李娜，李紹民，張寧，王加志，陳景華

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002

莫諾苷對人惡性黑色素瘤細胞增殖及凋亡的調(diào)控機制

李娜1，李紹民2，張寧1，王加志1，陳景華1

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002

目的：探究莫諾苷對人惡性黑色素瘤細胞A375增殖及凋亡的影響及作用機制。方法：將莫諾苷作用于A375細胞，采用MTT法測定細胞活力，Annexin-FITC/PI雙染色流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，Western印跡檢測細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達水平。結(jié)果：與空白對照組比較，順鉑陽性藥和高中低濃度莫諾苷均能明顯抑制細胞增殖（P＜0.01），明顯下調(diào)周期蛋白D1和凋亡因子Bcl-2的表達水平（P＜0.01或P＜0.05），明顯上調(diào)P21和促凋亡因子Bax的表達水平（P＜0.01）。結(jié)論：莫諾苷能抑制人惡性黑色素瘤細胞增殖和促進其凋亡，其機制可能是通過下調(diào)周期蛋白D1和Bcl-2蛋白的表達水平，上調(diào)P21和Bax蛋白的表達水平，調(diào)控周期蛋白D1-CDK-P21通路及凋亡通路，從而促進惡性黑色素細胞的凋亡。

莫諾苷；人惡性黑色素瘤；細胞周期；細胞凋亡；A375細胞

［Key words］monornide;human malignant melanoma;cell cycle;cell apoptosis;A375 cell

莫諾苷是存在于山茱萸和接骨木等中藥中的環(huán)烯醚萜苷類成分[1-2]，具有抗氧化、抗凋亡、延緩衰老、抗炎[1]和抗腫瘤[3]等廣泛的藥理作用。研究表明，環(huán)烯醚萜苷類成分馬錢苷能明顯抑制黑素瘤細胞的生長[4]，推測莫諾苷也應(yīng)當具有抗黑色素瘤的潛力，其作用機制有待開發(fā)。目前細胞周期、相關(guān)周期蛋白及凋亡蛋白成為研究腫瘤發(fā)生及防治的熱點，細胞的增殖、分化、衰老、凋亡均是周期依賴性的[5]，細胞周期主要通過周期蛋白-CDK-CKI途徑調(diào)控[6]。本研究以莫諾苷為實驗用藥，以人惡性黑色素瘤細胞A375為受試細胞，以治療惡性黑色素瘤細胞的一線藥物順鉑作為陽性對照藥，從分子和細胞水平研究了人惡性黑色素瘤細胞增殖及凋亡過程中相關(guān)蛋白的變化，探索莫諾苷的作用機制，為尋找和開發(fā)抗黑素瘤的有效藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A375細胞購自上海中喬新舟公司；莫諾苷購自成都曼斯特科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；胎牛血清、MTT購自Sigma公司；胰蛋白酶購自Billab公司；HRP標記的羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HRP標記的羊抗兔、兔抗Bcl-2和兔抗Bax購自武漢博士德生物工程有限公司；順鉑和AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

HPC-150便攜式流式細胞儀購自Handyem公司；Cham1Ge15000凝膠成像儀購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；MK3型酶標儀購自上海熱電儀器有限公司；TGL-16G-C型高速臺式冷凍離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器有限公司。

1.2 配制藥液

用分析天平精密稱取莫諾苷4.01 mg，用分析純DMSO溶解配制成199.31 mmol/L的母液，吸取5 μL定容至10 mL配成0.1 mmol/L的溶液，然后用 DMEM分別稀釋至 0.01、0.001 mol/L，用0.22 μm濾膜過濾除菌，于-20℃保存。精密稱取順鉑 3.00mg，用 DMSO溶解配制成 199.6334 mmol/L的母液，吸取5 μL定容至0.1 mmol/L，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋至0.01 mmol/L，用0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。

1.3 分組及給藥處理

分為空白對照組、順鉑陽性對照組、莫諾苷組（包括高、中、低3個濃度組）。將體外培養(yǎng)的對數(shù)期A375細胞以5000/mL的密度接種于96孔板中，每孔200 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，空白組每孔加入200 μL DMEM培養(yǎng)液，陽性組加入0.01 mmol/L順鉑200 μL，高、中、低濃度給藥組分別加入0.1、0.01、0.001 mmol/L莫諾苷藥液200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔。將另一部分細胞按105/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，空白組每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)液，陽性組加入0.01 mmol/L順鉑2 mL，高、中、低濃度給藥組分別加入0.1、0.01、0.001 mmol/L莫諾苷藥液2 mL，每組設(shè)4個培養(yǎng)孔做平行對照。培養(yǎng)24 h后分別進行MTT、細胞凋亡檢測和Western印跡試驗。

