王 娟，張莎莎，張保華，李建忠，梁生康，孔祥平*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109；2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266100）

◆研究與開(kāi)發(fā)◆

7.5%多殺霉素懸浮劑的制備與分析

王 娟1，張莎莎1，張保華1，李建忠1，梁生康2，孔祥平1*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109；2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266100）

采用濕法研磨工藝，單因素優(yōu)選法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化7.5%多殺霉素懸浮劑的制備條件，并采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法對(duì)熱貯14 d產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果表明：以槐糖脂水溶液（200 mg/L）為分散介質(zhì)，懸浮劑最優(yōu)制備條件為Well-301和Well-303（質(zhì)量比2∶1）用量6.0%，黃原膠用量0.25%，尿素用量4.5%，研磨時(shí)間2.0 h。熱貯后有效成分組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)均保持不變，符合懸浮劑的要求。HPLC-MS法適用于多殺霉素類多組分混合物制劑的質(zhì)量檢測(cè)。

多殺霉素；懸浮劑；槐糖脂；高效液相色譜-質(zhì)譜；制備

在前文[1]對(duì)多殺霉素懸浮劑（SC）的潤(rùn)濕分散劑進(jìn)行篩選中發(fā)現(xiàn)，分散劑Well-301和Well-303效果較好。表面活性劑復(fù)配常具有協(xié)同增效作用，可以彌補(bǔ)單一表面活性劑性能上的缺陷，減少表面活性劑的用量，降低成本，增加效能[2]。Well-301和Well-303分別為聚羧酸鹽類和有機(jī)磷酸酯類分散劑，二者復(fù)配有望應(yīng)用于多殺霉素SC，但尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本工作以粒徑和穩(wěn)定性為考察指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)確定Well-301和Well-303的復(fù)配比例，并進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化7.5%多殺霉素懸浮劑的制備條件。在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法對(duì)熱貯14 d后的7.5%多殺霉素SC產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

多殺霉素（90%），美國(guó)陶氏益農(nóng)公司；Well-301、Well-303，福建南平威爾生化科技有限公司；槐糖脂，由中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；黃原膠（BR）；甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Merck公司；尿素（AR），萊陽(yáng)市康德化工有限公司；屈臣氏蒸餾水。

ISSMJ0.1-1型立式砂磨機(jī)，沈陽(yáng)化工研究院有限公司；B9300H型激光粒度分布儀，丹東百特儀器有限公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：Agilent 6460質(zhì)譜儀配Agilent 1290液相色譜儀，Agilent EP C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；XW-80A微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-4型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PV 215CD電子分析天平（精確至0.01 mg），美國(guó)奧豪斯公司；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Eppendorf移液器（100 μL、1 mL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 潤(rùn)濕分散劑的選擇

實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[1]，固定多殺霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，分散劑用量為6.0%，改變分散劑的種類，以蒸餾水為分散介質(zhì)，研磨1.5 h，鋯珠（d=1.2 mm）體積為制劑體積的2倍，以熱貯14 d后懸浮劑粒徑為考察指標(biāo)，選擇多殺霉素的單一分散劑。

1.2.2 多殺霉素SC的制備

固定多殺霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，分散劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.0%，改變分散劑Well-301和Well-303的配比，以熱貯14 d和冷貯14 d后懸浮劑的粒徑、絮凝現(xiàn)象和析水率為考察指標(biāo)，確定Well-301和Well-303的配比。固定分散劑的配比，以熱貯14 d后懸浮劑的D90值為考察指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化7.5%多殺霉素SC的研磨時(shí)間、潤(rùn)濕分散劑、增稠劑（黃原膠）和防凍劑（尿素）的用量，具體因素、水平見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 多殺霉素SC產(chǎn)品分析

采用HPLC-MS法[3-4]分析熱貯14 d后7.5%多殺霉素SC產(chǎn)品。色譜條件：流動(dòng)相為乙腈水溶液；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序，0～9 min，10%～90%乙腈水溶液；9.01～12 min，90%乙腈水溶液；12.01～15 min，10%乙腈水溶液。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子（ESI＋）全掃描；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力0.28 MPa；掃描范圍（m/z）600～900；掃描時(shí)間500 ms；加速電壓130 V。

將熱貯14 d后的7.5%多殺霉素SC產(chǎn)品離心、干燥后，稱取10 mg樣品（精確至0.01 mg），用甲醇溶解、定容至10 mL容量瓶中，0.2 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液。采用逐級(jí)稀釋法，將濾液用乙腈＋水混合液（體積比3∶7）稀釋至1 000倍，待測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 潤(rùn)濕分散劑篩選結(jié)果

潤(rùn)濕分散劑對(duì)多殺霉素SC粒徑的影響見(jiàn)表2?？梢钥闯觯?dāng)分散劑為Well-301和Well-303時(shí)，熱貯［（54±2）℃］14 d后懸浮劑粒徑（D50值＜5 μm、D90值＜10 μm）符合懸浮劑的要求。Well-301和Well-303分別為聚羧酸鹽類和有機(jī)磷酸酯類分散劑，將二者復(fù)配以期獲得更好的效果。

