錢偉明，姜協(xié)，邵榮，薛劍，王鵬

1.江蘇省常州市武進中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 武進 213003；2.軍事醫(yī)學科學院 附屬醫(yī)院，北京 100071

BRAFV600E基因檢測對良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價值

錢偉明1，姜協(xié)1，邵榮1，薛劍2，王鵬1

1.江蘇省常州市武進中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 武進 213003；2.軍事醫(yī)學科學院 附屬醫(yī)院，北京 100071

目的：探討B(tài)RAFV600E基因檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)中的診斷價值，評估其診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的應用價值。方法：選取2015年1～12月江蘇省常州市武進中醫(yī)醫(yī)院收治的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，入院后測定BRAFV600E基因表型，采用細針穿刺細胞學（FNAC）檢測其性質(zhì)，采用手術(shù)組織病理學對患者甲狀腺結(jié)節(jié)進行良惡性鑒別，分析BRAFV600E基因與良惡性結(jié)節(jié)的相關(guān)性，評估其對于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的指導價值。結(jié)果：共入組甲狀腺結(jié)節(jié)患者92例，其中惡性65例；多因素分析表明BRAFV600E基因突變與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)呈相關(guān)性（P＜0.01），OR為44.42（95%CI：5.66～348.44）；BRAFV600E基因突變預測其惡性甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生的敏感性和特異性分別為63%（95%CI：0.50～0.74）和96%（95%CI：0.79～0.99）。結(jié)論：BRAFV600E突變與甲狀腺癌的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，其能顯著提高良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。

BRAFV600E基因；甲狀腺結(jié)節(jié)；診斷價值

甲狀腺結(jié)節(jié)是指各種原因?qū)е碌募谞钕賰?nèi)出現(xiàn)一個或多個結(jié)構(gòu)異常團塊，臨床發(fā)生率逐年升高[1]。由于良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)兩者間并沒有特征性的差異征象，因而目前在臨床上還沒有無創(chuàng)檢測標志物可以對二者進行鑒別。細針穿刺細胞學（fine-needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）檢查是目前判定甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)最為常用的檢查方法[2]。但由于細針穿刺時所獲得的結(jié)節(jié)標本量少，且診斷依賴于操作醫(yī)師及病理醫(yī)師的經(jīng)驗，因而仍有較高的假陽性率和假陰性率，嚴重影響診斷的準確度，限制了其臨床的更廣泛應用。

小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-raf mu?rine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因位于人染色體7q34，包含18個外顯子，編碼相對分子質(zhì)量約94×103的蛋白質(zhì)，包含783個氨基酸殘基，屬于絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶類[3]。研究表明，BRAFV600E基因突變與甲狀腺癌的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)[3-4]，但是BRAFV600E基因檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)中的診斷價值尚缺乏臨床證據(jù)，其與臨床常用的FNAC聯(lián)合診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的應用價值尚待進一步研究證實。

在此，我們檢測了甲狀腺結(jié)節(jié)患者中BRAFV600E基因的突變水平，旨在討論其在甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷方面的診斷與應用價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2015年1～12月江蘇省常州市武進中醫(yī)醫(yī)院的甲狀腺結(jié)節(jié)患者92例。所有患者均行FNAC及手術(shù)切除甲狀腺結(jié)節(jié)，其中男性23例、女性69例，均無高血壓、冠心病、肝腎功能障礙、精神異常及長期應用藥物及其他腫瘤病史。年齡為26～67歲，平均43.38歲，甲狀腺結(jié)節(jié)大小1.2～2.8 cm。

1.2 FNAC穿刺方法及細胞學診斷標準

1.2.1 FNAC穿刺方法 患者排除細針穿刺術(shù)禁忌癥，術(shù)前簽署知情同意書。取仰臥位，使其肩部墊高約15°～30°，充分暴露頸前區(qū)。超聲波定位穿刺點，消毒，鋪無菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，使用一次性穿刺活檢針，在超聲波引導下沿預定針道進入結(jié)節(jié)中心，每個結(jié)節(jié)穿刺3針，標本涂片3～4張，95%乙醇固定。

1.2.2 細胞學分類 所有入組病例均獲得細胞學診斷，按照甲狀腺細胞病理分類標準［①無法診斷；②良性病變；③不能明確意義的濾泡病變或不典型病變；④濾泡性或嗜酸性腫物；⑤可疑惡性；⑥惡性］，本研究將⑤、⑥統(tǒng)一歸類為細胞學陽性，將①～④歸類為細胞學陰性[5-6]。

1.3 BRAFV600E基因突變檢測

采用熒光PCR法檢測BRAFV600E基因，血液基因組提取試劑盒由天根生化科技公司提供，檢測試劑盒為北京華邁生物科技公司生產(chǎn)的人類BRAFV600E基因突變熒光PCR檢測試劑盒。取500 μL EDTA抗凝靜脈血，提取基因組DNA?；蚪MDNA濃度為20～200 ng/μL，DNA的D260nm/D280nm為1.7～2.0。利用熒光定量PCR儀對熒光信號強度進行檢測，計算ΔCt值（ΔCt值=突變檢測Ct值-質(zhì)控檢測Ct值），結(jié)果定性分析。若ΔCt≥28，樣本為陽性；若ΔCt＜28，樣本為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以x±s表示，通過t檢驗分析；計數(shù)資料通過卡方檢驗分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者BRAFV600E基因突變類型比較

