孫 濤 劉圣紅 劉河疆 古麗斯坦 安 靜 王 成

（新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所／農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊）／新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊830091）

儀器應用

SPE－UPLC－MS／MS法測定牛奶中β－內酰胺類藥物殘留

孫 濤 劉圣紅 劉河疆 古麗斯坦 安 靜 王 成＊

（新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所／農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊）／新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊830091）

本試驗應用固相萃取技術（SPE），結合超高效液相色譜－串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（UPLC－MS／MS），建立了快速測定生鮮乳中β－內酰胺類藥物殘留的方法。樣品經乙腈提取，Oaiss PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%水溶液為流動相，Waters C18色譜柱進行分離；多反應監(jiān)測（MRM）模式，外標法進行定量。方法回收率在70.1%～95.5%之間；相對標準偏差（n＝3）范圍為1.0%～9.1%；線性范圍為0.002～0.100mg／L；檢出限為0.1～0.6μg／kg；定量限為0.3～1.8μg／kg。表明該方法專屬性強、靈敏度高，適用于生鮮乳中β－內酰胺類藥物殘留的測定。

固相萃取 超高效液相色譜－串聯(lián)質譜 牛奶β－內酰胺類藥物

乳制品作為人類膳食結構中動物蛋白質的主要來源之一，對提高生活質量和均衡人類膳食結構具有重要作用。隨著人民生活水平的不斷提高，乳及乳制品已成為人們生活 中不可缺少的食品之一。牛奶中的抗生素殘留，不僅會影響牛奶品質，甚至危害人體健康。我國農業(yè)行業(yè)標準《無公害食品生鮮牛乳》中明確規(guī)定生鮮乳中不得檢出抗生素。β－內酰胺類抗生素（β－lactams antbiotics）屬于化學結構中含有β－內酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、碳氫酶烯類、氧頭孢類等［1］。

歐盟、中國、美國等國家及國際食品法典委員會都已對動物源食品中β－內酰胺類抗生素殘留量做出了最大殘留限量值的規(guī)定，用以嚴格控制β－內酰胺類抗生素在畜牧業(yè)中的應用［2］。檢測β－內酰胺類抗生素的方法主要有微生物檢測法［3］，酶聯(lián)免疫分析法［4］，液相色譜法（HPLC）［5］，液相色譜－質譜法（HPLC－MS）［68］等。本試驗研究了牛奶中β－內酰胺類抗生素前處理方法和UPLC－MS／MS檢測條件。結果表明，本方法簡便、快速、高效，能提高牛奶中β－內酰胺類抗生素檢測的工作效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XEVO－TQ三重四級桿串聯(lián)質譜儀（美國Waters公司），配有電噴霧離子源（ESI）；Milli－Q超純水設備（美國Millipore公司）；漩渦混合器（德國IKA公司）；CT18RT離心機（天美公司）；Oaiss PRiMe HLB小柱（3CC，60mg，美國Waters公司）；微孔濾膜0.20μm（美國Pall公司）。

乙腈、甲醇等均為色譜純；其他試劑均為分析純。水為超純水。

1.2 標準工作液配制

將阿莫西林（99.0%（純度，下同））、頭孢氨芐（99.0%）、青霉素G鉀鹽（99.4%）、青霉素V鉀鹽（99.8%）、苯唑西林（99.0%）、氯唑西林（99.5%）、頭孢哌酮（96.5%）、氨芐西林（99.5%）、雙氯西林（97.5%）和萘夫西林（91.0%）標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；頭孢洛寧、阿洛西林、哌拉西林鈉和氟氯西林均為化學對照品，購自中國生物制品檢定所。用50%乙腈水溶液配制成質量濃度為100mg／L的標準儲備液，依據(jù)需要稀釋成適當質量濃度的標準工作液，于4℃下保存。

1.3 色譜條件

色譜柱：Acquity C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：10℃；進樣量：5μL；流動相：溶劑A為0.1%甲酸乙腈溶液，溶劑B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.20mL／min；梯度洗脫程序為2min，A5%，B95%；4min，A95%，B5%；5min，A5%，B95%；6min，A5%，B95%。

