沈云+陳日道+解可波+鄒建華+戴均貴

[摘要] 開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶（secoisolariciresinol dehydrogenase，SDH）是鬼臼毒素（podophyllotoxin）生物合成途徑中的關鍵酶。該研究通過基于SDH基因保守性序列的同源PCR方法，結合快速擴增cDNA末端（RACE）技術從八角蓮Dysosma versipellis愈傷組織中克隆得到2個SDH候選基因SO282和SO1223，并實現(xiàn)了以上基因在大腸桿菌中的可溶性表達。體外酶活性分析表明重組SO282具有SDH活性，為后續(xù)研究八角蓮中鬼臼毒素的生物合成奠定了基礎。

[關鍵詞] 八角蓮；開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶；鬼臼毒素；生物合成

[Abstract] Secoisolariciresinol dehydrogenase （SDH） is a key enzyme involved in the biosynthetic pathway of podophyllotoxin.In this study，two SDH candidate genes，SO282 and SO1223，were cloned from callus of Dysosma versipellis by homology-based PCR and rapid amplification of cDNA end （RACE）.The SDH candidate genes were expressed in Escherichia coli and the subsequent enzyme assay in vitro showed that recombinant SO282 had the SDH activity. These results pave the way to the follow-up investigation of the biosynthetic of podophyllotoxin.

[Key words] Dysosma versipellis；podophyllotoxin；SDH；biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20162414

八角蓮Dysosma versipellis是小檗科八角蓮屬多年生草本植物，其以根莖入藥，主要用于治療毒蛇咬傷、跌打腫痛、風濕性關節(jié)痛、淋巴結炎、乳腺癌、食道癌等疾病[1-2]。研究表明，八角蓮根莖中主要含有鬼臼毒素（podophyllotoxin）、去氧鬼臼毒素（deoxypodophllotoxin）、山柰酚（kaempferol）以及槲皮素（quercetin）等多種有效成分[3]，其中鬼臼毒素對于腫瘤以及細胞癌變具有顯著的抑制作用[4]。然而，由于野生八角蓮生長緩慢，分布區(qū)域局限且繁殖力低，加之過度采挖，八角蓮野生資源已不能滿足醫(yī)藥市場的需求[5-6]。另外，鬼臼毒素化學合成路線長、效率低，難以實現(xiàn)商業(yè)化。因此，解析鬼臼毒素的生物合成途徑，有利于實現(xiàn)八角蓮優(yōu)質種源的篩選、株系的改良、栽培和培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及體內生物合成體系的調控，從而快速大量得到所需目的產(chǎn)物，更為重要的是獲得的生物合成相關基因可在微生物中重新構建其生物合成途徑，綠色、可持續(xù)、高效率生產(chǎn)鬼臼毒素，解決其藥源不足的問題。

開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶是鬼臼毒素生物合成途徑中的關鍵酶（圖1），負責將開環(huán)異落葉松脂素（secoisolariciresinol）進行氧化脫氫生成重要中間體馬臺樹脂醇（matairesinol）。研究表明，在桃兒七Sinopodophyllum hexandrum、美國金鐘連翹Forsythia intermedia以及盾葉鬼臼Podophyllum peltatum中，均克隆得到開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶（secoisolariciresinol dehydrogenase，SDH）相關基因[7-8]，而對于八角蓮中SDH基因的研究還未見報道。本研究的目的在于克隆、表達并功能鑒定八角蓮SDH基因，為后續(xù)研究八角蓮中鬼臼毒素的生物合成奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器與試劑 S1000 Thermal Cycer PCR儀（Bio-Rad，美國）；NanoDrop2000C微量分光光度計（Thermo Scientific，美國）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；DYCP-31DN電泳槽（北京六一儀器廠）；Biospectrum AV凝膠成像系統(tǒng)（UVP，美國）；Sigma 3K-15高速離心機（Sigma，德國）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器廠）；培英HYG-A恒溫搖床（太倉儀器廠，中國）；Cyberscan 510型pH計（Eutech Instrument，新加坡）；Tauto純水儀（同田科技有限公司，中國）；ZX-TJS無菌操作臺（上海整新電子設備，中國）；BSA124S分析天平（Sartorius，德國）；Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent Technologies，美國）；Shiseido capcellpak C₁₈ MGIII色譜柱（Shiseido，日本）。

