毛 艷，賀金華，蔡曉翠，鐵 偲，王新堂（.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所/天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 00050）

維藥神香草提取物體外抗炎作用的譜效關(guān)系研究Δ

毛 艷1＊，賀金華1#，蔡曉翠1，鐵 偲2，王新堂1（1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所/天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

目的：為闡明維藥神香草抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。方法：采用高效液相色譜法建立神香草8個(gè)不同極性提取物的指紋圖譜；以巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，考察神香草不同極性提取物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的抑制作用，比較其體外抗炎活性的差異性；采用灰色關(guān)聯(lián)分析法分析指紋圖譜共有峰的峰面積與抗炎活性的譜-效關(guān)系。結(jié)果：神香草8個(gè)不同極性提取物的指紋圖譜具有明顯的差異。體外抗炎結(jié)果提示，神香草30%乙醇提取物對(duì)體外炎癥因子的抑制作用最強(qiáng)。對(duì)其建立的HPLC指紋圖譜有共有峰14個(gè)，與體外炎癥因子的抑制作用關(guān)系密切的5個(gè)共有峰分別為8、6、5、10、13號(hào)，其中8號(hào)峰為迷迭香酸。結(jié)論：所建立的指紋圖譜及其與體外抗炎活性的譜效關(guān)系可為該藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一定參考。

神香草；不同極性提取物；抗炎活性；指紋圖譜；譜效關(guān)系；炎癥因子

神香草為唇形科植物硬尖神香草（Hyssopus cuspidatus Boriss.）的干燥地上部分，是維吾爾族民間習(xí)用藥材，其性質(zhì)干熱，有很強(qiáng)的香味，具有鎮(zhèn)咳、袪痰、平喘等作用[1]，在維吾爾醫(yī)學(xué)和民間用于治療氣管炎已有幾百年的歷史，療效確切。支氣管哮喘是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病。本研究擬采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)神香草不同極性提取物的體外抗炎活性，初步將高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜和體外藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，采用灰色關(guān)聯(lián)分析法對(duì)譜效關(guān)系進(jìn)行研究，考察神香草不同極性提取物HPLC指紋圖譜特征峰與其對(duì)體外炎癥因子抑制作用的相關(guān)性，從而闡明神香草抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步得到神香草抗哮喘有效部位，為后期深度開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000系列HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、四元梯度泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和4～40℃恒溫箱（美國(guó)Thermo Scientific Technologies公司）；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；BP211D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 對(duì)照品、試劑盒與試劑

迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-201203，純度：98.6%）、咖啡酸對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110885-200102）、木犀草素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：111520-200504）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三裂鼠尾草素對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15052611，純度：99.17%）；總一氧化氮（NO）、細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)：0000131725、0000125533）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國(guó)eBioscience公司，批號(hào)：E09479-1647、E09362-1655）；甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

野生神香草藥材于2014年8月采自新疆阿爾泰地區(qū)，由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為唇形科植物硬尖神香草（Hyssopus cuspidatus Boriss.）的干燥地上部分。

1.4 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%A；5～10 min，2%A→5%A；10～35 min，5% A→10%A；35～40 min，10%A；40～80 min，10%A→25%A；80～110 min，25%A→95%A；110～120 min，95%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和三裂鼠尾草素對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含咖啡酸0.165 mg、迷迭香酸0.263 mg、木犀草素0.112 mg、三裂鼠尾草素0.157 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 分別稱(chēng)取神香草藥材200 g，粉碎，分別加入12倍量體積的水、30%乙醇、50%乙醇和75%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，濾液減壓濃縮至干浸膏，備用，樣品編號(hào)為S1～S4。稱(chēng)取樣品S1適量，以水混合溶解后上大孔樹(shù)脂柱，收集50%乙醇洗脫部位，減壓濃縮至干浸膏，備用，樣品編號(hào)為S5。稱(chēng)取樣品S3適量，以水混合溶解后上聚酰胺樹(shù)脂柱，分別以水和30%、60%、80%乙醇溶液洗脫，收集30%、60%、80%乙醇洗脫部位，減壓濃縮至干浸膏，備用，樣品編號(hào)為S6～S8。取上述8種提取物樣品各0.1 g，精密稱(chēng)定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）15 min，放冷，搖勻，0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 取供試品溶液（S3），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.05%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.41%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性 取供試品（S3）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.11%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜4.19%（n＝6），表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求（RSD≤5%）。