1.4 質譜條件

離子源：電噴霧正離子源（ESI＋）；毛細管電壓：3.00kV；離子源溫度：150℃；錐孔反吹氣流量：50L／h；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L／h。碰撞氣：氬氣，流量：0.18mL／min，駐留時間100ms，多反應監(jiān)測掃描模式（MRM）。質譜參數(shù)見表1。

1.5 樣品采集

由市場、超市購買牛奶樣品，混合均勻后，冷藏保存。

1.6 樣品處理

準確稱取2g（0.001g）混勻后的樣品于25mL具塞離心管中，加入5mL乙腈，渦旋混勻1min，10000r／min離心3min，取上清液于10mL玻璃試管，再向25mL具塞離心管中加入3mL乙腈，漩渦混勻后，離心，上清液合并于10mL玻璃試管中，直接過Oaiss PRiMe HLB固相萃取柱，收集濾出液，35℃氮吹至約0.5mL，用水定容至1mL，過0.20μm微孔濾膜，待UPLC－MS／MS分析。

2 結果

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用蠕動泵自動進樣方式，以10μL／min速度將1.0μg／mLβ－內酰胺類抗生素阿莫西林、頭孢洛寧、頭孢氨芐、氨芐西林、頭孢哌酮、阿洛西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林和萘夫西林標準溶液注入三重四級桿質譜，采用正離子掃描方式進行質譜分析，在選定的ESI（＋）模式下，各組分產生穩(wěn)定的強峰母離子。再打開碰撞氣氬氣，通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到相應組分的子離子，掃描出穩(wěn)定強峰子離子，通過比較響應信號的強弱，選擇兩組信號較強離子對作為多反應監(jiān)測子離子。對錐孔電壓、碰撞氣能量、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔反吹氣流量等參數(shù)進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的質譜條件見1.4。

2.2 色譜條件的選擇

β－內酰胺類抗生素殘留分析多采用C18柱進行分離，黃百芬等［9］選取ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1mm，1.7μm）對19種β－內酰胺類抗生素進行分離，取得較好效果。本試驗以ACQUITY BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）作為分析柱，雖然青霉素V（4.51min）、苯唑西林（4.52min）、氯唑西林（4.53min）保留時間有重疊，但由于采用多反應監(jiān)測（MRM）方式，每種組分各開一時間窗口，因此不影響各組分的定性與定量；運用電噴霧電離源，采用正離子模式電離，加入甲酸可提高待測物質的響應信號；分別采用不同濃度的甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液、甲酸甲醇溶液作為流動相進行優(yōu)化。最終選用的流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液。同時選擇適當?shù)奶荻认疵摮绦蚴?4種待測組分得到較好的分離，一次分析僅需6min?？傠x子流圖見圖1，圖1中1～14號組分依次為阿莫西林、頭孢洛寧、頭孢氨芐、氨芐西林、頭孢哌酮、阿洛西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林和萘夫西林。

表1 多反應監(jiān)測掃描模式（MRM）的部分質譜參數(shù)

圖1 14種β－內酰胺類藥物總離子流（TIC）圖

2.3 前處理條件的選擇

生鮮乳品中藥物殘留提取試劑通常有乙腈、甲醇、丙酮。由于大部分β－內酰胺類抗生素在酸性條件下不穩(wěn)定，無法采用酸沉淀法來處理牛奶中的蛋白質，黃百芬等［9］通過試驗發(fā)現(xiàn)采用乙酸鉛提取法可以得到較好的沉淀效果和理想的回收率；本試驗選取乙腈與奶液體積比為3∶1進行提取，不僅蛋白沉淀效果好，而且提取液中干擾物少。β－內酰胺類藥物常用的固相萃取柱有C18柱和HLB柱等［69］，以上兩種固相萃取小柱用前均需活化，上樣后均需淋洗和洗脫的步驟；本試驗應用Oaiss PRiMe HLB固相萃取柱，無需活化、淋洗和洗脫的步驟，采取直接過濾凈化的方式，提高了樣品前處理的速度。