RNA提取采用E.Z.N.A. Plant RNA Kit（Omega Bio-Tek，美國）；RACE反應采用Smarter RACE cDNA amplification Kit（Clontech，美國）；基因克隆采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶（TOYOBO，日本）、pEASY Blunt Simple克隆載體（TransGen，中國）和Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞（TransGen，中國）；基因外源表達采用pET28a（+）表達載體（Novagen，德國）和Transsetta Phage Resistant化學感受態(tài)細胞（TransGen，中國）。

1.2 樣品 野生八角蓮植株采自廣西壯族自治區(qū)龍州縣，由廣西藥用植物園袁經(jīng)權副研究員鑒定為小檗科八角蓮屬植物八角蓮D. versipellis，標本存放于中國醫(yī)學科學院藥物研究所標本室（ID-26856）。八角蓮培養(yǎng)細胞誘導自野生八角蓮的葉片，培養(yǎng)細胞的誘導采用附加α-萘乙酸（α-NAA，0.5 mg·L^-1）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，1.0 mg·L^-1）、蔗糖（30 g·L^-1）和瓊脂（7 g·L^-1）的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前調pH為5.8。繼代培養(yǎng)采用附加α-NAA（0.2 mg·L^-1）、6-BA（6-芐基嘌呤，0.2 mg·L^-1）、2，4-D（0.5 mg·L^-1）、蔗糖（30 g·L^-1）和瓊脂（7 g·L^-1）的6，7-V固體培養(yǎng)基，于黑暗（25±2） ℃靜止培養(yǎng)[9]。

2 方法與結果

2.1 SDH候選基因的克隆及生物信息學分析 取鮮重0.5 g的八角蓮愈傷組織，按照E.Z.N.A. Plant RNA Kit實驗操作步驟進行總RNA制備，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計測定RNA濃度。采用Smarter RACE cDNA amplification Kit將八角蓮愈傷組織總RNA反轉錄成cDNA，得到3′-ready cDNA以及5′-ready cDNA模板。

根據(jù)GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中報道的植物SDH的保守性核苷酸序列設計簡并引物SDH-F（GCGGCCGCTYCAYTGYGATGTSAC）和SDH-R（CCRCTCACATACTTGGAMTC），分別以3′-ready cDNA和5′-ready cDNA為模板進行SDH基因3′-端和5′-端序列的擴增。3′-端序列PCR擴增反應程序為：94 ℃，2 min；98 ℃，10 s，55 ℃，30 s，68 ℃，60 s，重復35個循環(huán)；68 ℃，7 min。5′-端序列擴增反應程序為：94 ℃，2 min；98 ℃，10 s，58 ℃，30 s，68 ℃，60 s，重復35個循環(huán)；68 ℃，7 min。切膠回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pEASY Blunt simple vector連接并轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，結合藍白斑和菌落PCR篩選陽性轉化子并測序。采用BioEdit軟件對測序結果進行比對拼接，得到2個完整的cDNA，分別命名為SO1223，SO282，其開放閱讀框（open reading frame）長度分別為831，822 bp，經(jīng)NCBI進行Blast分析，另外選擇與SO282，SO1223同源性較高的來源于5種高等植物的7個SDH基因一起使用MEGA5.0軟件通過Neighbor-joining法構建以上基因所編碼蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖2）。從系統(tǒng)進化樹可見，候選基因SO1223和SO282所編碼蛋白與鬼臼屬植物盾葉鬼臼、六角蓮以及藏八角蓮中的SDH基因所編碼蛋白具有較高的同源性，其中SO282所編碼蛋白與這些植物SDH親緣關系最近。

采用primer premier軟件進行引物設計擴增候選基因SO1223和SO282的完整開放閱讀框，并在兩端引入Nde Ⅰ和Hind Ⅲ限制性酶切位點，所用引物對分別為：SO1223-F/R（ggaattccatATGGGGAGCACTTCAC/cccaagctTCAGGACTCAGGATACT）和SO 282-F/R（ggaattccatATGGAAACCTCTTGTAC/cccaagc tTCAAGCTAATCCATGT）。

