呂秀梅,王 靜,趙可惠,張 靜,賴先榮,范 剛,張 藝,更藏加(成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院,成都611137)
均勻設(shè)計法優(yōu)化藏藥多血康提取工藝Δ
呂秀梅*,王 靜,趙可惠,張 靜#,賴先榮,范 剛,張 藝,更藏加(成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院,成都611137)
目的:優(yōu)化多血康的提取工藝。方法:以紅景天苷、沒食子酸含量及出膏率的綜合評分為指標,采用U6(63)均勻設(shè)計法優(yōu)化多血康提取工藝中的料液比、乙醇體積分數(shù)及提取時間,再優(yōu)化提取次數(shù),并進行驗證試驗。結(jié)果:最優(yōu)提取工藝為采用50%乙醇,料液比1∶14,浸泡1.5 h,回流提取1 h并重復(fù)2次;3次試驗平均出膏率為50.18%,紅景天苷和沒食子酸含量分別為1.82、16.54 mg/g(RSD≤0.84%,n=3)。結(jié)論:優(yōu)化的多血康提取工藝合理、簡單、可行。
藏藥;多血康;均勻設(shè)計法;紅景天苷;沒食子酸;含量;提取;工藝優(yōu)化
高原紅細胞增多癥,藏醫(yī)稱“多血癥”,系由高原低氧引起的紅細胞增多、血液黏稠的一種常見高原疾病,并可導致較嚴重的全身反應(yīng)或全身系統(tǒng)性疾病,甚至死亡[1]。我國青藏高原人群中多血癥患病率約為2.5%[2],已成為嚴重威脅高原人群健康的常見慢性疾病之一。此病多見于高原移居人群,少見于高原世居人群,具有發(fā)病慢、早期病癥不明顯、病情進展緩慢的特點[3]。多血康是著名藏醫(yī)大師措如·才郎以藏醫(yī)理論為指導,經(jīng)多年臨床實踐研制的治療多血癥療效確切的經(jīng)驗方,其具有活血散瘀、降低血壓等功效[4]。該方由紅景天、余甘子、沙棘、干姜等4味藥材組成,具有提高機體缺氧耐受力、緩解疲勞等功效[5]。本課題組在前期研究中,分析了多血康治療多血癥的分子機制,明確了其入血成分主要來源于紅景天、余甘子、沙棘,并建立了同時測定其中紅景天苷等6個成分的高效液相色譜(HPLC)法[4,5-7]。本試驗采用均勻設(shè)計法,以紅景天苷、沒食子酸含量及出膏率為指標,以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間為因素,優(yōu)化提取工藝,為其生產(chǎn)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1.1 儀器
1260型HPLC儀(美國安捷倫公司);BSA124S型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);SB5200D超聲清洗儀(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);TDZ5-WS臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。
1.2 藥材、藥品與試劑
紅景天藥材于2016年1月21日購自四川省阿壩州藏醫(yī)院,余甘子、干姜藥材于2016年3月18日購自成都市荷花池藥材市場,沙棘藥材于2015年11月13日采自陜西省延安市志丹縣旦八鄉(xiāng)。原藥材均由成都中醫(yī)藥大學張藝研究員鑒定,分別為大花紅景天[Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms)H.Ohba]的干燥根和根莖、余甘子(Phyllanthus emblica L.)的干燥成熟果實、中國沙棘(H.rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi.)的干燥成熟果實、干姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根莖;紅景天苷對照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號:Must-15082610,純度:98.96%);沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110831-201204,純度:89.9%);甲醇、磷酸為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。
2.1 吸水率考察
為考察藥材吸水性對提取條件的影響,先進行吸水率試驗。按處方比例精密稱取該混合藥材45 g,加入4倍量60%乙醇溶液,每隔30 min觀察1次浸泡透心情況直至1.5 h。待藥材全部浸透后濾出未被藥材吸收的溶液,計算吸水率(藥材吸水體積/藥材加入量)[8],結(jié)果吸水率約為1.8倍。
2.2 出膏率的測定
參照2015年版《中國藥典》(四部)通則2201方法[9]測定。精密量取多血康提取液25 mL,置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中,水浴揮干后,于105℃干燥3 h,置于干燥器中冷卻30 min,迅速稱定質(zhì)量。以干燥品計算供試品中浸出物的含量(%),并計算出膏率(浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%)。
2.3 紅景天苷、沒食子酸的含量測定
2.3.1 色譜條件確立 色譜柱:WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相Ⅰ:甲醇-水(15∶85),檢測波長:275 nm[10];流動相Ⅱ:甲醇-0.2%磷酸溶液(5∶95),檢測波長:273 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30℃。取“2.3.2”和“2.3.3”項下溶液進樣測定,色譜圖見圖1。
圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms
2.3.2 對照品溶液的制備 參照2015年版《中國藥典》(一部)紅景天和余甘子項下方法制備紅景天苷、沒食子酸對照品溶液[10]。(1)對照品溶液Ⅰ:取紅景天苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每l mL含0.2 mg的溶液,即得。(2)對照品溶液Ⅱ:取沒食子酸對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成每l mL含0.734 mg的溶液,即得。
2.3.3 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取多血康各組成藥材45 g,經(jīng)提取后將提取液濾過,回收溶劑,濃縮、定容,制得多血康貯備液。參照2015年版《中國藥典》(一部)紅景天和余甘子含量測定項下方法[10]制備供試品溶液。(1)供試品溶液Ⅰ:精密量取貯備液20 mL,置于錐形瓶中,水浴揮干后,精密加入甲醇10 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(功率:250 W,頻率:400 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。(2)供試品溶液Ⅱ:精密量取貯備液5 mL,置于錐形瓶中,水浴揮干后,精密加入50%甲醇10 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(功率:250W,頻率:400 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3.4 標準曲線的繪制及方法學考察 精密吸取紅景天苷、沒食子酸對照品溶液各5、8、10、12、15、20μL進樣,按流動相Ⅰ、流動相Ⅱ分別進行洗脫,記錄各峰面積。以進樣量(x,μg)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行回歸處理,建立紅景天苷、沒食子酸的標準曲線,結(jié)果分別為y=311 112x+9.444(r=0.999 2)、y=2×106x+ 300.78(r=0.999 9),線性范圍分別為0.508~2.032、3.67~14.68μg。按相關(guān)方法學考察要求進行考察,結(jié)果均符合要求。
2.4 均勻設(shè)計法優(yōu)化多血康的提取工藝
2.4.1 因素與水平的設(shè)計 根據(jù)文獻[11-13]和前期試驗結(jié)果,本研究以料液比(X1)、乙醇體積分數(shù)(X2)、提取時間(X3)為考察因素進行均勻設(shè)計。采用均勻設(shè)計表U6(63)[14],以出膏率(Y1)、紅景天苷含量(Y2)、沒食子酸含量(Y3)為指標,并分別賦予權(quán)重系數(shù)為0.1、0.7、0.2,計算綜合評分值(Y),Yi=(X1i/X1max×0.1+X2i/X2max×0.7+X3i/X3max× 0.2)×100][15],對多血康提取工藝進行優(yōu)化。因素與水平見表1。
表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels
2.4.2 均勻設(shè)計試驗結(jié)果 每個試驗號均按處方比例稱取該混合藥材45 g,根據(jù)均勻設(shè)計安排各因素和水平進行試驗,測定Y1、Y2、Y3,計算Y,詳見表2。
表2 試驗安排與結(jié)果Tab 2 Test arrangement and result
5 6 1 4 1 6 5 0 7 0 0 . 5 2 4 1 . 3 4 4 3 . 4 6 1 . 5 4 1 . 4 9 1 3 . 9 6 1 5 . 0 5 9 8 . 0 6 9 7 . 8 2
2.4.3 結(jié)果處理 采用DPS 7.05軟件對試驗結(jié)果進行逐步回歸分析,得到優(yōu)化方程,見表3。
表3 回歸分析結(jié)果Tab 3 Results of regression analysis
根據(jù)各回歸方程的回歸系數(shù)R、F及P結(jié)果,結(jié)合試驗原理和經(jīng)驗可知,Y1、Y2及Y3均只與因素X1有顯著相關(guān)性(P<0.05),因素X2和X3對3個指標均無顯著性影響(P>0.05),與綜合評分的回歸分析結(jié)果一致。結(jié)合“2.4.2”項下試驗結(jié)果,第5號試驗結(jié)果中Y2和Y均為6次試驗中最高者。因此,在第5號提取工藝的基礎(chǔ)上適當增加提取時間(X3),選取14倍50%乙醇回流提取1 h作為優(yōu)化工藝。該工藝下預(yù)測紅景天苷含量為1.48 mg/g、沒食子酸含量為13.85 mg/g、出膏率為41.25%。
2.4.4 優(yōu)化工藝的驗證試驗 按照處方比例稱取多血康45 g,共3份,以14倍50%乙醇回流提取1 h,測定并計算各指標。結(jié)果3次試驗檢測指標均高于預(yù)測值,提示該工藝穩(wěn)定、可行,詳見表4。
表4 驗證試驗結(jié)果(n=3)Tab 4 Results of the verification test(n=3)
2.5 提取次數(shù)考察
按處方比例稱取藥材45 g,按上述最優(yōu)工藝提取3次,每次單獨取樣測定,重復(fù)3次。計算紅景天苷轉(zhuǎn)移率[(提取物的量×提取物中紅景天苷含量)/(處方中紅景天的投料量×紅景天藥材中紅景天苷含量)×100%][10]。結(jié)果第3次提取時紅景天苷轉(zhuǎn)移率占總轉(zhuǎn)移率的1.90%、1.84%、2.00%,低于5%。因此,對多血康進行2次回流提取即可,詳見表5。
