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        均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化藏藥多血康提取工藝Δ

        2017-04-19 01:17:28呂秀梅趙可惠賴先榮更藏加成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院成都611137
        中國藥房 2017年10期
        關(guān)鍵詞:甘子紅景天藥材

        呂秀梅,王 靜,趙可惠,張 靜,賴先榮,范 剛,張 藝,更藏加(成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院,成都611137)

        均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化藏藥多血康提取工藝Δ

        呂秀梅*,王 靜,趙可惠,張 靜#,賴先榮,范 剛,張 藝,更藏加(成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院,成都611137)

        目的:優(yōu)化多血康的提取工藝。方法:以紅景天苷、沒食子酸含量及出膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo),采用U6(63)均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化多血康提取工藝中的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時(shí)間,再優(yōu)化提取次數(shù),并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果:最優(yōu)提取工藝為采用50%乙醇,料液比1∶14,浸泡1.5 h,回流提取1 h并重復(fù)2次;3次試驗(yàn)平均出膏率為50.18%,紅景天苷和沒食子酸含量分別為1.82、16.54 mg/g(RSD≤0.84%,n=3)。結(jié)論:優(yōu)化的多血康提取工藝合理、簡單、可行。

        藏藥;多血康;均勻設(shè)計(jì)法;紅景天苷;沒食子酸;含量;提??;工藝優(yōu)化

        高原紅細(xì)胞增多癥,藏醫(yī)稱“多血癥”,系由高原低氧引起的紅細(xì)胞增多、血液黏稠的一種常見高原疾病,并可導(dǎo)致較嚴(yán)重的全身反應(yīng)或全身系統(tǒng)性疾病,甚至死亡[1]。我國青藏高原人群中多血癥患病率約為2.5%[2],已成為嚴(yán)重威脅高原人群健康的常見慢性疾病之一。此病多見于高原移居人群,少見于高原世居人群,具有發(fā)病慢、早期病癥不明顯、病情進(jìn)展緩慢的特點(diǎn)[3]。多血康是著名藏醫(yī)大師措如·才郎以藏醫(yī)理論為指導(dǎo),經(jīng)多年臨床實(shí)踐研制的治療多血癥療效確切的經(jīng)驗(yàn)方,其具有活血散瘀、降低血壓等功效[4]。該方由紅景天、余甘子、沙棘、干姜等4味藥材組成,具有提高機(jī)體缺氧耐受力、緩解疲勞等功效[5]。本課題組在前期研究中,分析了多血康治療多血癥的分子機(jī)制,明確了其入血成分主要來源于紅景天、余甘子、沙棘,并建立了同時(shí)測定其中紅景天苷等6個(gè)成分的高效液相色譜(HPLC)法[4,5-7]。本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法,以紅景天苷、沒食子酸含量及出膏率為指標(biāo),以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間為因素,優(yōu)化提取工藝,為其生產(chǎn)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料

        1.1 儀器

        1260型HPLC儀(美國安捷倫公司);BSA124S型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);SB5200D超聲清洗儀(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

        1.2 藥材、藥品與試劑

        紅景天藥材于2016年1月21日購自四川省阿壩州藏醫(yī)院,余甘子、干姜藥材于2016年3月18日購自成都市荷花池藥材市場,沙棘藥材于2015年11月13日采自陜西省延安市志丹縣旦八鄉(xiāng)。原藥材均由成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定,分別為大花紅景天[Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms)H.Ohba]的干燥根和根莖、余甘子(Phyllanthus emblica L.)的干燥成熟果實(shí)、中國沙棘(H.rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi.)的干燥成熟果實(shí)、干姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根莖;紅景天苷對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào):Must-15082610,純度:98.96%);沒食子酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110831-201204,純度:89.9%);甲醇、磷酸為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 吸水率考察

        為考察藥材吸水性對(duì)提取條件的影響,先進(jìn)行吸水率試驗(yàn)。按處方比例精密稱取該混合藥材45 g,加入4倍量60%乙醇溶液,每隔30 min觀察1次浸泡透心情況直至1.5 h。待藥材全部浸透后濾出未被藥材吸收的溶液,計(jì)算吸水率(藥材吸水體積/藥材加入量)[8],結(jié)果吸水率約為1.8倍。

        2.2 出膏率的測定

        參照2015年版《中國藥典》(四部)通則2201方法[9]測定。精密量取多血康提取液25 mL,置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中,水浴揮干后,于105℃干燥3 h,置于干燥器中冷卻30 min,迅速稱定質(zhì)量。以干燥品計(jì)算供試品中浸出物的含量(%),并計(jì)算出膏率(浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%)。

