毛露甜，袁于毅，叢淑潔

惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007

家蠶的過敏原組分鑒定

毛露甜，袁于毅，叢淑潔

惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007

目的：分析引起蠶過敏的組分。方法：利用磷酸緩沖液提取蠶繭和蠶蛹的總蛋白，用SDS-PAGE分析蠶蛋白組分，將蛋白膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用蠶過敏患者的陽性血清進(jìn)行IgE結(jié)合試驗(yàn)來鑒定蠶繭和蠶蛹的過敏原組分。結(jié)果：蠶繭蛋白可辨條帶有8條，其相對(duì)分子質(zhì)量分別約為18×103、27×103、30×103、38×103、42×103、44×103、51×103和58× 103；蠶蛹蛋白主帶有6條，其相對(duì)分子質(zhì)量分別約為23×103、27×103、30×103、33×103、38×103和51×103；蠶繭和蠶蛹在相對(duì)分子質(zhì)量約30×103和51×103附近有2條印跡主帶。結(jié)論：提示家蠶蛋白中存在特定的過敏原。該研究為蠶過敏的診斷和治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

家蠶；過敏原；SDS-PAGE；免疫印跡

過敏性疾病在過去的20多年里發(fā)病率逐年增加，包括接觸性過敏、食入性過敏和吸入性過敏等類型[1]。家蠶（Bombyx mori Linaeus）屬鱗翅目蠶蛾科，是完全變態(tài)的昆蟲。家蠶是我國重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，蠶絲和蠶繭、幼蠶、蠶蛹之間存在交叉反應(yīng)性，蠶過敏者可對(duì)其中任一成分過敏。迄今，國內(nèi)外對(duì)蠶絲過敏的報(bào)道較多，對(duì)蠶蛹過敏的報(bào)道較少，尚未見蠶尿、蠶蛾的鱗屑等過敏原的報(bào)道，只有部分實(shí)驗(yàn)室用它們的粗提液對(duì)病人進(jìn)行皮試，證實(shí)其能引起過敏反應(yīng)。其實(shí)蠶蟲、蠶繭、蠶絲及其制品均可能導(dǎo)致過敏癥，甚至蠶蟲在生活周期產(chǎn)生的物質(zhì)（如蠶尿、蠶蛹、蠶蛾鱗屑等）亦可誘發(fā)過敏反應(yīng)[2]。故對(duì)于蠶及其分泌物引起的過敏性疾病應(yīng)引起高度重視。

蠶絲由絲素（fibroin）和絲膠（sericin）組成，其中絲膠是水溶性的球蛋白，是蠶絲的主要變應(yīng)原成分，引起由IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。由于絲綢的制作工藝要經(jīng)過反復(fù)洗滌和漂染，絲膠蛋白被破壞，故一般不引起過敏反應(yīng)。而絲棉用作填充物或與棉線一起制作衣物，一般洗滌不徹底，大量絲膠仍存在于絲纖維表面，故在繅絲廠對(duì)蠶絲過敏者甚多見[3]。由于蠶蛹營養(yǎng)價(jià)值高，養(yǎng)蠶區(qū)有食用蠶蛹的習(xí)慣，由此引起的過敏癥在我國有病例報(bào)道，而對(duì)蠶蛹變應(yīng)原的基礎(chǔ)研究報(bào)道較少。我們以蠶繭和蠶蛹為材料，用浸提法提取蠶蛋白，用SDS-PAGE和免疫印跡法分析它們的過敏原組分，以期為變態(tài)反應(yīng)性疾病的特異性診斷和治療提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

蠶繭及蠶蛹采自廣東湛江市養(yǎng)蠶戶，是未經(jīng)任何加熱處理的種繭和蛹，冷凍干燥保存。

惠州市中心人民醫(yī)院檢驗(yàn)科收集2例蠶過敏患者（K22）的陽性血清（蠶絲特異性sIgE檢測結(jié)果為Ⅱ級(jí)），非蠶絲過敏健康者血清4份（血清中蠶絲sIgE檢測結(jié)果為陰性）。分離血清并分裝后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

HRP標(biāo)記的羊抗人IgE購自Serotech公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）標(biāo)準(zhǔn)購自TaKaRa公司；PVDF膜購自O(shè)smonics公司；Mini Protean 11垂直板電泳儀和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；TG-20B高速冷凍離心機(jī)購自海安亭科學(xué)儀器廠；721分光光度計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；TY-80B型脫色搖床購自江蘇金壇市寰宇科學(xué)儀器廠。

