄，本實驗采用的16通道急性記錄電極的電極陣列部分寬度為30～200 μm(上寬下窄)，厚度15 μm，從上到下等距分布有16個電極點，因此電極陣列特別容易折斷，使用時應注意防止觸碰到外力因素(圖1A)。電極適配器是直接與電極相連接，其通過夾持桿固定于微操縱器，因此可通過微操縱器控制電極的前后、左右和上下3個方向的移動(圖1B)；Headstage的一端與電極適配器相連，另一端連于數字集線器，其作用主要是模數轉換、信號放大以及對一些噪音信號的過濾，其將電極采集到的模擬信號轉換為數字信號，并通過內置的放大器將信號進行放大(圖1B)；數字集線器有多個連接通道，可以同時和多個Headstage相連，得以同時記錄多個腦區(qū)的電信號，此外其將輸入的電信號轉換為光信號，通過光纖向神經信號處理器進行長距離高保真的信號傳輸(圖1C)；神經信號處理器可以實現(xiàn)高分辨率數據的采集，以及對電生理信號采集軟件的諸多指令得以實施，比如采樣率及采樣頻率范圍的控制、電極電阻值的測定等，此外，尚可以和第三方的軟硬件實現(xiàn)同步化記錄，比如行為學系統(tǒng)、刺激系統(tǒng)以及視頻系統(tǒng)等(圖1D)。電生理信號采集軟件則是實現(xiàn)對電生理信號采集的條件的設定以及波形等界面的呈現(xiàn)等(圖1E)。

圖1 多通道電生理記錄裝置的連接

A:16-channnel acute silicon electrode and enlarged view of recording sites, each white dot represents a recording site, the upper part (a) of the electrode is “connector package”, the bottom part (b) is ”electrode array ”which is made of silicon; B:electrode adaptor and headstage; C:digital hub; D:neural signal processor; E:neural signal recording software.

1.3.2 小鼠頭部粘貼不銹鋼頭板

6%(質量分數)水合氯醛 6 mL/kg腹腔注射將小鼠麻醉，用手術剪剪去頭部被毛；將麻醉后小鼠的頭部固定于小鼠頭部立體定位儀，在手術顯微鏡下減掉頭皮，暴露顱骨，清除顱骨表面的結締組織(圖2A)。

根據小鼠腦圖譜[5]，查找待記錄腦區(qū)坐標值。本實驗選取的記錄位置為內側紋狀體區(qū)域(Bregma前方620 μm，旁開1 500 μm)，通過微操縱器進行定位，并在顱骨上做標記點。

磨薄標記點處顱骨(圖2A、B)，以方便做電生理記錄時易于揭去顱骨并暴露腦組織，并可以保護其下方腦組織，防止在做記錄前被小鼠撓破以及感染等。以標記點處為中心，用電鉆輕輕將標記點處顱骨磨薄至一薄層骨片，打磨范圍直徑約1 000 μm。注意在磨薄顱骨的過程中將電鉆調至比較慢的轉速檔位，同時在打磨的過程中手法亦要輕，防止將顱骨磨穿暴露腦組織。

配制C&B-Metabond，粘貼不銹鋼頭板。C&B-Metabond是一種受溫度感應的速干粘接劑。將配制好的C&B-Metabond涂抹于小鼠顱骨的表面及頭板的一面，然后將頭板粘在小鼠顱骨表面，使標記點處于頭板中部的圓形空窗內(圖2B)，該圓形的空窗，可以使待記錄的腦區(qū)位于其內，在頭板兩端有兩個半開放的小孔，用于和清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)相連接(圖2C)。然后在頭板的周圍均涂抹上C&B-Metabond使頭板能夠和顱骨粘結緊密。

腦組織接地裝置。在頭板后方的顱骨上鉆一個小孔，鉆通顱骨并暴露腦組織表面，將已焊接上銀線的眼鏡螺絲(圖2D)鉆入小孔內使之與腦組織相連(圖2A)，在做電生理記錄時再將焊接在電極適配器地線位點上的銀線與眼鏡螺絲上的銀線通過焊錫連接在一起(圖2F)，這樣便可以使腦組織得以接地。

1.3.3 小鼠術后恢復及適應性訓練

貼頭板術后小鼠單籠飼養(yǎng)，休息一周使其身體狀態(tài)能得到較為充分的恢復；將小鼠固定在清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)(圖2E)上進行適應性訓練，使之能夠習慣和適應該環(huán)境，以減輕其恐懼情緒，使記錄時更接近于自然的狀態(tài)。