表2 單一潤(rùn)濕分散劑的篩選

2.2 Well-301和Well-303配比確定

分散劑Well-301和Well-303配比對(duì)7.5%多殺霉素SC的影響見(jiàn)表3?？梢钥闯?，由于未加黏度調(diào)節(jié)劑，析水率均較高。以槐糖脂水溶液（200 mg/L）為分散介質(zhì)多殺霉素SC的粒徑大多小于以蒸餾水為介質(zhì)的SC，且析水率也相對(duì)較低。說(shuō)明槐糖脂對(duì)多殺霉素產(chǎn)生了良好的助分散作用，進(jìn)一步證實(shí)了我們前期的研究結(jié)果[1]。當(dāng)Well-301與Well-303質(zhì)量比為2∶1時(shí)，無(wú)論是以蒸餾水還是以槐糖脂水溶液為分散介質(zhì)，多殺霉素SC均無(wú)絮凝現(xiàn)象，而且粒徑均較小，析水率相對(duì)較低。說(shuō)明以該配比復(fù)配，2種分散劑的協(xié)同作用強(qiáng)、效果好。以該配比復(fù)配時(shí)，以槐糖脂水溶液為分散介質(zhì)懸浮液的析水率遠(yuǎn)小于以蒸餾水為分散介質(zhì)懸浮液析水率。因此，7.5%多殺霉素SC以槐糖脂水溶液為分散介質(zhì)，分散劑Well-301 與Well-303的質(zhì)量比為2∶1。

表3 分散劑Well-301和Well-303的配比對(duì)7.5%多殺霉素SC的影響

2.3 多殺霉素SC配方及工藝確定

以槐糖脂水溶液為分散介質(zhì)，固定分散劑Well-301與Well-303的質(zhì)量比為2∶1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表可以看出：影響7.5%多殺霉素SC穩(wěn)定性的主要因素為A（分散劑用量）和B（研磨時(shí)間），C（黃原膠用量）次之，D（尿素用量）影響最小，最佳組合為A3B3C3D2。對(duì)于因素A，K2與K3相差較小（相對(duì)于K1與K2的差值），說(shuō)明分散劑用量從6.0%增加到8.0%對(duì)多殺霉素SC穩(wěn)定性的影響較小，因而從降低制劑成本的角度考慮，因素A取A2。根據(jù)因素B的K值可知，隨著研磨時(shí)間的增加，多殺霉素SC的粒徑逐漸減小，穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)，研磨時(shí)間為2 h時(shí)，粒徑已符合懸浮劑的要求，從節(jié)約能源的角度考慮，無(wú)需增加研磨時(shí)間，因素B取B3。因素C為次要因素，其K2和K3相差較小，因素C可取C2。因此，最優(yōu)組合為A2B3C2D2，即分散劑用量為6.0%，黃原膠用量為0.25%，尿素用量為4.5%，研磨時(shí)間為2.0 h（鋯珠體積為制劑體積的2倍）。該方案制得的7.5%多殺霉素SC外觀呈乳白色，熱貯14 d后D50值、D90值、跨距和析水率分別為1.91 μm、4.87 μm、2.31和9%，無(wú)沉淀和絮凝現(xiàn)象，分散性和傾倒性好，基本符合懸浮劑的要求。

2.4 產(chǎn)品分析

熱貯14 d后7.5%多殺霉素SC產(chǎn)品的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1?？梢钥闯觯瑴?zhǔn)分子離子峰732.6和746.7對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為產(chǎn)品的主要成分，分別為spinosyn A和spinosyn D[3-4]，說(shuō)明熱貯14 d后，產(chǎn)品的主要成分組成沒(méi)變。

圖1 多殺霉素SC產(chǎn)品的質(zhì)譜圖

產(chǎn)品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2，峰1和峰2對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為產(chǎn)品的主要成分，結(jié)合質(zhì)譜圖可知，峰1和峰2對(duì)應(yīng)的物質(zhì)分別為spinosyn A和spinosyn D，按峰面積歸一化法測(cè)得兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為77.8%和14.3%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.1%。由于忽略了質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，相對(duì)分子質(zhì)量大于spinosyn D的成分，所以總質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于原藥有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（90%），說(shuō)明有效成分沒(méi)有發(fā)生降解，所制備懸浮劑合格。另外通過(guò)計(jì)算得出，有效成分中spinosyn A和spinosyn D分別占84.5%和15.5%，與原藥中spinosyn A和spinosyn D的表觀比例（分別為85%和15%[5-6]）基本吻合，進(jìn)一步說(shuō)明產(chǎn)品有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)變，所制備懸浮劑合格。