共入組92例甲狀腺結(jié)節(jié)患者，所有患者均經(jīng)手術(shù)切除。術(shù)后病理結(jié)果示：惡性65例，其中乳頭狀癌63例、濾泡狀癌2例；良性27例，全部為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，其中3例伴局部濾泡上皮異性增生。根據(jù)手術(shù)切片病理結(jié)果，將患者分為惡性組與良性組，比較2組間BRAFV600E基因突變比例。同時對可能的甲狀腺結(jié)節(jié)的相關(guān)危險因素進行分析，比較了2組間年齡、性別、糖代謝能力（糖代謝異常包括糖尿病前期和2型糖尿?。⒔Y(jié)節(jié)數(shù)、累積腺葉情況、結(jié)節(jié)回聲結(jié)構(gòu)及FNAC穿刺結(jié)果。見表1。

2.2 BRAFV600E基因突變類型與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的多因素分析

多因素logistic回歸分析顯示BRAFV600E基因突變與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)呈相關(guān)性（P＜0.01），是惡性甲狀腺結(jié)節(jié)高危患者的獨立危險因素（OR= 44.42；95%CI：5.66～348.44）。同時，甲狀腺結(jié)節(jié)回聲結(jié)構(gòu)也是良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的可能危險因素，其囊性回聲結(jié)節(jié)與混合性回聲結(jié)節(jié)均提示其良性甲狀腺結(jié)節(jié)的可行性，結(jié)節(jié)為實性結(jié)構(gòu)的患者惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的風險增加3.2倍（OR=3.23；95%CI：2.36～5.27）。見表2。

2.3 BRAFV600E基因突變診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的敏感性與特異性

對BRAFV600E基因突變預測其后甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性程度的敏感性與特異性進行了分析。所有入組患者中，BRAFV600E基因突變預測其惡性甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生的敏感性和特異性分別為63%（95% CI：0.50～0.74）和96%（95%CI：0.79～0.99）。與臨床目前常用的細針穿刺相比，其診斷特異性顯著升高。不僅如此，本研究表明基因檢測聯(lián)合穿刺檢測能顯著提高其診斷敏感性（77%，95%CI：0.65～0.86）與特異性（0.96，95%CI：0.79～0.99），見表3。

表1 良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者臨床資料比較

表2 BRAFV600E基因突變與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的多因素分析

表3 不同檢查方式診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的敏感性與特異性

3 討論

隨著影像學檢查和超聲波檢查的普及與廣泛應用，無癥狀甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生率明顯增多。甲狀腺炎癥、增生及良惡性腫瘤等多種疾病均可表現(xiàn)為甲狀腺結(jié)節(jié)，不同發(fā)病原因所致的甲狀腺結(jié)節(jié)其處理方式截然不同，惡性結(jié)節(jié)應盡早行外科手術(shù)處理，良性結(jié)節(jié)可保守內(nèi)科治療[1,7]。因此，對甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別是其后續(xù)治療的基礎(chǔ)與前提。

然而，良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)缺乏特征性的差異表現(xiàn)，二者在臨床上尚無直接有效的鑒別手段。既往研究表明，性別、年齡、糖代謝能力，以及結(jié)節(jié)的超聲波特征如結(jié)節(jié)數(shù)、累及腺葉、結(jié)節(jié)回聲結(jié)構(gòu)等因素為甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的相關(guān)危險因素[4,8]。本研究結(jié)果表明，除甲狀腺結(jié)節(jié)超聲波回聲結(jié)構(gòu)外，其他因素在良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別中均沒有統(tǒng)計差異，意味著僅僅根據(jù)患者病例特征和結(jié)節(jié)超聲波特點無法對良惡性結(jié)節(jié)進行有效鑒別。

本研究結(jié)果表明BRAFV600E突變與甲狀腺癌的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，其能顯著提高良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。BRAFV600E基因突變是目前研究最為深入的甲狀腺癌基因突變類型。BRAFV600E基因位于人染色體7q34，既往研究證實其突變大多位于第1799位點，BRAFFT1799A（V600E）位點與RAS蛋白結(jié)合后發(fā)生谷氨酸至纈氨酸的點突變，因而引起了MAPK通路中REK和MEK的腫瘤基因的級聯(lián)激活反應[4,9]。另一項多中心臨床研究表明[5-6]，BRAFV600E突變與甲狀腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯、癌癥復發(fā)及甲狀腺癌Ⅲ、Ⅳ期明顯相關(guān)。隨后很多研究也證實BRAFV600E突變與甲狀腺乳頭狀癌的復發(fā)顯著相關(guān)[10-13]。不僅如此，BRAFV600E突變與復發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌的放射性碘親和性降低有一定的相關(guān)性，其可能與放射性碘治療效果不佳有關(guān)[14]。BRAFV600E突變可導致甲狀腺癌的侵襲性增加，最終使甲狀腺癌治療失敗。BRAFV600E突變也能導致很多促腫瘤分子的過表達，如VEGF、MET等[15]。本研究入組92例患者中，僅有1例突變術(shù)后病理未達診斷標準，提示BRAFV600E突變對于惡性甲狀腺結(jié)節(jié)有高度的特異性。既往文獻表明，BRAFV600E基因突變是甲狀腺乳頭狀癌形成的重要環(huán)節(jié)，在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。但是獨立的BRAFV600E突變檢測的敏感性低于FNAC，獨立檢測也難以滿足臨床需求。