        2.3 紅景天苷、沒食子酸的含量測定

        2.3.1 色譜條件確立 色譜柱:WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相Ⅰ:甲醇-水(15∶85),檢測波長:275 nm[10];流動(dòng)相Ⅱ:甲醇-0.2%磷酸溶液(5∶95),檢測波長:273 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30℃。取“2.3.2”和“2.3.3”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣測定,色譜圖見圖1。

        圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

        2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 參照2015年版《中國藥典》(一部)紅景天和余甘子項(xiàng)下方法制備紅景天苷、沒食子酸對(duì)照品溶液[10]。(1)對(duì)照品溶液Ⅰ:取紅景天苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每l mL含0.2 mg的溶液,即得。(2)對(duì)照品溶液Ⅱ:取沒食子酸對(duì)照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成每l mL含0.734 mg的溶液,即得。

        2.3.3 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取多血康各組成藥材45 g,經(jīng)提取后將提取液濾過,回收溶劑,濃縮、定容,制得多血康貯備液。參照2015年版《中國藥典》(一部)紅景天和余甘子含量測定項(xiàng)下方法[10]制備供試品溶液。(1)供試品溶液Ⅰ:精密量取貯備液20 mL,置于錐形瓶中,水浴揮干后,精密加入甲醇10 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(功率:250 W,頻率:400 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。(2)供試品溶液Ⅱ:精密量取貯備液5 mL,置于錐形瓶中,水浴揮干后,精密加入50%甲醇10 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(功率:250W,頻率:400 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察 精密吸取紅景天苷、沒食子酸對(duì)照品溶液各5、8、10、12、15、20μL進(jìn)樣,按流動(dòng)相Ⅰ、流動(dòng)相Ⅱ分別進(jìn)行洗脫,記錄各峰面積。以進(jìn)樣量(x,μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理,建立紅景天苷、沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果分別為y=311 112x+9.444(r=0.999 2)、y=2×106x+ 300.78(r=0.999 9),線性范圍分別為0.508~2.032、3.67~14.68μg。按相關(guān)方法學(xué)考察要求進(jìn)行考察,結(jié)果均符合要求。

        2.4 均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化多血康的提取工藝

        2.4.1 因素與水平的設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]和前期試驗(yàn)結(jié)果,本研究以料液比(X1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)、提取時(shí)間(X3)為考察因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)。采用均勻設(shè)計(jì)表U6(63)[14],以出膏率(Y1)、紅景天苷含量(Y2)、沒食子酸含量(Y3)為指標(biāo),并分別賦予權(quán)重系數(shù)為0.1、0.7、0.2,計(jì)算綜合評(píng)分值(Y),Yi=(X1i/X1max×0.1+X2i/X2max×0.7+X3i/X3max× 0.2)×100][15],對(duì)多血康提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平見表1。

        表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

        2.4.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 每個(gè)試驗(yàn)號(hào)均按處方比例稱取該混合藥材45 g,根據(jù)均勻設(shè)計(jì)安排各因素和水平進(jìn)行試驗(yàn),測定Y1、Y2、Y3,計(jì)算Y,詳見表2。

        表2 試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 2 Test arrangement and result

        5 6 1 4 1 6 5 0 7 0 0 . 5 2 4 1 . 3 4 4 3 . 4 6 1 . 5 4 1 . 4 9 1 3 . 9 6 1 5 . 0 5 9 8 . 0 6 9 7 . 8 2

        2.4.3 結(jié)果處理 采用DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析,得到優(yōu)化方程,見表3。

        表3 回歸分析結(jié)果Tab 3 Results of regression analysis

        根據(jù)各回歸方程的回歸系數(shù)R、F及P結(jié)果,結(jié)合試驗(yàn)原理和經(jīng)驗(yàn)可知,Y1、Y2及Y3均只與因素X1有顯著相關(guān)性(P<0.05),因素X2和X3對(duì)3個(gè)指標(biāo)均無顯著性影響(P>0.05),與綜合評(píng)分的回歸分析結(jié)果一致。結(jié)合“2.4.2”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果,第5號(hào)試驗(yàn)結(jié)果中Y2和Y均為6次試驗(yàn)中最高者。因此,在第5號(hào)提取工藝的基礎(chǔ)上適當(dāng)增加提取時(shí)間(X3),選取14倍50%乙醇回流提取1 h作為優(yōu)化工藝。該工藝下預(yù)測紅景天苷含量為1.48 mg/g、沒食子酸含量為13.85 mg/g、出膏率為41.25%。

        2.4.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 按照處方比例稱取多血康45 g,共3份,以14倍50%乙醇回流提取1 h,測定并計(jì)算各指標(biāo)。結(jié)果3次試驗(yàn)檢測指標(biāo)均高于預(yù)測值,提示該工藝穩(wěn)定、可行,詳見表4。

