劉敬怡 盧 晶 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室,北京 100730)

·內(nèi)分泌與代謝病專題 ·

KCN基因?qū)π∈笾x的影響及其機制初探

劉敬怡1,2盧 晶1,2楊金奎1,2*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室,北京 100730)

目的 研究鉀離子電壓門控通道(potassium voltage-gated channel,KCN)基因?qū)π∈笾x的影響及其相關(guān)信號通路，為治療糖尿病的脂肪異常提供新的治療靶點。方法 采用KCN基因敲除的小鼠模型及對照C57BL/6野生小鼠動物模型，檢測三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等脂代謝相關(guān)指標。HE染色觀察小鼠肝臟組織脂肪變。Western blotting法測定小鼠肝臟組織腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果KCN基因敲除小鼠較野生型對照小鼠血清中三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)高密度脂蛋白明顯降低，肝臟HE染色顯示基因敲除小鼠肝臟內(nèi)脂滴的數(shù)目和體積均與野生型有明顯差異，Western blotting結(jié)果顯示KCN基因敲除小鼠肝臟組織中磷酸化蛋白激酶B(phosphate-protein kinase B，Phos-AKT)、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphate-acetyl CoA carboxylase，Phos-ACC)、phos-AMPK濃度均較正常對照組小鼠表達量降低，phos-ACCα水平較正常對照組小鼠明顯增高差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論KCN基因?qū)π∈笱x有保護作用，其作用機制與AMPK的脂肪酸氧化有關(guān)。

鉀離子電壓門控通道(potassium voltage-gated channel,KCN)；脂代謝；AMPK通絡(luò)

鉀離子電壓門控通道(potassium voltage-gated channel,KCN),是電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channel, Kv) 家族中的一員[1]。在人的心臟、腦和胰腺組織中有表達[2]。本課題組[3]前期研究表明，KCN通道基因在維持胰島β細胞的形態(tài)及功能方面具有重要作用，在C57BL/6小鼠上將KCN基因敲除后，小鼠會出現(xiàn)血糖增高、胰島素抵抗等糖代謝紊亂現(xiàn)象。

蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)-腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)-乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)信號通路為人和動物體內(nèi)控制脂肪酸氧化的重要途徑[4]。本課題組[3]前期已經(jīng)構(gòu)建KCN基因敲除小鼠動物模型。本研究觀察到KCN基因敲除糖尿病小鼠在14月齡時出現(xiàn)血糖和脂肪代謝異常，進一步探討其機制發(fā)現(xiàn)，KCN基因敲除小鼠體內(nèi)AMPK及其上游的AKT/PKB被抑制并促進其下游的ACCa磷酸化使其活性增高，脂肪酸氧化受到抑制，最終導致血脂代謝異常。本研究將有助于了解KCN基因在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其相關(guān)機制，KCN基因有望成為糖尿病血脂病變藥物作用的新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

14月齡雄性SPF級C57BL/6野生型小鼠及KCN+/-、KCN-/-小鼠(C57BL/6 background)，實驗動物許可證號：11400700146921，所有動物均符合實驗動物倫理法案。所有的小鼠均置于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫22 ℃～23 ℃，每天光照12 h，動物可自由攝食攝水。

1.2 主要試劑

血清三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein-cholesterol, HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 試劑盒(中生北控科技股份有限公司)，抗APMK抗體(美國Santa Cruz公司)、抗Phos-AMPK抗體(美國Santa Cruz公司)、抗ACCa抗體(美國Santa Cruz公司)、抗Phos-ACCa抗體(美國Santa Cruz公司)、抗AKT抗體(美國Santa Cruz公司)、抗Phos-AKT抗體(美國Santa Cruz公司)、β-actin(美國Cell Signaling公司)，酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1) 動物分組：14個月齡雄性C57BL/6小鼠(A組)、同月齡KCN+/-小鼠(B組)及同月齡KCN-/-小鼠(C組)，每組10只，普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后稱量體質(zhì)量并進行腹腔糖耐量試驗。

2)小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗：將3組小鼠過夜禁食14 h(但不禁水)，采用1%(質(zhì)量分數(shù))戊巴比妥鈉，45 mg/kg用量麻醉小鼠，尾靜脈取空腹血糖(0 min)后腹腔注射葡萄糖2 g/kg [20%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖注射液]，在注射葡萄糖后15、30、60及120 min時尾靜脈取血測血糖，血糖測定用強生公司One-Touch 血糖儀及配套試紙。

