肖斌，陳麗丹，孫朝暉，廖揚(yáng)，杭建峰，陳建蕓，張蓉，李林海

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510010

代謝型谷氨酸受體4的真核表達(dá)及其在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用

肖斌，陳麗丹，孫朝暉，廖揚(yáng)，杭建峰，陳建蕓，張蓉，李林海

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510010

目的：建立代謝型谷氨酸受體4（mGluR4）在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中高表達(dá)的模型，探索mGluR4的亞細(xì)胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用。方法：提取MCF-7細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；PCR擴(kuò)增mGluR4基因；利用無(wú)縫克隆技術(shù)快速構(gòu)建以pENTER為載體的mGluR4重組表達(dá)質(zhì)粒；通過(guò)Western印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mGluR4在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)及定位；利用CCK8實(shí)驗(yàn)觀察mGluR4對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：構(gòu)建了能夠在MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)的mGluR4真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫熒光結(jié)果顯示mGluR4定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，CCK8實(shí)驗(yàn)表明高表達(dá)mGluR4顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)論：為探索mGluR4的相關(guān)功能制備了必要工具，為研究mGluR4在乳腺癌增殖中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

代謝型谷氨酸受體4；乳腺癌；真核表達(dá)；增殖

谷氨酸鹽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它通過(guò)與細(xì)胞膜表面的離子型受體（ionotropic glutamate receptors，iGluR）和代謝型受體（metabotropic glutamate receptors，mGluR）結(jié)合，調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)，引起一系列生理或病理學(xué)效應(yīng)[1]。mGluR家族屬于G蛋白偶聯(lián)受體，由8個(gè)成員組成。根據(jù)不同氨基酸序列的相似性及偶聯(lián)蛋白的類型，可將這8種亞型分為3組：Ⅰ組包括mGluR1和mGluR5，與Gq偶聯(lián)；Ⅱ組包括mGluR2和mGluR3，與Gi和Go偶聯(lián)；Ⅲ組包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8，與Gi和Go偶聯(lián)。mGluR與膜內(nèi)G蛋白偶聯(lián)，通過(guò)G蛋白介導(dǎo)的胞內(nèi)第二信使信號(hào)傳導(dǎo)，產(chǎn)生慢生理反應(yīng)，在離子通道調(diào)節(jié)、神經(jīng)元興奮與神經(jīng)遞質(zhì)釋放等方面發(fā)揮重要作用[2]。

盡管mGluR在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究已較為詳盡，但是其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制仍然不清楚。研究表明，mGluR的配體——谷氨酸鹽能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這一進(jìn)程可能與谷氨酸鹽和mGluR的結(jié)合有關(guān)[3]。在mGluR各亞型中，對(duì)mGluR5在腫瘤中的作用的研究最為詳盡。mGluR5高表達(dá)于鱗狀上皮細(xì)胞癌，抑制其表達(dá)能夠減緩腫瘤生長(zhǎng)[4]；另外，肝臟組織特異性表達(dá)mGluR5，而不表達(dá)與其同組的mGluR1。mGluR5通過(guò)MAPK/ERK通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[5]。然而，mGluR4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演的角色仍然是未知數(shù)。mGluR4是適應(yīng)性免疫的重要調(diào)節(jié)因子[6]，其基因的多態(tài)性與骨肉瘤的敏感性及發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[7-9]?；趍GluR4的前期研究報(bào)道及mGluR各亞型在多種腫瘤進(jìn)程中的作用，我們推測(cè)mGluR4可能在腫瘤增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化（北京）有限公司；pENTER真核表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；Total RNA KitⅠ購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；質(zhì)粒小抽試劑盒及2×PCR預(yù)混液購(gòu)自Biotool公司；First-Strand cDNA Syn?thesis Supermix購(gòu)自北京全式金生物有限公司；MluⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；AsiSⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自北京NEB公司；One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；X-treme?GENE HP DNA Transfection Reagent購(gòu)自Roche公司；mGluR4抗體購(gòu)自Abcam公司；抗Flag標(biāo)簽抗體、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自Bioworld公司；綠色熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗及DAPI購(gòu)自Thermo fisher公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒操作步驟從3×106MCF-7細(xì)胞中抽提總RNA；以總RNA為模板，用First-Strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒合成cDNA第一鏈［①配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA模板500 ng，Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，RT/RI酶混合液1 μL，加入無(wú)RNA酶水至總體積20 μL；②輕輕混勻，42℃孵育30 min；③85℃加熱5 s失活RT/RI酶］。

1.3 基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建策略采用最新的快速無(wú)縫克隆技術(shù)（諾唯贊公司）。首先，根據(jù)試劑盒要求設(shè)計(jì)mGluR4基因（Pubmed ID：NM_000841）的特異性上游引物（AGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCA TGCCTGGGAAGAGAGGCTTG，黑體部分為載體序列，下劃線為AsiSⅠ酶切位點(diǎn)，斜體部分為基因序列）和下游引物（CTCGAGCGGCCGCGTACGCGTGA TTGCATGGTTGGTGTAAG，黑體部分為載體序列，下劃線為MluⅠ酶切位點(diǎn)，斜體部分為基因序列）。PCR擴(kuò)增條件：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃15 s，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小并對(duì)特異性單一條帶進(jìn)行割膠回收。將純化的DNA片段與線性化的pENTER真核表達(dá)質(zhì)粒（酶切位點(diǎn)：AsiSⅠ和MluⅠ）進(jìn)行無(wú)縫克隆連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布在含卡那霉素（Kan+）的平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，利用雙酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證插入序列無(wú)誤后，質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及Western印跡