1.2 蠶過敏原浸液的制備及Bradford法測定蛋白濃度

參照文獻(xiàn)[4]方法略做修改。取蠶繭和蠶蛹，用剪刀剪碎后用預(yù)冷的丙酮覆蓋至脫脂完全為止，置于通風(fēng)櫥中待丙酮完全揮發(fā)，以0.01 mol/L的PBS為提取液，按1∶20加入蠶繭或蠶蛹粉，置4℃冰箱冷浸過夜以提取過敏原蛋白；12 000 r/ min冷凍離心20 min，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SDS-PAGE法分析蠶粗提液的蛋白組分

配制15%分離膠和5%濃縮膠，將待分析的蠶粗提液與上樣緩沖液等體積混合，煮沸3～5 min使蛋白變性，取20 μL樣品上樣，以溴酚藍(lán)指示，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后脫色至背景無色為止。

1.4 Western印跡分析蠶的過敏原組分

參照文獻(xiàn)[5]方法，蠶繭和蠶蛹蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后，按150 mA/板約1 h的電轉(zhuǎn)條件濕印跡至PVDF膜，TBS洗膜（5 min×3次），用30 g/L的BSA于4℃封閉過夜，與蠶過敏患者的陽性血清（1∶50）于37℃孵育4 h，同上洗滌后加入羊抗人IgE-HRP（1∶500）酶標(biāo)二抗，37℃孵育2 h，用DAB顯色，顯色條帶與蛋白標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，確定其相對(duì)分子質(zhì)量。以正常人血清為陰性對(duì)照，鑒定蠶過敏的蛋白組分。

2 結(jié)果

2.1 蠶粗提液的蛋白濃度測定

BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。用分光光度計(jì)測得蠶蛋白粗提液的D595nm值為0.371，根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出蠶蛋白粗提液的濃度為0.828 mg/ mL。

圖1 BSA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 SDS-PAGE分析蠶粗提液的蛋白組分

蠶粗提液的SDS-PAGE結(jié)果見圖2，蛋白條帶清晰，蠶繭和蠶蛹的蛋白Mr分布為14×103～97× 103。其中蠶繭可辨條帶有8條，其Mr為18×103、27×103、30×103、38×103、42×103、44×103、51×103和58×103；蠶蛹蛋白主帶有6條，其Mr為23×103、27× 103、30×103、33×103、38×103和51×103。

2.3 Western印跡分析蠶的過敏原

蠶蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后用蠶絲過敏患者陽性血清及健康人陰性血清進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果見圖3。蠶繭、蠶蛹與2份陽性患者血清均出現(xiàn)印跡條帶，其中蠶繭蛋白與①號(hào)患者在Mr為18× 103、30×103、42×103、44×103和51×103附近有印跡帶，主帶為30×103和51×103，與②號(hào)患者僅在Mr為51×103附近有印跡帶；蠶蛹蛋白與①號(hào)患者在Mr為30×103、44×103和51×103附近有印跡帶，與②號(hào)患者在Mr為30×103和51×103附近有印跡帶，主帶均為30×103。而蠶繭、蠶蛹蛋白與混合陰性對(duì)照血清反應(yīng)均沒有出現(xiàn)印跡條帶。

圖2 家蠶蛋白粗提液的SDS-PAGE

圖3 免疫印跡分析蠶繭和蠶蛹的過敏原

3 討論

目前國內(nèi)外對(duì)蠶過敏的研究主要圍繞蠶絲過敏開展，對(duì)蠶蛹及蠶分泌物的過敏研究較少。深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所曾對(duì)蠶蛹變應(yīng)原做過相關(guān)研究，分離到蠶蛹Mr為27×103～ 138×103的17種蛋白質(zhì)組分，并采用Western印跡鑒定到Mr分別為30×103、79×103及82×103的蠶蛹變應(yīng)原，其中30×103是蠶蛹的主要變應(yīng)原[6]。該團(tuán)隊(duì)還對(duì)義蠶、Ⅰ～Ⅴ齡蠶進(jìn)行過敏原分析，發(fā)現(xiàn)Mr為79×103和82×103的蛋白是蠶的特異性變應(yīng)原，而Ⅴ齡蠶比其他各齡蠶多出30×103的致敏條帶，提示隨著生長階段的不同，蠶的致敏成分會(huì)發(fā)生一定的改變[7]。雖然研究方法類似，但本研究與其結(jié)果不盡一致，這可能與家蠶品系、蠶過敏患者的個(gè)體差異及實(shí)驗(yàn)方法等有關(guān)。本研究選用未經(jīng)任何加工的廢蠶繭代表導(dǎo)致接觸性過敏的蠶絲，蠶蛹代表蠶食入性過敏材料，但因蠶這種完全變態(tài)的昆蟲在整個(gè)生活周期所產(chǎn)生的分泌物都可能存在交叉反應(yīng)，故本研究選取蠶繭和蠶蛹做材料并不能完全如實(shí)地反映蠶過敏。