3)標本采集：腹腔葡萄糖耐量實驗5～7 d后處死動物。處死前禁食過夜12 h，內(nèi)眥取血，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清后分裝-80 ℃保存，待測血清中三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。麻醉后測量其體質(zhì)量，體長(鼻尖至肛門外沿的距離)。計算Lee’s指數(shù)，Lee’s指數(shù)=體質(zhì)量(g)1/3/體長(cm)×1 000。斷頸處死后，取睪周脂肪、肝臟、骨骼肌及胰腺組織，迅速稱質(zhì)量。并留取組織置入10%(體積分數(shù))中性甲醛溶液保存，用于制備石蠟切片。

4)血脂測定：采用Bio-Rad酶標儀測定濃度血漿三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇濃度。

5)肝臟組織HE染色：將肝臟組織常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片，烤片，72 ℃，100 min。石蠟切片脫蠟至水，自來水沖洗5 min，洗去乙醇，蘇木精侵染3 min，自來水沖洗1 min，鹽酸分化液2 s，自來水沖返藍5 min。伊紅侵染30 s，自來水沖30 s，80%(體積分數(shù))乙醇30 s，95%(體積分數(shù))乙醇、100%(體積分數(shù))乙醇各3 min。二甲苯透明1～2 h，中性樹膠封片后顯微鏡下拍照。

6)Western blotting法提取小鼠肝臟組織總蛋白:BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。取80 μg總蛋白進行10%(質(zhì)量分數(shù))SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)(200 mA，120 min)至硝酸纖維膜上。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)配制的5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，用封閉液將一抗按照一定比例稀釋(抗APMK抗體 1∶200、抗Phos-AMPK抗體 1∶200、抗ACCa抗體1∶200、抗Phos-ACC抗體1∶200、抗AKT抗體 1∶1 000、抗Phos-AKT抗體1∶1 000)，將膜與一抗4 ℃搖床孵育過夜，次日TBST洗膜3次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。同時以β-actin作為內(nèi)參，抗體稀釋比例為1∶1 000。TBST洗滌，滴加增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)發(fā)光液后用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)顯影成像，并用 Image J軟件對圖像進行灰度分析。分別計算出AMPK、phos-AMPK、phos-ACC、ACC和phos-AKT、AKT與內(nèi)參β-actin的吸光度積分值之比作為AMPK、phos-AMPK、ACC、phos-ACC、AKT和phos-AKT的相對含量值。

解決上述2個問題的辦法：①在焚燒爐超負荷運行時，如增加垃圾處理量、增加爐膛熱負荷，可適當回噴濃縮液，起到降低焚燒爐出口煙溫的作用。②協(xié)同處理沼氣回噴、污泥入爐。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1KCN基因敲除小鼠與C57BL/6野生型小鼠的一般特征比較

小鼠體質(zhì)量和身長及一般情況的觀察C組小鼠體質(zhì)量較A組有顯著增長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B組較A組有增長趨勢。B、C 2組的體長及Lee’s指數(shù)較A組有增高的趨勢(圖1)。

2.2KCN基因敲除小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗(introperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)異常

腹腔注射葡萄糖后15 min B、C 2組的血糖濃度明顯高于A組(F=52.89,P<0.05;F=2 173.89,P<0.01)、30 min B、C 2組的血糖水平明顯高于A組(F=128.2,P<0.05;F=221.1,P<0.05,)、60 min及120 minB、C 2組的血糖水平較A組有增高的趨勢。(P<0.05，圖2)。

圖1 小鼠體質(zhì)量、體長及Lee’s指數(shù)的比較

A:C57BL/6 group； B:KCN+/-group； C:KCN-/-group;*P<0.05vsgroup A;n=6;KCN: potassium voltage-gated channel.

圖2 小鼠腹腔糖耐量的比較

A:C57BL/6 group； B:KCN+/-group； C:KCN-/-group; At 15 minutes，the blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A (*P<0.05),n=6; The blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A (**P<0.01). At 30 minutes:the blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A (*P<0.05). The blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A.IPGTT:introperitoneal glucose tolerance test;KCN：potassium voltage-gated channel.

B、C 2組的TG和LDL-C較A組明顯增高(P<0.05)，而TC較A組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05, 圖3)。B、C組的HDL-C較A組明顯降低。

2.4 HE染色結(jié)果

KCN基因敲除小鼠肝臟有明顯的脂肪堆積，對照組A組小鼠肝臟色暗紅、質(zhì)地柔軟， B組、C組肝臟顏色灰黃，體積變大，表面有白色顆粒狀物。B、C兩組肝臟有明顯的肝臟脂肪變性，氣球樣變增多，有較多壞死灶，肝小葉內(nèi)明顯的炎性細胞浸潤(圖4)。

2.5 Western blotting檢測結(jié)果

AKT-AMPK-ACCa脂代謝通路激活,KCN基因敲除小鼠B、C兩組肝臟組織中phos-AKT，phos-ACCα，phos-AMPK水平均較正常對照組A組小鼠表達量降低(P<0.05，圖5)，ACCα水平較A組明顯增高KCN基因敲除小鼠的AMPK通路受到抑制(P<0.05，圖5)。

圖3 小鼠血脂比較

A:C57BL/6 group; B:KCN+/-group； C:KCN-/-group;KCN：potassium voltage-gated channel； TG: triglyceride; TC: total cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein cholesterol; HDL-C: high density lipoprotein cholesterol；*P<0.05，**P<0.01vsgroup A，n=10.