表5 提取次數(shù)考察結(jié)果Tab 5 Results of extraction times test
2.6 放大驗證試驗
根據(jù)上述試驗結(jié)果,按處方比例稱取藥材180 g,以上述優(yōu)化工藝回流提取2次,進行3次平行驗證試驗。結(jié)果3次試驗Y1、Y2、Y3平均值分別為50.18%、1.82 mg/g、16.54 mg/g(RSD≤0.84%,n=3),紅景天苷轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)接近,表明該提取工藝穩(wěn)定、可行,詳見表6。
表6 放大驗證試驗結(jié)果(n=3)Tab 6 Results of the amplification verification test(n=3)
多血康作為藏醫(yī)治療多血癥的臨床常用方,為發(fā)揮其治療效果,研究其提取工藝具有重要意義。由于復(fù)方制劑成分復(fù)雜,一般需多種有效成分共同作用才能達到療效的有效發(fā)揮,以單一成分作為提取工藝優(yōu)化的指標,不免存在片面性。多血康以余甘子為君藥,紅景天為臣藥,因此,本研究選取紅景天、余甘子在《中國藥典》中的規(guī)定成分即紅景天苷與沒食子酸的含量共同作為提取工藝考察指標。紅景天苷作為指標性有效成分,其含量是首要參考指標,故其權(quán)重設(shè)置最高。
均勻設(shè)計法是一種用少量試驗處理多因素多水平的試驗設(shè)計方法,可減少試驗意外并便于統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理,具有操作方便且可行性強的特點,因而常運用于制劑的提取工藝、成型工藝等的研究[16]。本研究在前期預(yù)試驗中,比較了多血康水提取和70%乙醇提取對紅景天苷的影響,結(jié)果顯示70%乙醇提取的紅景天苷轉(zhuǎn)移率為67.11%,高于水提取的紅景天苷轉(zhuǎn)移率63.74%。因此,后期則只選擇了乙醇體積分數(shù)作為考察因素之一。由于提取次數(shù)不僅影響提取時間,而且影響料液比。提取1次的提取時間、料液比與提取2次的提取時間、料液比對試驗結(jié)果的影響是不一樣的,所以本研究將提取次數(shù)進行單獨考察。
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Optimization of Extraction Technology for Tibetan Medicine Duoxuekang by Uniform Design
LYU Xiumei,WANG Jing,ZHAO Kehui,ZHANG Jing,LAI Xianrong,F(xiàn)AN Gang,ZHANG Yi,GENG Zangjia(College of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)
OBJECTIVE:To optimize the extraction technology of Duoxuekang.METHODS:Using comprehensive score of salidroside,gallic acid content and extraction yield as indexes,U6(63)uniform design was designed to optimize the liquid-solid ratio,ethanol volume fraction and extraction time of Duoxuekang,then optimize extraction times,and verification test was conducted.RESULTS:The optimal extraction technology was as follows as 50%ethanol,liquid-solid ratio of 1∶14,soaking time of 1.5 h,reflux extraction for 1 h and repeated twice;the average extraction yield in 3 tests was 50.18%,contents of salidroside and gallic acid were 1.82 mg/g,16.54 mg/g(RSD≤0.84%,n=3).CONCLUSIONS:The optimized extraction technology for Duoxuekang is reasonable,simple and feasible.
Tibetan medicine;Duoxuekang;Uniform design;Salidroside;Gallic acid;Content;Extraction;Technology optimization
R284.2
A
1001-0408(2017)10-1361-04
2016-09-18
2016-11-03)
(編輯:劉 萍)
國家自然科學基金資助項目(No.81203000);公益性行業(yè)科研專項(No.201507002);成都中醫(yī)藥大學科技發(fā)展基金(No. CGPY1503)
*碩士研究生。研究方向:中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail:lvxiuml@163.com
#通信作者:副教授,碩士生導師,博士。研究方向:中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail:zhangjingtcm@cdutcm.cedu.cn
DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.17