2.3.3 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（S3），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在室溫下放置0、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在24 h內(nèi)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.17%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜3.33%（n＝6），表明供試品溶液室溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 共有峰和特征峰的標(biāo)定 將神香草8個(gè)不同極性提取物按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖及各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，建立神香草8個(gè)不同極性提取物的HPLC指紋圖譜。以混合對(duì)照品（咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和三裂鼠尾草素）溶液進(jìn)行定位，采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有峰，得共有峰14個(gè)。其中8號(hào)色譜峰（迷迭香酸）穩(wěn)定、重復(fù)性好、含量相對(duì)較高、特征性較強(qiáng)，因此以其為指紋圖譜的參照峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品和神香草S3樣品的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference and S3sample of H.cuspidatus

2.4.2 指紋圖譜的生成及相似度評(píng)價(jià) 將經(jīng)過(guò)積分處理的樣品色譜圖“AIA文件”導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004A版軟件中，以樣品S3的圖譜為參照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間窗為0.3 min。采用中位數(shù)法，按Mark峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，并進(jìn)行相似度分析。指紋圖譜見(jiàn)圖2，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 神香草不同極性提取物的指紋圖譜Fig 2 Fingerprint of extracts with different polarities from H.cuspidatus

表1結(jié)果顯示，8個(gè)樣品相似度較低，提示各部位成分差異較大，可以為神香草抗炎譜效關(guān)系的研究提供數(shù)據(jù)支持。

2.5 神香草不同極性提取物體外抗炎活性考察

2.5.1 細(xì)胞處理 參考文獻(xiàn)[2-5]方法，將RAW264.7細(xì)胞在37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取細(xì)胞懸液，以180 μL/孔（含細(xì)胞3×104個(gè)/孔）接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，孵育18～24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 神香草不同極性提取物指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Results of similarity evaluation of the fingerprint of extracts with different polarities from H.cuspidatus

2.5.2 細(xì)胞分組與加藥 將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分5組，即空白對(duì)照組：以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，終體積為200 μL；脂多糖（LPS）對(duì)照組：加入10 μL LPS，用培養(yǎng)基補(bǔ)體積至200 μL；樣品組：每孔分別加入樣品S1～S8溶液10 μL、LPS 10 μL，用培養(yǎng)基補(bǔ)體積至200 μL，設(shè)提取物質(zhì)量濃度梯度為50、10、2、0.4 μg/mL，與細(xì)胞共同孵育24 h。

2.5.3 指標(biāo)檢測(cè) 孵育24 h后，分別檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、TNF-α和IL-6水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（考慮到試驗(yàn)成本，試驗(yàn)中先采用細(xì)胞存活率和NO水平為指標(biāo)優(yōu)選樣品，然后以TNF-α、IL-6水平為指標(biāo)繼續(xù)篩選神香草有效部位），測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 神香草不同極性提取物體外抗炎活性測(cè)定結(jié)果Tab 2 Determination results of anti-inflammation activity in vitro of extracts with different polarities from H.cuspidatus

表2結(jié)果顯示，樣品S2～S4均體現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，樣品S2～S7均可不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞NO的釋放。其中，樣品S6和S7的抑制效果最為明顯，又因其無(wú)細(xì)胞毒性，因此篩選樣品S6和S7進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。結(jié)果表明，樣品S6和S7均能抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞TNF-α、IL-6的釋放，對(duì)炎癥疾病具有潛在的治療作用。

2.6 神香草不同極性提取物指紋圖譜特征與其抗炎作用的灰色關(guān)聯(lián)分析

采用灰色關(guān)聯(lián)分析法[6]對(duì)神香草不同極性提取物的指紋特征峰與與體外抗炎活性的相關(guān)性進(jìn)行分析，根據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，確定各成分對(duì)體外抗炎活性貢獻(xiàn)的大小順序，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 神香草不同極性提取物指紋特征峰與體外抗炎活性的關(guān)聯(lián)度測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination results of correlation of characteristic charomatographic peaks of extracts with different polarities from H.cuspidatus and anti-inflammation activity in vitro

表3結(jié)果顯示，14個(gè)共有峰所代表的化學(xué)成分與體外抗炎活性的關(guān)聯(lián)度均大于0.55，提示這14個(gè)峰均與藥效有關(guān)。根據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，確定各共有特征峰對(duì)體外炎癥因子NO抑制作用貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?＞6＞9＞12＞5＞7＞4＞13＞3＞10＞11＞14＞2＞1；對(duì)TNF-α抑制作用貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?＞10＞12＞6＞7＞8＞13＞3＞1＞9＞4＞2＞11＞14；對(duì)IL-6抑制作用貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?3＞8＞12＞5＞1＞2＞6＞9＞7＞10＞3＞11＞4＞14?？梢?jiàn)，神香草提取物是通過(guò)其內(nèi)部“有效物質(zhì)群”的協(xié)同作用達(dá)到體外抗炎作用的。