圖4 小鼠肝臟組織

3 討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及人們生活方式的改變，糖尿病已經(jīng)成為威脅我國人民健康的主要疾病，糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙[5]。糖尿病病人大多伴有肥胖和血脂異常，其主要原因是病人體內(nèi)脂肪組織大量蓄積。而脂肪細胞中脂肪酸的大量堆積可以導致胰島素抵抗，從而引發(fā)糖尿病[6]。

非酒精性脂肪肝、高三酰甘油血癥、血脂增高等脂代謝紊亂癥狀在代謝綜合征、肥胖及2型糖尿病病人中普遍存在，細胞中脂肪酸的大量堆積可以導致胰島素抵抗，進而引發(fā)糖耐量異常[7]。而機體中糖代謝與脂代謝有密不可分的關(guān)系，一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化[8]。AMPK是一個能量傳感器，參與調(diào)節(jié)包括胰島B細胞、肝臟、骨骼肌和脂肪在內(nèi)的多種外周組織的糖脂代謝過程[9]。AMPK調(diào)節(jié)脂代謝的信號通路是由AMPK、ACCa以及AKT組成[10]。活化后可通過減少葡萄糖利用、增加脂肪酸氧化而產(chǎn)生能量，同時抑制葡萄糖異生及脂肪酸合成而減少能量消耗以維持細胞能量代謝平衡[11-13]。

AMPK是細胞和機體能量代謝的主要調(diào)節(jié)器[14], 其活性主要受細胞中AMP/ATP比例的調(diào)節(jié)，控制能量的分解與合成代謝通路。ACC受AMPK負調(diào)控，是脂肪酸代謝的限速酶。ACC在體內(nèi)主要有ACCa 和ACCD兩種形式，由不同基因編碼，ACCa(265 000)主要在脂肪生成活躍的肝臟、脂肪組織和乳腺組織中表達，在脂類代謝過程中具有重要作用[15]。

已有結(jié)果表明在人類、小鼠、大鼠的胰島細胞中，KCN基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)胰島素分泌扮演了重要的角色[16]，但目前對于KCN基因是否影響糖尿病合并脂代謝紊亂及相關(guān)機制尚未有定論。本研究表明，KCN基因敲除糖尿病小鼠存在TG、TC和LDL增高，HDL降低等脂代謝紊亂癥狀。進一步研究其機制發(fā)現(xiàn),KCN基因敲除糖尿病小鼠的AMPK及其上游的AKT被抑制，并且其下游的ACCa磷酸化增強，脂肪酸氧化受到抑制。因此，本研究將有助于明確KCN通道基因在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制，并可能為糖尿病合并脂代謝異常的治療提供新策略和新的藥物靶點。

圖5 AKT、AMPK、ACC及其磷酸化水平

A:C57BL/6 group； B:KCN+/-group； C:KCN-/-group. The levels of phos-AKT and phos-AMPK in group B and C were significantly lower than thosein control group and phos-ACCα significantly increased,*P<0.05，**P<0.01vsgroup A；KCN：human ether-a-go-go related gene; AKT：protein kinase B; AMPK：adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase; ACC：acetyl CoA carboxylase.

本研究的后續(xù)工作將在細胞水平驗證AMPK對脂代謝的影響以及驗證AKT-AMPK-SREBP-1脂肪酸合成途徑是否與脂肪酸氧化途徑共同影響了KCN基因敲除糖尿病小鼠的脂代謝。下一步，將分別采用KCN基因激動劑和抑制劑進行體內(nèi)和體外實驗，檢測細胞和動物水平的三酰甘油等脂代謝相關(guān)指標，并從RNA水平和蛋白水平分別檢測AMPK相關(guān)通路蛋白標志物的表達情況，進一步明確KCN通道基因在糖尿病合并脂代謝紊亂發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及機制。

[1] Liman E R, Tytgat J, Hess P. Subunit stoichiometry of a mammalian K+channel determined by construction of multimeric cDNAs[J]. Neuron,1992, 9(5): 861-871.

[2] Hardy A B, Fox J E, Giglou P R, etal. Characterization of Erg K+ channels in α-and β-cells of mouse and human islets[J]. Biol Chem, 2009, 284(144): 30441-30452.