清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)主要由以下5個部分組成：(1)頭部固定架：用于和小鼠顱骨的頭板相連使小鼠的頭部得以固定(圖2F，綠色箭頭 )；(2)懸浮球：一個由泡沫材質制成的球，在其后方相連著一個送風裝置，通過送風可以使泡沫球懸浮在空氣中。該球的作用是小鼠的四肢可以踩在球上得以自由的活動(圖2F，藍色箭頭 )；(3)運動軌跡探測器：通過兩個運動軌跡探測器可以從三維的方向上記錄懸浮球運動的速度，便于數據分析時區(qū)分不同的運動狀態(tài)以控制數據質量的精確性(圖2E，紅色箭頭 )；(4)身體固定架：罩在小鼠身體的上方，防止其身體隨懸浮球的運動而過于扭曲(圖2F，紅色箭頭 )；(5)微操縱器固定架：用于將微操縱器安裝于其上，實現(xiàn)對電極的移動(圖2E，綠色箭頭 )。

將小鼠放在清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)上，小鼠的頭部通過頭板與清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)的頭板固定架相連接而使其頭部得以固定，小鼠的腳下踩著一個懸浮的泡沫球，其四肢可以在浮球上自由的活動，這樣得以制造一個虛擬的現(xiàn)實環(huán)境[6-7]。將小鼠放在清醒小鼠記錄系統(tǒng)上對小鼠進行連續(xù)3 d的適應性訓練，第1天訓練2 h，第2天4 h，第3天6 h，3 d的訓練結束后小鼠休息1 d，使其體力得到恢復，次日便可進行電生理記錄。

1.3.4 電生理信號的采集

將小鼠固定于清醒小鼠頭部固定系統(tǒng)上(圖2E)；揭開之前在待記錄腦區(qū)處磨薄后的殘余骨片，撕掉硬腦膜，暴露腦組織；事先使電極表面附著DiI[8]。DiI是一種親脂性的熒光染料，可被激發(fā)光激發(fā)顯示出紅色熒光。將電極在DiI溶液中重復性的連續(xù)浸蘸10次，每2次浸蘸之間停留約5 s以上使其在空氣中干燥，這樣便可使電極表面附著有DiI，當電極下入腦組織后，附著在電極上的DiI能與神經元細胞膜內的脂分子相結合而使得電極經過腦組織的路徑得以顯示,可以在腦切片上觀察記錄的目標位置是否正確；將電極適配器上的銀線與連于小鼠腦內的眼鏡螺絲上的銀線焊接在一起使腦組織接地(圖2F)；最后將電極插到電極適配器上，并下入腦組織內，打開數字集線器及信號處理器的開關，并打開電腦上的電生理采集軟件Central，便可對神經元的電生理信號進行采集和記錄。

圖2 小鼠顱骨貼頭板手術及清醒小鼠急性電生理記錄

A:Spectacle screw (with a silver wire welded on the head of it, the red arrow) was turned through the burr hole to make it connect to the brain tissue, the black arrow indicates the recording area; B:The head-plate adhered onto the skull, let the recording area inside the circle window of head-plate, the black arrow indicates the recording area;C:stainless steel head-plate; D:spectacle screw with the silver wire welded on the head of it; E:Awake mouse head-fixed system, the red arrow indicates the motion detector, the green arrow indicates the micromanipulator supporting structure; F:The silver wire of electrode adaptor and the silver wire of spectacle screw were weld together so as to make the brain tissue ground, the white arrow indicates the welding point of these two silver wires, the red arrow indicates the body-holder, the green arrow indicates the head-plate holder, the blue arrow indicates the floating ball.

1.3.5 數據的采集與處理

包括對動作電位及局部場電位(local field potential, LFP)的采集與處理，每一個電極位點均可同時進行動作電位及LFP的采集。在電腦采集軟件Central上，采集條件設置為：動作電位的采集選取高通濾波250 Hz(HP 250 Hz)；LFP的采集選取低通濾波250 Hz(LP 250 Hz)，采樣率為1 kS/s(即 1 000 samples/s)。

動作電位的采集與處理：在下電極的過程中，如果發(fā)現(xiàn)信噪比比較高的動作電位，通過微調電極進入腦組織的深度找到其距神經元最近的位置，也即波幅最大的位置，來達到記到質量較高的Single Unit。

通過Offline Sorter軟件將Single Unit劃分出來。

LFP的采集與處理：筆者選取了以下4個震蕩成分來進行分析，分別為δ震蕩：1.5～4 Hz；θ震蕩：4～9 Hz；β震蕩：11～30 Hz；γ震蕩：30～55 Hz。

1.3.6 驗證電極記錄位置

所有用于實驗的小鼠在電生理記錄結束后均立刻用0.9%(質量分數)氯化鈉注射液及4%(質量分數)多聚甲醛溶液灌注取腦，30%(質量分數)蔗糖溶液過夜，待腦組織沉底后進行冰凍切片，通過熒光顯微鏡觀察電極在腦組織中經過的痕跡對電極記錄的位置進行驗證。