1.4 細胞活性檢測

每組細胞給藥處理24 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加150 μL DMSO，恒溫搖床振蕩10～15 min使結(jié)晶物充分融解。測定各孔的D490nm值。

1.5 細胞凋亡率檢測

用緩沖液洗滌細胞，棄上清，再用緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105～5×105/mL，取195 μL細胞懸液加5 μL AnnexinⅤ-FITC，混勻，室溫孵育10 min，再用緩沖液洗滌細胞1次，用190 μL緩沖液重懸細胞，最后加10 μL PI，用流式細胞儀檢測，以未經(jīng)AnnexinⅤ-FITC和PI染色的細胞為對照。每樣本收集1.0×104細胞的熒光信號，采用Flowjo軟件分析結(jié)果。

結(jié)果判斷：AnnexinⅤ-FITC和PI雙陰性為活細胞，AnnexinⅤ-FITC陽性而PI陰性為早期凋亡細胞，AnnexinⅤ-FITC和PI雙陽性為晚期凋亡細胞，AnnexinⅤ-FITC陰性而Pl陽性為壞死細胞。

1.6 Western印跡檢測莫諾苷對周期蛋白D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

收集細胞，每孔加100 μL RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白。根據(jù)BCA試劑繪制標準曲線，測定每組樣品蛋白濃度，控制相同的上樣量。蛋白經(jīng)變性后上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，一抗孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3～4次，滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Lane 1D軟件對各組條帶灰度值進行分析，以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值的比值反映各組的差異。

1.7 統(tǒng)計處理

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析（one way ANOVA），P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 莫諾苷對A375細胞活性的影響

結(jié)果見圖1，與空白組相比，陽性組順鉑和莫諾苷高中低劑量組均能明顯抑制A375細胞的增殖（均為P＜0.01），作用強度呈劑量依賴性。提示莫諾苷與順鉑相似，都具有抑制人惡性黑色素瘤細胞的作用。

圖1 莫諾苷對A375細胞活性的影響

2.2 流式細胞術(shù)檢測莫諾苷對A375細胞凋亡率的影響

結(jié)果見表1，與空白組相比，陽性組順鉑和莫諾苷高中低劑量組均能明顯促進A375細胞的凋亡（均為P＜0.01），作用強度呈劑量依賴性。提示莫諾苷和順鉑相似，都具有促進人惡性黑色素瘤細胞凋亡的作用。

2.3 莫諾苷對A375細胞周期蛋白D1和P21表達的影響

結(jié)果見圖2，與空白對照組相比，陽性組順鉑和莫諾苷高中低劑量組均明顯上調(diào)P21蛋白的表達（均為P＜0.01），下調(diào)周期蛋白D1的表達（P＜0.01或P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩者的蛋白表達量呈劑量依賴性。提示莫諾苷和順鉑相似，都具有抑制人惡性黑色素瘤細胞周期進程的作用。

2.4 莫諾苷對A375細胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達的影響

結(jié)果見圖3，與空白對照組相比，陽性組順鉑和莫諾苷高中低劑量組均明顯上調(diào)Bax蛋白的表達（均為P＜0.01），下調(diào)Bcl-2蛋白的表達（均為P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩者的蛋白表達量變化均顯示有劑量依賴性。

表1 莫諾苷作用A375細胞后的細胞凋亡率

圖2 莫諾苷對A375細胞周期蛋白D1和P21蛋白表達的影響

3 討論

圖3 莫諾苷對A375細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

黑色素瘤惡性程度極高，占皮膚腫瘤死亡病例的極大部分，多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，發(fā)病具有隱襲性，預(yù)見性差，進展快，易發(fā)生血路和淋巴轉(zhuǎn)移，患病率逐年升高[7-8]。目前的治療手段主要集中在放療、化療和手術(shù)治療等，因此開發(fā)有效藥物、有效途徑、有效方法至關(guān)重要。

研究證實，來自山茱萸的環(huán)烯醚萜苷類成分馬錢苷具有抑制人惡性黑色素瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的作用[4]。作為一種從中藥山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷類活性成分，莫諾苷是否與馬錢苷有類似藥理作用，值得探究。

