呂秀梅，王 靜，趙可惠，張 靜，賴先榮，范 剛，張 藝，更藏加（成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都611137）

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化藏藥多血康提取工藝Δ

呂秀梅＊，王 靜，趙可惠，張 靜#，賴先榮，范 剛，張 藝，更藏加（成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都611137）

目的：優(yōu)化多血康的提取工藝。方法：以紅景天苷、沒食子酸含量及出膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用U6（63）均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化多血康提取工藝中的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時(shí)間，再優(yōu)化提取次數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為采用50%乙醇，料液比1∶14，浸泡1.5 h，回流提取1 h并重復(fù)2次；3次試驗(yàn)平均出膏率為50.18%，紅景天苷和沒食子酸含量分別為1.82、16.54 mg/g（RSD≤0.84%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的多血康提取工藝合理、簡單、可行。

藏藥；多血康；均勻設(shè)計(jì)法；紅景天苷；沒食子酸；含量；提??；工藝優(yōu)化

高原紅細(xì)胞增多癥，藏醫(yī)稱“多血癥”，系由高原低氧引起的紅細(xì)胞增多、血液黏稠的一種常見高原疾病，并可導(dǎo)致較嚴(yán)重的全身反應(yīng)或全身系統(tǒng)性疾病，甚至死亡[1]。我國青藏高原人群中多血癥患病率約為2.5%[2]，已成為嚴(yán)重威脅高原人群健康的常見慢性疾病之一。此病多見于高原移居人群，少見于高原世居人群，具有發(fā)病慢、早期病癥不明顯、病情進(jìn)展緩慢的特點(diǎn)[3]。多血康是著名藏醫(yī)大師措如·才郎以藏醫(yī)理論為指導(dǎo)，經(jīng)多年臨床實(shí)踐研制的治療多血癥療效確切的經(jīng)驗(yàn)方，其具有活血散瘀、降低血壓等功效[4]。該方由紅景天、余甘子、沙棘、干姜等4味藥材組成，具有提高機(jī)體缺氧耐受力、緩解疲勞等功效[5]。本課題組在前期研究中，分析了多血康治療多血癥的分子機(jī)制，明確了其入血成分主要來源于紅景天、余甘子、沙棘，并建立了同時(shí)測定其中紅景天苷等6個(gè)成分的高效液相色譜（HPLC）法[4，5-7]。本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法，以紅景天苷、沒食子酸含量及出膏率為指標(biāo)，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間為因素，優(yōu)化提取工藝，為其生產(chǎn)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀（美國安捷倫公司）；BSA124S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SB5200D超聲清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

紅景天藥材于2016年1月21日購自四川省阿壩州藏醫(yī)院，余甘子、干姜藥材于2016年3月18日購自成都市荷花池藥材市場，沙棘藥材于2015年11月13日采自陜西省延安市志丹縣旦八鄉(xiāng)。原藥材均由成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定，分別為大花紅景天[Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms）H.Ohba]的干燥根和根莖、余甘子（Phyllanthus emblica L.）的干燥成熟果實(shí)、中國沙棘（H.rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi.）的干燥成熟果實(shí)、干姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根莖；紅景天苷對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：Must-15082610，純度：98.96%）；沒食子酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201204，純度：89.9%）；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸水率考察

為考察藥材吸水性對(duì)提取條件的影響，先進(jìn)行吸水率試驗(yàn)。按處方比例精密稱取該混合藥材45 g，加入4倍量60%乙醇溶液，每隔30 min觀察1次浸泡透心情況直至1.5 h。待藥材全部浸透后濾出未被藥材吸收的溶液，計(jì)算吸水率（藥材吸水體積/藥材加入量）[8]，結(jié)果吸水率約為1.8倍。

2.2 出膏率的測定

參照2015年版《中國藥典》（四部）通則2201方法[9]測定。精密量取多血康提取液25 mL，置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴揮干后，于105℃干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量。以干燥品計(jì)算供試品中浸出物的含量（%），并計(jì)算出膏率（浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%）。