2 結果

2.1 動作電位的記錄與劃分

圖3為記錄到的一個單個的神經元的動作電位的集合，即一個Single Unit，采用Offline Sorter軟件中的3D Clusters 窗口(圖3A)將該Single Unit劃分出來。Offline Sorter軟件中的3D Clusters 窗口是Offline Sorter軟件自帶的一個劃分Single Unit的軟件，其采用主成分分析的聚類算法，在一個三維的坐標軸里劃分Single Unit，圖中的每一個點代表一個動作電位或一個噪音信號，在該圖中動作電位的諸點能夠聚成一個團并和背景噪音(Basic noise)信號聚成的團在空間上分離的較遠，代表的是一個信噪比較高的Single Unit。

圖3B為動作電位波形的疊加圖，其中黃色的波形疊加部分代表的是一個Single Unit，灰色的部分為背景噪音；圖3A和圖3B相對應，圖3A中每一個黃色的點代表一個動作電位，對應于圖3B中的一條黃色的波形，而灰色的點代表的是背景噪音，對應于圖3B中灰色的背景噪音部分。從3D Clusters圖(圖3A)上可以看到，該Single Unit和背景噪音在空間上有著較明顯的分離，從波形疊加圖(圖3B)上可以看到，該Single Unit和背景噪音在振幅上有著較大的差別；均說明了該Single Unit有著較高的信噪比，反映該Single Unit是一個質量比較高的Single Unit，幾乎沒有混入背景噪音等成分。

2.2 LFP的記錄并對其進行濾波分析

圖4為通過NeuroExplore軟件對記錄到的一個電極位點周圍的LFP及對其進行濾波后分出的4種震蕩成分。

圖3 單個神經元的劃分及其重疊的波形圖

A:isolation of a Single Unit by “3D Clusters” window in Offline Sorter software； B:The overlapped waveforms of the Single Unit, the single blue waveform (black arrow) among the yellow overlapped waveform is the average waveform of this Single Unit.

圖4 局部場電位和4種震蕩成分

From top to bottom respectively the waveform of LFP, Delta oscillation, Theta oscillation, Beta oscillation, and Gamma oscillation in 5 seconds；LFP：local field potential.

3 討論

神經元電信號的記錄方法主要有3種，即細胞外記錄、細胞內記錄以及膜片鉗記錄。細胞外記錄是指電極記錄位點位于神經元外側附近，不插入神經元內部，當神經元發(fā)放動作電位時，在電極處就會記錄到電位的變化。細胞內記錄是將電極插入神經元內，記錄神經元細胞膜內外側之間的電位差。膜片鉗則是對電極尖端吸附的細胞膜片段進行電生理記錄的方法，主要用于對離子通道的研究，但膜片鉗中的全細胞記錄則和細胞內記錄相類似。相比較而言，細胞外記錄的主要優(yōu)點是可以通過多通道記錄的方法同時記錄多個神經元的電活動，而細胞內記錄則一次只能記錄一個神經元。但是細胞外記錄不能記錄靜息電位，也無法進行細胞膜特性的研究，而這些則是細胞內記錄可以實現(xiàn)的[9]。

目前細胞外記錄的方法主要有急性細胞外記錄和慢性細胞外記錄，急性細胞外記錄主要通過硅電極來實現(xiàn)，可以實時操控電極的移動，可以在短時間內記錄到較大范圍腦區(qū)的電信號，但由于在記錄過程中要保持動物頭部的固定，因此以往的急性細胞外記錄主要是在麻醉動物上開展，但是對麻醉動物進行記錄的缺點是動物并非處于自然的生理活動狀態(tài)。近些年來發(fā)展起來的清醒動物頭部固定技術，則可以在動物清醒狀態(tài)下使其頭部得到固定，從而實現(xiàn)在清醒狀態(tài)下對腦部進行急性細胞外記錄。同時，動物的肢體活動并不受到限制，可以進行自由的活動。而慢性細胞外記錄則是要將電極預先植入腦組織內，手術后應使動物進行一段時間的恢復后再對電信號進行采集，記錄的位置比較固定，即電極植入之處，如果需要記錄更深位置腦區(qū)的神經元的電活動，則要通過特殊的裝置使電極往下深入一定的距離。