圖2 產(chǎn)品的高效液相色譜圖

3 結(jié)論與討論

以槐糖脂水溶液（200 mg/L）為分散介質(zhì)，7.5%多殺霉素SC最佳制備條件為分散劑Well-301和Well-303（質(zhì)量比2∶1）用量6.0%，黃原膠0.25%，尿素4.5%，研磨時(shí)間2.0 h（鋯珠體積為制劑體積的2倍）。所得產(chǎn)品外觀呈乳白色，（54±2）℃熱貯14 d無(wú)沉淀和絮凝現(xiàn)象，產(chǎn)品粒徑小，析水率低，分散性和傾倒性好，有效成分分解率低，符合懸浮劑的要求。

HPLC-MS分析法已廣泛用于檢測(cè)蔬菜、食品中多殺霉素的殘留量[3-4，7]，但多殺霉素制劑的質(zhì)量檢測(cè)目前仍以高效液相色譜法為主[8-9]，HPLC-MS法應(yīng)用較少。本研究采用HPLC-MS法對(duì)多殺霉素制劑進(jìn)行了檢測(cè)，利用MS靈敏度高、定性能力強(qiáng)的特點(diǎn)定性確定了產(chǎn)品的有效成分，利用HPLC分離多組分混合物高效和定量分析簡(jiǎn)便的特點(diǎn)定量確定了產(chǎn)品有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取得了良好的效果。隨著HPLC-MS的普及，HPLC-MS法必將成為多殺霉素類多組分混合物制劑質(zhì)量檢測(cè)的有效手段[10]。

[1]王娟,牛悅,張保華,等.槐糖脂為助劑的多殺霉素懸浮劑的潤(rùn)濕分散劑篩選[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2016,15(5):18-21.

[2]黃亞雄,張博,關(guān)策,等.陰離子、非離子表面活性劑的復(fù)配及在35%嘧菌酯懸浮劑中的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2016,15(3): 15-19.

[3]孫敏,曹趙云,劉慧,等.PSA分散固相萃取和高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中多殺菌素的殘留[J].分析試驗(yàn)室,2010,29(8): 70-74.

[4]張縉,楊黎忠,林立毅,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中多殺菌素A和D的殘留量[J].色譜,2011,29(7):637-642.

[5]吳霞.多殺菌素——害物綜合治理的一個(gè)有力武器 [J].世界農(nóng)藥,2005,27(6):21-24.

[6]華乃震.綠色環(huán)保生物殺蟲(chóng)劑多殺霉素和乙基多殺菌素的述評(píng)[J].農(nóng)藥,2015,54(1):1-5.

[7]雷琪,于福利,王素琴,等.多殺霉素在花椰菜中的殘留量分析與評(píng)價(jià)[J].農(nóng)藥,2016,55(5):374-376.

[8]王旭,于福利,雷琪,等.16%多殺·吡蟲(chóng)啉懸浮劑高效液相色譜分析方法研究[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2012,11(3):30-31,43.

[9]劉德坤,張翠,楊石有,等.多殺菌素·毒死蜱微球高效液相色譜分析[J].農(nóng)藥,2012,51(8):581-583.

[10]李?yuàn)?汪清民,黃潤(rùn)秋.多殺菌素的研究進(jìn)展 [J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2003,5(2):1-12.

（責(zé)任編輯：顧林玲）

Preparation and Analysis of Spinosad 7.5%SC

WANG Juan1,ZHANG Sha-sha1,ZHANG Bao-hua1,LI Jian-zhong1,LIANG Sheng-kang2,KONG Xiang-ping1*
(1.College of Chemistry and Pharmacy,Qingdao Agricultural University,Shandong Qingdao 266109,China;2.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology of Ministry of Education,Ocean University of China,Shandong Qingdao 266100,China)

The preparation conditions of spinosad 7.5%SC were optimized by single-factor test and orthogonalexperiment using the wet grinding method.The stability of the product after heat storage for 14 d was determined by HPLC-MS.The results showed that the optimal preparation conditions were well-301 and well-303 (mass ratio 2∶1) 6.0%,xanthan gum 0.25%,urea 4.5%and a milling time of 2.0 h with sophorolipids aqueous solution (200 mg/L)as the dispersing medium.The composition and content of the active ingredients in the obtained product unchanged after heat storage for 14 d,and the prepared product met the requirements of SC.The HPLC-MS method may be suitable for the quality detection of multi-component pesticide formulations such as the spinosad SC.

spinosad;SC;sophorolipid;high performance liquid chromatography-mass spectrometry;preparation

TQ 450.6；TQ 450.7

A

10.3969/j.issn.1671-5284.2017.02.005

2016-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31501682）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2014EL012、ZR2014CM039）；青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（15-9-1-16-jch）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（6631115037）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金

王娟（1980—），女，山東省膠州市人，博士，主要從事控釋材料、計(jì)算化學(xué)研究。E-mail：juaner80@163.com

孔祥平（1977—），男，山東省曲阜市人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事甲殼素化學(xué)和控釋材料研究。E-mail：kxp2004@163.com