2.4 線性關系、方法準確度及精密度、檢出限及定量限

2.4.1 線性關系

選取空白樣本提取液配制系列基質標準工作溶液，繪制標準曲線進行定量，線性關系和相關系數(shù)見表2。在0.002～0.100mg／L范圍內，14種β－內酰胺類藥物線性相關系數(shù)r≥0.9968。

表2 β－內酰胺類藥物線性范圍、線性關系和相關系數(shù)

2.4.2 方法準確度及精密度、檢出限及定量限

對β－內酰胺類藥物分別按0.002、0.010、0.050mg／kg添加水平對生鮮乳進行了加標回收試驗，得到了較好的結果，回收率及其相對標準偏差RSD（n＝3）見表3。在3個添加水平，平均回收率在70.1%～95.5%，RSD≤9.1%；以添加標準樣品0.002mg／kg時按3倍信噪比計算方法檢出限（LOD），10倍信噪比計算定量限（LOQ）。

表3 β－內酰胺類藥物添加回收率、LOD與LOQ

續(xù)表3

3 結論

試驗選取生鮮乳作為測試樣品，SPE法凈化結合液相色譜串聯(lián)質譜法；采用電噴霧離子源（ESI＋），Acquity C18超高效液相色譜柱對生鮮乳中β－內酰胺類藥物進行分離；建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法測定生鮮乳中β－內酰胺類藥物殘留的分析方法，該方法簡便、快速、靈敏，測定結果滿足生鮮乳中β－內酰胺類藥物殘留的檢測要求。

［1］白國濤，儲曉剛，潘國清，等.β－內酰胺類抗生素殘留檢測技術研究進展.食品科學，2008，2（7）：485－489.

［2］袁萍，劉亞風，祝偉霞，等 .動物源性食品中β－內酰胺類藥物殘留檢測研究進展.檢驗檢疫學刊，2010，20（3）：65－68.

［3］李延華，王偉君，張?zhí)m威，等 .微生物法檢測牛乳中β－內酰胺類抗生素殘留的對比研究 .中國抗生素雜志，2009，34（1）：63－66.

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［5］孫艷俠 .高效液相色譜在乳品抗生素殘留檢測中的應用.山西農業(yè)科學，2010，38（3）：10－13.

［6］孫雷，張驪，汪霞，等 .超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法對動物源性食品中13種β－內酰胺類藥物殘 留的檢測 .分析測試學報，2009，28（5）：576－578.

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［9］黃百芬，吳丹青，蔡增軒，等 .超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法同時測定牛奶中19種β－內酰胺類抗生素 .中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（1）：1－6.

Determination ofβ－lactams residues in milk by SPE－UPLC－MS／MS.

Sun Tao，Liu Shenghong，Liu He－ jiang，Gulisitan，An Jing，Wang Cheng＊
（Institute of Quality Standards ＆Testing Technology for Agro－Products，XinJiang Academy of Agricultural Science，Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro－Products（Urumqi），Key Laboratory of Agro－Products Quality and Safety of Xinjiang，Urumqi 830091，China）

The samples were extracted by acetonitrile and purified with Oaiss an PRiME HLB cartridge.The UPLC analyses were performed on an Acquity UPLC C18column with gradient elution using acetonitrile（containing 0.1%formic）and water（containing 0.1%formic）as mobile phase.The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring（MRM）in electrospray positive ionization mode.The average recoveries ofβ－lactams antibiotics ranged from 70.1%to 95.5%，with the relative standard deviation from 1.0%to 9.1%，the calibration curve was liner from 0.002to 0.100mg／L，the detection limits ofβ－lactams antibiotics were 0.1－0.6μg／kg and the limit of quantitation were 0.3－1.8μg／kg.This method is specific，sensitive and suitable for determination ofβ－lactams antibiotics in the milk.

SPE；UPLC－MS／MS；Milk；β－lactams antibiotics

10.3936／j.issn.1001－232x.2017.01.002

2016－06－27

自治區(qū)公益性科研院所基本科研項目（KYGY2016094）；2016年生鮮乳農獸藥、重金屬和生物毒素等危害因子摸底排查與驗證評估項目（GJFP201600802）

孫濤，男，1978年出生，高級實驗師；E－mail：suntaotxy＠126.com。

王成，男，1971年出生，研究員，主要從事農產品質量安全工作。