本研究采用的顯色條件直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至在PVDF膜上的印跡條帶會(huì)隨著膜的干濕程度不同而有較大差別，這給拍照保留結(jié)果帶來干擾。另外在確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量上用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品不同，或電泳條件不同都會(huì)影響后續(xù)結(jié)果。本研究盡可能地兼顧不同方面的要求以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

由于臨床上蠶過敏患者較少，血清樣本收集有一定難度。本研究只收集到2例蠶過敏患者血清，分別用蠶繭和蠶蛹蛋白與血清反復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果重復(fù)性好。用健康人血清做陰性對(duì)照試驗(yàn)，Western印跡結(jié)果初步揭示了家蠶過敏原的Mr為30×103和51×103。這與Wen等[8]報(bào)道的蠶絲提取物Mr為21×103～95×103范圍有蛋白條帶，蠶絲過敏者血清集中與Mr為35.1×103～50×103的單一蛋白帶結(jié)合這一結(jié)果較接近。北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科實(shí)驗(yàn)室用免疫印跡法證實(shí)血清IgE-Sw識(shí)別的蛋白帶主要是Mr為35.1×103～50×103和21.9×103以下[9]。本研究鑒定的家蠶主要變應(yīng)原是Mr為30× 103和51×103的組分，其中30×103組分與上述多方研究較一致，可為吸入性過敏癥的脫敏治療及哮喘病的預(yù)防提供試驗(yàn)依據(jù)。

高純度的蠶類過敏原標(biāo)準(zhǔn)品有利于蠶過敏性疾病的診斷及治療。目前臨床上使用的蠶過敏原的粗浸液因取材和提取方法的不同其有效成分存在較大的批間差異，用其進(jìn)行皮試診斷亦存在一定的風(fēng)險(xiǎn)?？紤]到繅絲時(shí)的高溫會(huì)破壞絲膠蛋白，故本實(shí)驗(yàn)浸提蠶過敏原的材料選擇了未經(jīng)任何加熱處理的種繭。目前家蠶基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究已開展，確定蠶過敏基因并進(jìn)行蛋白表達(dá)，用純化的過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品替代蠶粗提液，有望提高診斷的特異性，減少治療的副作用。

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Identification of the Allergens of Silkworms

MAO Lu-Tian*,YUAN Yu-Yi,CONG Shu-Jie
Department of Life Science,College of Huizhou,Huizhou 516007,China

Objective:To identify the allergen composition in silkworms.Methods:The total proteins of silk?worm cocoon and silkworm chrysalis were extracted with PBS,and they were analyzed by SDS-PAGE,and West?ern blotting to find the allergen composition.Results:The Mrof main protein in silkworm cocoon were about 18× 103,27×103,30×103,38×103,42×103,44×103and 51×103.and Mrof main protein in silkworm chrysalis were about 23×103,27×103,30×103,33×103,38×103and 51×103.The main detected allergic protein in silkworm cocoon and silkworm chrysalis were about 30×103and 51×103.Conclusion:There were common allergens in silkworm co?coon and silkworm chrysalis.The study can provide experiment basis for desensitization treatment of inhalant aller?gy and asthma prevention.

silkworms;allergen;SDS-PAGE;Western blotting

R392.1

A

1009-0002（2017）02-0141-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.015

2016-10-13

惠州市科技計(jì)劃（2006P45）；惠州學(xué)院校立項(xiàng)目（C206·0209）

毛露甜（1972-），女，副教授，碩士

毛露甜，（E-mail）mlt@hzu.edu.cn

*Corresponding anthor,E-mail:mlt@hzu.edu.cn