2.3 紅景天苷、沒食子酸的含量測定

2.3.1 色譜條件確立 色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相Ⅰ：甲醇-水（15∶85），檢測波長：275 nm[10]；流動(dòng)相Ⅱ：甲醇-0.2%磷酸溶液（5∶95），檢測波長：273 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。取“2.3.2”和“2.3.3”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 參照2015年版《中國藥典》（一部）紅景天和余甘子項(xiàng)下方法制備紅景天苷、沒食子酸對(duì)照品溶液[10]。（1）對(duì)照品溶液Ⅰ：取紅景天苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含0.2 mg的溶液，即得。（2）對(duì)照品溶液Ⅱ：取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每l mL含0.734 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取多血康各組成藥材45 g，經(jīng)提取后將提取液濾過，回收溶劑，濃縮、定容，制得多血康貯備液。參照2015年版《中國藥典》（一部）紅景天和余甘子含量測定項(xiàng)下方法[10]制備供試品溶液。（1）供試品溶液Ⅰ：精密量取貯備液20 mL，置于錐形瓶中，水浴揮干后，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：400 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）供試品溶液Ⅱ：精密量取貯備液5 mL，置于錐形瓶中，水浴揮干后，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250W，頻率：400 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察 精密吸取紅景天苷、沒食子酸對(duì)照品溶液各5、8、10、12、15、20μL進(jìn)樣，按流動(dòng)相Ⅰ、流動(dòng)相Ⅱ分別進(jìn)行洗脫，記錄各峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，建立紅景天苷、沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果分別為y＝311 112x+9.444（r＝0.999 2）、y＝2×106x+ 300.78（r＝0.999 9），線性范圍分別為0.508～2.032、3.67～14.68μg。按相關(guān)方法學(xué)考察要求進(jìn)行考察，結(jié)果均符合要求。

2.4 均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化多血康的提取工藝

2.4.1 因素與水平的設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]和前期試驗(yàn)結(jié)果，本研究以料液比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、提取時(shí)間（X3）為考察因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)。采用均勻設(shè)計(jì)表U6（63）[14]，以出膏率（Y1）、紅景天苷含量（Y2）、沒食子酸含量（Y3）為指標(biāo)，并分別賦予權(quán)重系數(shù)為0.1、0.7、0.2，計(jì)算綜合評(píng)分值（Y），Yi＝（X1i/X1max×0.1+X2i/X2max×0.7+X3i/X3max× 0.2）×100][15]，對(duì)多血康提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

2.4.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 每個(gè)試驗(yàn)號(hào)均按處方比例稱取該混合藥材45 g，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)安排各因素和水平進(jìn)行試驗(yàn)，測定Y1、Y2、Y3，計(jì)算Y，詳見表2。

表2 試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 2 Test arrangement and result

5 6 1 4 1 6 5 0 7 0 0 . 5 2 4 1 . 3 4 4 3 . 4 6 1 . 5 4 1 . 4 9 1 3 . 9 6 1 5 . 0 5 9 8 . 0 6 9 7 . 8 2

2.4.3 結(jié)果處理 采用DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，得到優(yōu)化方程，見表3。

表3 回歸分析結(jié)果Tab 3 Results of regression analysis

根據(jù)各回歸方程的回歸系數(shù)R、F及P結(jié)果，結(jié)合試驗(yàn)原理和經(jīng)驗(yàn)可知，Y1、Y2及Y3均只與因素X1有顯著相關(guān)性（P＜0.05），因素X2和X3對(duì)3個(gè)指標(biāo)均無顯著性影響（P＞0.05），與綜合評(píng)分的回歸分析結(jié)果一致。結(jié)合“2.4.2”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果，第5號(hào)試驗(yàn)結(jié)果中Y2和Y均為6次試驗(yàn)中最高者。因此，在第5號(hào)提取工藝的基礎(chǔ)上適當(dāng)增加提取時(shí)間（X3），選取14倍50%乙醇回流提取1 h作為優(yōu)化工藝。該工藝下預(yù)測紅景天苷含量為1.48 mg/g、沒食子酸含量為13.85 mg/g、出膏率為41.25%。

2.4.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 按照處方比例稱取多血康45 g，共3份，以14倍50%乙醇回流提取1 h，測定并計(jì)算各指標(biāo)。結(jié)果3次試驗(yàn)檢測指標(biāo)均高于預(yù)測值，提示該工藝穩(wěn)定、可行，詳見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 4 Results of the verification test（n＝3）