本研究表明莫諾苷對人惡性黑色素細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用，且功效與劑量呈正相關(guān)，表明莫諾苷具有抗人惡性黑色素瘤細胞的作用，其作用機制可能是對細胞周期和凋亡機制共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。

國內(nèi)外研究均表明，惡性黑色素瘤是由于黑色素細胞無限制的分裂和增殖不可控制引起的，細胞周期調(diào)節(jié)是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，細胞周期由細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶（CDK）和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）調(diào)節(jié)，即周期蛋白-CDK-CKI途徑，以CDK為核心，通過周期蛋白的正向調(diào)節(jié)和CKI的負向調(diào)節(jié)使細胞周期協(xié)調(diào)平衡[9-10]，一旦平衡被打破，細胞就會無限增殖導(dǎo)致癌變。調(diào)節(jié)細胞周期G1/S期主要的細胞周期蛋白是D1[11]，沈立軍[12]等發(fā)現(xiàn)上調(diào)ERα和下調(diào)ERβ可使周期蛋白D1過度表達，導(dǎo)致甲狀腺上皮細胞失控增殖進而引發(fā)癌癥。茹藝[13]等發(fā)現(xiàn)周期蛋白D1的過度表達能促進賁門癌的發(fā)生發(fā)展。所以周期蛋白D1的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。P21為CKI家族成員，是一種廣泛的激酶抑制劑，能抑制周期蛋白D1的活性，導(dǎo)致細胞周期停滯，阻斷細胞的增殖過程，對細胞生長起負調(diào)控作用[14]。P21的低表達使得其對細胞周期的抑制作用減弱，使腫瘤細胞的失控增殖有了可能。本研究顯示，與空白對照組比較，莫諾苷能明顯降低周期蛋白D1的表達，升高P21的表達，從而抑制細胞的增殖。

細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]，許多抗腫瘤藥都通過誘導(dǎo)凋亡達到治療目的。作為調(diào)節(jié)凋亡的2個典型蛋白，Bcl-2和Bax在受到相關(guān)上游信號刺激時會通過聚體的方式調(diào)節(jié)凋亡。Bcl-2和Bax的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。王紅梅[16]等發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過升高Bax的表達、降低Bcl-2的表達，促進惡性黑色素瘤細胞的凋亡。黨文軍[4]等發(fā)現(xiàn)馬錢苷也能上調(diào)Bax表達、下調(diào)Bcl-2表達，促進黑色素瘤細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，莫諾苷能劑量依賴性地升高Bax的表達，降低Bcl-2的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，莫諾苷可能是通過調(diào)節(jié)周期蛋白D1-CDK-P21途徑，影響人惡性黑色素瘤細胞的細胞周期，降低Bcl-2和升高Bax的表達，從而促進人惡性黑色素瘤細胞A375凋亡，發(fā)揮抗腫瘤的機制。

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Proliferation and Apoptosis Regulatory Mechanism of Mor?roniside on Human Malignant Melanoma Cells

LI Na1,LI Shao-Min2,ZHANG Ning1,WANG Jia-Zhi1,CHEN Jing-Hua1*
1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040;2.First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007;China

Objective:To investigate the effects of morroniside on proliferation and apoptosis mechanism of hu?man malignant melanoma cells.Methods:Morroniside was applied to A375 cells,and then cell proliferation was determined by MTT assay,cell apoptosis rate was detected by Annexin-FITC/PI double staining flow cytometry.Cy?clin D1,P21,Bcl-2 and Bax protein were examined by Western blotting.Results:Compared with blank control group,cisplatin-positive control group and different concentration of monornide group inhibited cell proliferation（P＜0.01）.Cyclin D1 and Bcl-2 was down-regulated（P＜0.01 or P＜0.05）,and P21 and Bax protein was up-regulated by cisplatin-positive controlgroup and differentconcentration ofmonornide group（P＜0.01）.Conclusion: Monornide significantly inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis,which may be associated with regula?tion of cyclin D1-CDK-P21 pathway by decreasing cyclin D1 and Bcl-2,and apoptosis pathway by improving P21 and Bax.

Q25

A

1009-0002（2017）02-0128-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.012

2016-10-31

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12521501）

李娜（1984-），女，碩士研究生

陳景華，（E-mail）734521616@qq.com

*Corresponding anthor,E-mail:734521616@qq.com