        表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 4 Results of the verification test(n=3)

        2.5 提取次數(shù)考察

        按處方比例稱取藥材45 g,按上述最優(yōu)工藝提取3次,每次單獨(dú)取樣測定,重復(fù)3次。計(jì)算紅景天苷轉(zhuǎn)移率[(提取物的量×提取物中紅景天苷含量)/(處方中紅景天的投料量×紅景天藥材中紅景天苷含量)×100%][10]。結(jié)果第3次提取時(shí)紅景天苷轉(zhuǎn)移率占總轉(zhuǎn)移率的1.90%、1.84%、2.00%,低于5%。因此,對(duì)多血康進(jìn)行2次回流提取即可,詳見表5。

        表5 提取次數(shù)考察結(jié)果Tab 5 Results of extraction times test

        2.6 放大驗(yàn)證試驗(yàn)

        根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,按處方比例稱取藥材180 g,以上述優(yōu)化工藝回流提取2次,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果3次試驗(yàn)Y1、Y2、Y3平均值分別為50.18%、1.82 mg/g、16.54 mg/g(RSD≤0.84%,n=3),紅景天苷轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)接近,表明該提取工藝穩(wěn)定、可行,詳見表6。

        表6 放大驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 6 Results of the amplification verification test(n=3)

        3 討論

        多血康作為藏醫(yī)治療多血癥的臨床常用方,為發(fā)揮其治療效果,研究其提取工藝具有重要意義。由于復(fù)方制劑成分復(fù)雜,一般需多種有效成分共同作用才能達(dá)到療效的有效發(fā)揮,以單一成分作為提取工藝優(yōu)化的指標(biāo),不免存在片面性。多血康以余甘子為君藥,紅景天為臣藥,因此,本研究選取紅景天、余甘子在《中國藥典》中的規(guī)定成分即紅景天苷與沒食子酸的含量共同作為提取工藝考察指標(biāo)。紅景天苷作為指標(biāo)性有效成分,其含量是首要參考指標(biāo),故其權(quán)重設(shè)置最高。

        均勻設(shè)計(jì)法是一種用少量試驗(yàn)處理多因素多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,可減少試驗(yàn)意外并便于統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理,具有操作方便且可行性強(qiáng)的特點(diǎn),因而常運(yùn)用于制劑的提取工藝、成型工藝等的研究[16]。本研究在前期預(yù)試驗(yàn)中,比較了多血康水提取和70%乙醇提取對(duì)紅景天苷的影響,結(jié)果顯示70%乙醇提取的紅景天苷轉(zhuǎn)移率為67.11%,高于水提取的紅景天苷轉(zhuǎn)移率63.74%。因此,后期則只選擇了乙醇體積分?jǐn)?shù)作為考察因素之一。由于提取次數(shù)不僅影響提取時(shí)間,而且影響料液比。提取1次的提取時(shí)間、料液比與提取2次的提取時(shí)間、料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是不一樣的,所以本研究將提取次數(shù)進(jìn)行單獨(dú)考察。

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        Optimization of Extraction Technology for Tibetan Medicine Duoxuekang by Uniform Design

        LYU Xiumei,WANG Jing,ZHAO Kehui,ZHANG Jing,LAI Xianrong,F(xiàn)AN Gang,ZHANG Yi,GENG Zangjia(College of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

        OBJECTIVE:To optimize the extraction technology of Duoxuekang.METHODS:Using comprehensive score of salidroside,gallic acid content and extraction yield as indexes,U6(63)uniform design was designed to optimize the liquid-solid ratio,ethanol volume fraction and extraction time of Duoxuekang,then optimize extraction times,and verification test was conducted.RESULTS:The optimal extraction technology was as follows as 50%ethanol,liquid-solid ratio of 1∶14,soaking time of 1.5 h,reflux extraction for 1 h and repeated twice;the average extraction yield in 3 tests was 50.18%,contents of salidroside and gallic acid were 1.82 mg/g,16.54 mg/g(RSD≤0.84%,n=3).CONCLUSIONS:The optimized extraction technology for Duoxuekang is reasonable,simple and feasible.

        Tibetan medicine;Duoxuekang;Uniform design;Salidroside;Gallic acid;Content;Extraction;Technology optimization

        R284.2

        A

        1001-0408(2017)10-1361-04

        2016-09-18

        2016-11-03)

        (編輯:劉 萍)

        國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81203000);公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No.201507002);成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(No. CGPY1503)

        *碩士研究生。研究方向:中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail:lvxiuml@163.com

        #通信作者:副教授,碩士生導(dǎo)師,博士。研究方向:中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail:zhangjingtcm@cdutcm.cedu.cn

        DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.17

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