膠回收PCR產(chǎn)物后將帶有酶切位點的目的DNA與pEASY Blunt載體連接轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞，篩選出陽性轉化子提取質粒并進行雙酶切。利用T4連接酶將酶切所得DNA片段與pET28a（+）載體連接構建表達質粒，所得重組質粒轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞進行測序驗證。

2.2 SDH候選基因的外源表達 提取構建成功的SO1223以及SO282基因表達質粒，轉化Transetta DE3表達感受態(tài)細胞。將重組菌于含有卡那霉素（50 mg·L^-1）和氯霉素（34 mg·L^-1）的LB培養(yǎng)基中搖瓶旋轉震蕩培養(yǎng)，分別使用終濃度為0.25，0.5，1.0 mmol·L^-1的IPTG誘導表達16 h，并設置一組空白對照，進行誘導表達條件的摸索。通過SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況。根據(jù)電泳結果可知，克隆所得SDH候選基因實現(xiàn)了可溶性表達，并且當使用0.5 mmol·L^-1的IPTG誘導時重組SDH可溶蛋白的表達量最大。因此最終采用0.5 mmol·L^-1的IPTG進行目的蛋白的誘導表達，提取粗酶并進行SDS-PAGE分析（圖3）。

2.3 SDH候選基因的功能鑒定 對含有SO282，SO1223基因表達質粒以及含有pET28a（+）空載體質粒的重組菌分別培養(yǎng)50 mL并采用終濃度為0.5 mmol·L^-1的IPTG誘導16 h，離心收集菌體，加入裂解緩沖液（50 mmol·L^-1Tris-HCl，含有20%的甘油和10 mmol·L^-1 2-巰基乙醇，pH 8.0）超聲破碎細胞，12 000×g離心30 min，獲得上清粗酶液用于SDH酶活性分析。100 μL酶反應體系含89 μL粗酶液，1 μL的secoisolariciresinol（母液濃度50 mmol·L^-1）和10 μL的NAD⁺（母液濃度10 mmol·L^-1）。將配制好的反應體系于30 ℃水浴中反應2 h后，加入2倍體積甲醇終止反應。將反應液15 000×g離心30 min，取上清采用高效液相色譜儀進行分析。分析條件為Shiseido capcellpak C₁₈ MG Ⅲ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%甲酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～10 min，30%～58%B；10～25 min，58%～65%B；25～25.5 min，65%～100%B；25.5～30.5 min，100%B），流速1 mL·min^-1，檢測波長290 nm，柱溫30 ℃（圖4）。

經(jīng)HPLC-MS對比分析酶反應產(chǎn)物及馬臺樹脂醇標準品可知，重組SO282酶具有催化開環(huán)異落葉松脂素氧化脫氫的活性，而基因SO1223的表達產(chǎn)物未顯示有SDH催化活性。

3 結論及討論

在鬼臼毒素的生物合成途徑中，馬臺樹脂醇是包括鬼臼毒素及其衍生物在內的一系列8-8′木脂素類化合物的重要前體化合物[11]。SDH是鬼臼毒素生物合成途徑中的一個關鍵酶，它能夠特異性的催化反式構型的開環(huán)異落葉松脂素氧化脫氫生成相同構型的馬臺樹脂醇，從而進行下一步的生物合成[8，11-13]。本研究從八角蓮愈傷組織中成功獲取2個候選基因SO1223，SO282，體外功能鑒定結果表明基因SO282所編碼的蛋白具有SDH催化活性，為后續(xù)研究八角蓮中鬼臼毒素的生物合成奠定了基礎。目前，對于鬼臼毒素的生物合成途徑的研究還處于起步階段，其后續(xù)的催化過程仍未完全明確，還需進行進一步的探索研究，這對于解決鬼臼毒素及其活性衍生物自然資源不足的問題具有重要意義。

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[責任編輯 呂冬梅]