2.5 提取次數(shù)考察

按處方比例稱取藥材45 g，按上述最優(yōu)工藝提取3次，每次單獨(dú)取樣測定，重復(fù)3次。計(jì)算紅景天苷轉(zhuǎn)移率[（提取物的量×提取物中紅景天苷含量）/（處方中紅景天的投料量×紅景天藥材中紅景天苷含量）×100%][10]。結(jié)果第3次提取時(shí)紅景天苷轉(zhuǎn)移率占總轉(zhuǎn)移率的1.90%、1.84%、2.00%，低于5%。因此，對(duì)多血康進(jìn)行2次回流提取即可，詳見表5。

表5 提取次數(shù)考察結(jié)果Tab 5 Results of extraction times test

2.6 放大驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，按處方比例稱取藥材180 g，以上述優(yōu)化工藝回流提取2次，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果3次試驗(yàn)Y1、Y2、Y3平均值分別為50.18%、1.82 mg/g、16.54 mg/g（RSD≤0.84%，n＝3），紅景天苷轉(zhuǎn)移率數(shù)據(jù)接近，表明該提取工藝穩(wěn)定、可行，詳見表6。

表6 放大驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 6 Results of the amplification verification test（n＝3）

3 討論

多血康作為藏醫(yī)治療多血癥的臨床常用方，為發(fā)揮其治療效果，研究其提取工藝具有重要意義。由于復(fù)方制劑成分復(fù)雜，一般需多種有效成分共同作用才能達(dá)到療效的有效發(fā)揮，以單一成分作為提取工藝優(yōu)化的指標(biāo)，不免存在片面性。多血康以余甘子為君藥，紅景天為臣藥，因此，本研究選取紅景天、余甘子在《中國藥典》中的規(guī)定成分即紅景天苷與沒食子酸的含量共同作為提取工藝考察指標(biāo)。紅景天苷作為指標(biāo)性有效成分，其含量是首要參考指標(biāo)，故其權(quán)重設(shè)置最高。

均勻設(shè)計(jì)法是一種用少量試驗(yàn)處理多因素多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可減少試驗(yàn)意外并便于統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理，具有操作方便且可行性強(qiáng)的特點(diǎn)，因而常運(yùn)用于制劑的提取工藝、成型工藝等的研究[16]。本研究在前期預(yù)試驗(yàn)中，比較了多血康水提取和70%乙醇提取對(duì)紅景天苷的影響，結(jié)果顯示70%乙醇提取的紅景天苷轉(zhuǎn)移率為67.11%，高于水提取的紅景天苷轉(zhuǎn)移率63.74%。因此，后期則只選擇了乙醇體積分?jǐn)?shù)作為考察因素之一。由于提取次數(shù)不僅影響提取時(shí)間，而且影響料液比。提取1次的提取時(shí)間、料液比與提取2次的提取時(shí)間、料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是不一樣的，所以本研究將提取次數(shù)進(jìn)行單獨(dú)考察。

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Optimization of Extraction Technology for Tibetan Medicine Duoxuekang by Uniform Design

LYU Xiumei，WANG Jing，ZHAO Kehui，ZHANG Jing，LAI Xianrong，F(xiàn)AN Gang，ZHANG Yi，GENG Zangjia（College of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Duoxuekang.METHODS：Using comprehensive score of salidroside，gallic acid content and extraction yield as indexes，U6（63）uniform design was designed to optimize the liquid-solid ratio，ethanol volume fraction and extraction time of Duoxuekang，then optimize extraction times，and verification test was conducted.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as 50%ethanol，liquid-solid ratio of 1∶14，soaking time of 1.5 h，reflux extraction for 1 h and repeated twice；the average extraction yield in 3 tests was 50.18%，contents of salidroside and gallic acid were 1.82 mg/g，16.54 mg/g（RSD≤0.84%，n＝3）.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology for Duoxuekang is reasonable，simple and feasible.

Tibetan medicine；Duoxuekang；Uniform design；Salidroside；Gallic acid；Content；Extraction；Technology optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）10-1361-04

2016-09-18

2016-11-03）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81203000）；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（No.201507002）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（No. CGPY1503）

＊碩士研究生。研究方向：中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：lvxiuml@163.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：zhangjingtcm@cdutcm.cedu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.17