3 討論

灰色關(guān)聯(lián)分析來(lái)自灰色系統(tǒng)理論，其基本思想是一種相對(duì)性的排序分析，根據(jù)序列曲線(xiàn)幾何形狀的相似程度來(lái)判斷其聯(lián)系是否緊密。如果一組幾何曲線(xiàn)形狀越相似則關(guān)聯(lián)度越大，反之則越小[7-8]。由此從所考察的復(fù)雜系統(tǒng)中找出主次因素，為系統(tǒng)綜合決策及提高綜合效益提供信息。

本研究通過(guò)尋找“有效物質(zhì)群”的指紋特征與體外抗炎作用之間的聯(lián)系開(kāi)展研究，在神香草不同極性提取物指紋圖譜和藥效研究的基礎(chǔ)上，獲得了神香草不同溶劑提取物指紋圖譜14個(gè)特征峰峰面積和體外炎癥因子NO、TNF-α和IL-6水平的量化數(shù)據(jù)。采用灰色關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，確定了指紋圖譜特征峰所代表的化學(xué)成分對(duì)藥效貢獻(xiàn)的大小，繼而根據(jù)神香草不同溶劑提取物指紋圖譜各特征峰對(duì)體外炎癥因子NO、TNF-α和IL-6水平的抑制作用貢獻(xiàn)的大小程度來(lái)推測(cè)其體外抗炎作用。結(jié)果表明，指紋圖譜中14個(gè)共有峰所代表的化學(xué)成分與體外抗炎活性的關(guān)聯(lián)度均大于0.55，提示這14個(gè)峰均與藥效有關(guān)，證明了神香草的體外抗炎作用是多成分共同起效的結(jié)果。從整體結(jié)果來(lái)看，指紋圖譜共有峰中除了14號(hào)峰與對(duì)TNF-α的抑制作用關(guān)聯(lián)度較小外，其余各共有峰的關(guān)聯(lián)度均大于0.9。雖然樣品S7作用后細(xì)胞存活率較高、抑制體外炎癥因子的作用較好，但是其指紋圖譜中除14號(hào)峰外其余各峰峰面積均小。因此，本課題組將會(huì)選用樣品S6進(jìn)行后續(xù)的藥效學(xué)研究。

綜上所述，本研究初步探索了神香草8個(gè)不同提取物的指紋圖譜與體外抗炎活性的關(guān)系，為研究神香草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。后期本課題組將在此基礎(chǔ)上研究關(guān)聯(lián)度較大成分與體外抗炎活性藥效的具體關(guān)系，確定藥效較強(qiáng)組分的結(jié)構(gòu)，為制定科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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Study on the Spectrum-effect Relationship of Anti-inflammation Effect in vitro of Extracts from Uygur Medicine Hyssopus cuspidatus

MAO Yan1，HE Jinhua1，CAI Xiaocui1，TIE Cai2，WANG Xintang1（1.Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，China；2.Institute of Materia Medica，Peking Union Medical College/State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE：To provide reference for clarifying the pharmacodynamic material basis of anti-inflammation effect of Uygur medicine Hyssopus cuspidatus.METHODS：HPLC was conducted to establish the fingerprint of 8 extracts with different polarities.Using macrophage RAW264.7 as object，the inhibitory effect of extracts with different polarities on inflammatory factor nitric oxide（NO），TNF-α and IL-6 in supernatant of cell culture medium was detected，the differences of anti-inflammatory activity in vitro were compared.Grey correlation analysis method was used to analyze the spectrum-effect relationship of peak area of common peaks and anti-inflammation activity.RESULTS：The fingerprint of 8 extracts with different polarities showed obvious differences.Anti-inflammation in vitro results suggested that 30%ethanol extract had the strongest inhibitory effect on inflammatory cytokines in vitro.There were 14 common peaks in the established HPLC fingerprints，the 5 common peaks that was closely related tothe inhibitory effect of inflammatory factors in vitro were peak 8，6，5，10，13，respectively；peak 8 was rosmarinic acid.CONCLUSIONS：The established fingerprint and its spectrum-effect relationship with anti-inflammation activity in vitro can provide certain reference for its pharmacodynanic material basis study.

Hyssopus cuspidatus；Extracts with different polarities；Anti-inflammation activity；Fingerprint；Spectrum-effect relationship；Inflammatory factor

R95

A

1001-0408（2017）10-1364-04

2016-09-18

2016-11-24）

（編輯：林 靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81560644）；新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（No. KY2014062）；新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No.2016-03-03）

＊副研究員，碩士。研究方向：藥物分析。電話(huà)：0991-2326572。E-mail：maoyan7529@163.com

#通信作者：研究員，碩士。研究方向：藥物分析。電話(huà)：0991-2326572。E-mail：hejh1216@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.18