[3] Qiu H Y, Yuan S S, Yang F Y, et al. HERG protein plays a role in moxifloxacin-induced hypoglycemia [J]. J Diabetes Res, 2016,16(6): 298-304.

[4] Kudo N，Gillespie J G，Kung L, et al.C haracterization of 50AMP-activated protein kinase activity in the heart and its role in inhibiting acetyl-CoA carboxylase during reperfusion following ischemia [J].Biochim Biophys Acta, 1996, 1301(1-2): 67-75.

[5] Ye J M, Dzamko N, Cleasby M E, et al. Direct demonstration of lipid sequestration as a mechanism by which rosiglitazone prevents fatty-acid-induced insulin resistance in the rat: comparison with metformin [J]. Diabetologia, 2004, 47(7):1306-1313.

[6] Fryer L G, Carling D. AMP-activated protein kinase and the metabolic syndrome [J]. Biochem Soc Trans, 2005, 33(2):362-366.

[7] Gonzalez A A, Kumar R, Mulligan, et al. Metabolic adaptations to fasting and chronic caloric restriction in heart, muscle, and liver do not include changes in AMPK activity [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2004, 287(5): 1032-1037.

[8] Weickert M O, Pfeiffer A F. Signalling mechanisms linking hepatic glucose and lipid metabolism [J]. Diabetologia, 2006, 49 (8): 1732-1741.

[9] Hardie D G. The AMP-activated protein kinase pathway new players upstream and downstream [J]. J Cell Sci, 2004,117 (23):5479-5487.

[10]Jampvska A, Hatzinikolas G. AMPK and ACC phosphorylation: Effect of leptin， muscle fibre type and obesity [J].Mol Cell Endocrinol, 2008, 284(1-2): 1-10.

[11]解雪芬，朱毅. AMPK與代謝綜合征[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2006，26 (1): 27-34.

[12]王楚媛,孔令芳,侯永生,等.脂聯(lián)素與2型糖尿病進程的相關(guān)性[J]. 中國醫(yī)科大學學報,2014,(5) :429-431，436.

[13]馬娜敏,于世林,耿亞輝,等.北京溫泉社區(qū)中老年2型糖尿病人群伴發(fā)代謝綜合征的患病率及分布特征[J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2014,35 (1) :56-59.

[14]Viollet B, Foretz M, Guigas B, et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders [J]. J Physiol, 2006, 574 (1): 41-53.

[15]Bourbeau,Bartberger. Recent advances in the development of acetyl-CoA carboxylase (ACC) inhibitors for the treatment of metabolic disease [J]. J Med Chem, 2015, 58(2): 525-536.

[16]Muhlbauera E, Bazwinsky I, Wolgasta S, et al. Circadian changes of ether-a-go-go-related-gene (Erg) potassium channel transcripts in the rat pancreas and β-cell[J]. Cell Mol Life Sci, 2007, 64(6): 768-780.

編輯 慕 萌

Effect ofKCNpotassium channel gene on lipid metabolism in mice

Liu Jingyi1,2， Lu Jing1,2， Yang Jinkui1,2*

(1.DepartmentofEndocrinology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofDiabetesResearchandCare,Beijing100730,China)

Objective To study the effect of potassium channel gene (KCN) on lipid metabolism in mice and its related signal pathway and to provide a new therapeutic target for dyslipidemia in diabetes . Methods Our group constructedKCNchannel knock-out mouse model. In this study,KCNchannel knock-out mice and control C57BL/6 mice will be examined. We will detect total cholesterol, triglyceride, high-density lipoprotein and low-density lipoprotein in their serum, the protein level of adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase (AMPK) pathway from rat’s tissue was detected by western blot and the level of hepatic steatosis will be observed by HE staining.Results The serum levels of total cholesterol, triglyceride and low-density lipoprotein inKCNgene knock-out mouse were all significantly higher than those in controls, and high-density lipoprotein is lower than control (P<0.05). The results of Western blotting showed that phosphate-protein kinase B (Phos-AKT) and phos-AMPK levels in liver tissue ofKCNgene knockout mice were lower than those in normal control group, and phosphate-acetyl CoA carboxylase (phos-ACCα) level was significantly higher (P<0.05). ConclusionKCNchannel influences lipid metabolism in mice by classical fatty acid oxidation AMPK pathway.

potassium voltage-gated channel; lipid metabolism; adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase pathway

國家自然科學基金(81400824,81370946, 81300726)，北京市自然科學基金(7131005). This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81400824,81370946, 81300726)，Natural Science Foundation of Beijing (7131005).

時間：2017-04-13 20∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2008.060.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.004]

R589.2

2017-01-20)

*Corresponding author， E-mail：jinkui.yang@gmail.com