FNAC是目前甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)判定最為常用的檢查方法，也是術(shù)前評估甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性敏感性和特異性較高的方法。有研究入組了數(shù)百名甲狀腺結(jié)節(jié)患者，比較其FNAC與術(shù)后組織病理檢查的差異，F(xiàn)NAC的假陽性率和假陰性率分別為1.9%、10.5%，敏感性和特異性分別為89.5%、98%[12]。FNAC的檢查結(jié)果多依賴于操作者的熟練程度和細胞病理學檢查水平的要求。本研究入組的92例患者中共有16例甲狀腺癌（15例乳頭狀甲狀腺癌，1例濾泡狀癌）患者被診斷為良性，考慮細針穿刺時未取得結(jié)節(jié)中惡性病變部位所致可能，計算其單獨FNAC穿刺鑒別良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的敏感性為74%，特異性為78%。因此，不可否認，單獨采用FNAC作為鑒別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的檢測手段缺乏可靠性。針對FNAC不能明確的甲狀腺結(jié)節(jié)的問題，很多學者提出通過檢測甲狀腺組織或甲狀腺細針穿刺樣本中的甲狀腺癌分子標志物來明確診斷。

本研究將BRAFV600E與FNAC聯(lián)合進行良惡性診斷的預測，其結(jié)果表明二者聯(lián)合診斷的敏感性與特異性為77%和96%，進一步計算診斷的陽性預測值及陰性預測值分別為98%和63%，提示聯(lián)合檢測對于甲狀腺結(jié)節(jié)患者良惡性的診斷有很強的指導意義。BRAFV600E基因突變對于惡性甲狀腺結(jié)節(jié)有高的敏感性，其有助于在FNAC穿刺細胞形態(tài)學不典型和取樣效果不佳的情況下做出有效的鑒別診斷，對細胞形態(tài)不典型和可疑時對明確腫瘤的性質(zhì)具有重要意義。

綜上所述，本研究證實BRAFV600E突變與甲狀腺癌的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，其能顯著提高良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。但BRAFV600E突變檢測的敏感性較低，獨立檢測難以滿足臨床需求。而BRAFV600E與FNAC聯(lián)合檢測可以有效識別甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的高危患者，為臨床醫(yī)生的早期治療策略提供重要依據(jù)。

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Value of BRAFV600EGenetic Testing for Diagnosis of Benign and Malignant Thyroid Nodules

QIAN Wei-Ming1,JIANG Xie1,SHAO Rong1,XUE Jian2,WANG Peng1*
1.Changzhou Wujin Chinese Medicine Hospital,Wujin 213003;2.Affiliated Hospital of Academy of Military Medi?cal Sciences,Beijing 100071;China

Objective:To evaluate the diagnostic value of the BRAFV600Egenetic testing in thyroid nodules and as?sess its value diagnosis combined with fine-needle aspiration cytology（FNAC）of benign and malignant thyroid nod?ules used in clinical.Methods:We enrolled the thyroid nodules patients treated in Wujin Chinese Medicine Hospi?tal from January to December 2015.We determinated the BRAFV600Ephenotype and FNAC after admission,using the surgical histopathology performed on patients with benign and malignant thyroid nodules.Results:A total of 92 thyroid nodules patients were enrolled,including 65 cases of malignant nodules.Multivariate results showed that the mutation of BRAFV600Eand malignant thyroid nodules were correlated,the risk increased 44.42 times（OR= 44.42,95%CI:5.66～348.44）.The mutation of BRAFV600Epredicts the occurrence of malignant thyroid nodules sen?sitivity and specificity were 63%（95%CI:0.50～0.74）and 96%（95%CI:0.79～0.99）.Conclusion:The mutation of BRAFV600E,which can significantly improve the detection of benign and malignant thyroid nodules rate incidence of thyroid cancer has a significant correlation with the incidence of thyroid cancer.

BRAFV600Egene;thyroid nodulesl;diagnostic value

R446;Q789

A

1009-0002（2017）02-0123-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.011

2016-10-09

錢偉明（1973-），男，副主任醫(yī)師

王鵬，（E-mail）wangpengwjzyyy@163.com

*Corresponding anthor,E-mail:wangpengwjzyyy@163.com