通過硅電極結合清醒動物頭部固定技術進行的急性細胞外記錄和通過植入式電極進行的慢性細胞外記錄方法的優(yōu)缺點比較如下：1)急性記錄實驗可以在一次的記錄過程中實現(xiàn)較大深度跨度空間的電信號采集，即可以在一次記錄過程中通過不斷地增加電極進入腦組織的深度而記錄到不同深度的多個神經元的動作電位。慢性實驗則僅能采集電極植入處的神經元的電信號，如果要采集其更深位置的神經元的電生理信號，則要通過特殊的裝置使電極往下深入一定的距離。因此相比較而言，急性記錄實驗在這方面更易于操作。2)急性記錄實驗方便尋找Single Unit，因其可以即時操控，當發(fā)現(xiàn)電極位點附近可能存在Single Unit時，可以通過不斷地在上下方向微調電極下入腦組織的深度來找到記錄該Single Unit的最佳位置，即信噪比最高的位置。3)急性記錄實驗可以實現(xiàn)一些植入式電極不易操控的行為學實驗。腦部植入電極的動物完全處于自由活動的狀態(tài)下，某些人為的行為學刺激不方便給予，而頭部固定動物，則方便給予某些特定的行為學操控，從而觀察特定腦區(qū)的神經元反應。4)急性記錄實驗的缺點在于雖然是在動物清醒的狀態(tài)下進行的記錄，但其所處的環(huán)境仍然是一個人為安排下的環(huán)境，動物并非完全處于自然放松的條件下，慢性電生理記錄則可以在動物完全處于自然放松的狀態(tài)下進行電信號的記錄。

前面介紹的對記錄到的電生理信號進行數據處理的方法只是一些基本的數據處理方法，包括對Single Unit的劃分和對LFP的濾波分析，Single Unit對研究具體的神經元的活動情況及神經環(huán)路有著很重要的意義及說服力[10]。但是在記錄Single Unit的過程中同時會記錄到電極點周圍的基礎噪音和別的神經元發(fā)放的動作電位，因此如果要記錄到質量比較高的Single Unit，就必須要保證該Single Unit有比較高的信噪比，即其波幅與背景噪音及別的神經元動作電位的波幅相差要比較大，這樣才能使其單獨被挑出而不混有背景噪音信號和來自于別的神經元發(fā)放的動作電位的信號[11]。LFP是一種重要的神經信號，其反映的是電極位點周圍所有神經元低頻電活動的總和[12-13]。LFP參與了多種腦功能活動，LFP的異常和多種疾病密切相關，在不同的生理狀態(tài)下同一腦區(qū)的LFP亦有差別[14-16]。LFP內部包含多種不同的震蕩成分,不同的震蕩成分亦和不同的行為、狀態(tài)等相關[17-19]。對LFP進行量化分析通常選取的指標是功率譜密度(power spectral densities, PSD)，通過分別計算每一種震蕩成分的功率值來對實驗數據進行分析和比較。可根據需要借助一些分析軟件如Offline Sorter、NeuroExplore、Matlab等對這些數據進行更深入的處理，比如放電頻率的分析、爆發(fā)式電活動的分析、LFP中各震蕩成分的功率譜密度值的計算、任務態(tài)相關的電活動的分析、動作電位和LFP之間的相關性的分析等。

通過在動物清醒的狀態(tài)下進行急性的神經元的動作電位及LFP的記錄，是研究神經元活動的一種基本的方法，對研究神經元的活動情況及神經環(huán)路等有著重要的作用。

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編輯 陳瑞芳

Acute neuronal extracellular recording of brain in awake mice

Wang Qiushi, Lei Huimeng*

(DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective Introduction to the method of acute extracellular recording of the brain of awake miceinvivoand some basic data analysis methods. Methods We applied multi-channel silicon electrode and awake mouse head-fixed system to perform acute electrophysiological recording in the awake mice. First, a head-plate adhered to the skull of the mouse, after surgery, one week’s rest was given, the mouse was then mounted to the head-fixed system by screwed together the head-plate of the mouse and the head-plate holder of the head-fixed system. The limbs of the mouse could freely move in a floating ball of the head-fixed system. Three consecutive days adaptive training were performed in order to habituate the mice of the recording background, then performed the acute electrophysiological recording by use of multi-channel electrode and multi-channel electrophysiological recording system, to record the spikes and local field potentials (LFP) in neurons of awake mice, and applied Offline Sorter software to isolate the Single Unit as well as NeuroExplore software to separated the Delta, Theta, Beta and Gamma oscillations from the LFP by means of filtering. Results We successfully recorded the spikes and LFPs in neurons of awake mice, and isolated the single units as well as separated the Delta, Theta, Beta and Gamma oscillations from LFP by the analysis software. Conclusion Application of acute extracellular electrophysiological recording methods can successfully record the spikes and LFPs in neurons of awake mice.

awake; acute;invivo; extracellular; electrophysiology

國家自然科學基金(31171051，31371108)，北京市自然科學基金(5132007，5112008)，北京市教委科技發(fā)展計劃(KM201110025001)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (31171051, 31371108), Natural Science Foundation of Beijing (5132007，5112008), the General Program of Science and Technology Development Project of Beijing Municipal Education Commission(KM201110025001).

時間：2017-04-13 19∶43

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1943.022.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.012]

R338

2016-12-06)

*Corresponding author， E-mail： leihm@ccmu.edu.cn