將1.2×107MCF-7細(xì)胞鋪于6孔板中的4個(gè)孔，每孔約3×106細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%的匯合度后，按照轉(zhuǎn)染步驟每孔轉(zhuǎn)入2 μg mGluR4重組質(zhì)?；蚩蛰d體，分別于24、36和48 h收集并裂解細(xì)胞（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞于24 h收集），隨后進(jìn)行SDS-PAGE（濃縮膠：80 V，30 min；分離膠：100 V，60 min；轉(zhuǎn)膜條件：恒流180 mA，140 min）。配制5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，室溫1 h；加入1∶100稀釋的mGluR4抗體，室溫孵育2 h，用TBST溶液洗膜4次，每次5 min；加入1∶10000稀釋的羊抗兔二抗（HRP標(biāo)記），室溫孵育1 h，用TBST溶液洗膜4次，每次5 min；配制ECL發(fā)光液并滴加在膜上，隨后用Sage Creation公司的化學(xué)發(fā)光成像儀（MINICHEMI）進(jìn)行顯影曝光。

1.5 免疫熒光

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟同上，區(qū)別在于須在6孔板底部放置一張蓋玻片，便于細(xì)胞爬片。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染36 h后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS清洗2次，并加入4%多聚甲醛溶液500 μL，室溫固定15 min；棄上清，用PBS清洗2次，加入500 μL 0.25%的Tri?ton X-100，室溫靜置10 min；棄上清，用PBS清洗4次，加入500 μL PBST（1%BSA，0.1%Tween，溶于PBS中）封閉30 min；棄封閉液，每孔以1∶100的比例加入mGluR4抗體，4℃封閉過(guò)夜；用PBS洗滌3次，以1∶1000的比例加入羊抗兔綠色熒光二抗，室溫避光孵育90 min；用PBS洗滌細(xì)胞3次，滴加DAPI工作液，室溫避光孵育10 min；用冰冷的PBS洗滌1次，用抗熒光淬滅封片劑封片并用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟同上，區(qū)別在于每孔分別轉(zhuǎn)染0.5、1、2、3 μg重組質(zhì)粒及0.5 μg空載體。48 h后，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代至96孔板中，每孔約1×104細(xì)胞，體積100 μL；待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK8工作液，37℃、5%CO2孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 mGluR4的基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以MCF-7細(xì)胞的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1A，擴(kuò)增出的單一條帶大小約為2700 bp，與mGluR4基因（2739 bp）相近。將該條帶進(jìn)行割膠純化，并與線性化的pENTER載體直接進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞后涂板培養(yǎng)，挑單克隆菌落振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)AsiSⅠ和MluⅠ酶切鑒定，重組質(zhì)粒被切成2段，大片段為線性化載體，小片段為插入基因mGluR4（圖1B）。質(zhì)粒送華大公司測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)序列比對(duì)后證實(shí)插入序列無(wú)誤，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 mGluR4在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)

2 μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至80%匯合度的MCF-7細(xì)胞中，空載體轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后24、36、48 h分別收集并裂解各組細(xì)胞樣本進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，一抗使用抗Flag標(biāo)簽抗體。在不同時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)到了Flag-mGluR4的表達(dá)（圖2），而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的條帶，表明重組Flag-mGluR4蛋白表達(dá)成功。

2.3 mGluR4的亞細(xì)胞定位

Gene Ontology（GO）預(yù)測(cè)mGluR4為7次跨膜蛋白，可能定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)（http://www.uni?prot.org/uniprot/Q14833#subcellular_location）。另有研究表明，mGluR4的mRNA廣泛見(jiàn)于人的丘腦、下丘腦和尾狀核，并高表達(dá)于小腦粒細(xì)胞[10]。但mGluR4在腫瘤細(xì)胞中的定位仍不清楚。為了探索mGluR4在乳腺癌細(xì)胞中的定位，我們將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，36 h后固定細(xì)胞并用抗mGluR4抗體檢測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。令人驚訝的是，mGluR4除了定位于已知的細(xì)胞膜外，還分布于細(xì)胞質(zhì)中，而對(duì)照組無(wú)熒光表明實(shí)驗(yàn)組的熒光為特異性表達(dá)（圖3）。mGluR4在乳腺癌細(xì)胞中的這種有趣的分布，為我們進(jìn)一步研究其分子機(jī)制提供了線索。

圖1 mGluR4重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2 轉(zhuǎn)染后mGluR4真核表達(dá)質(zhì)粒在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)

2.4 mGluR4在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用

為了證實(shí)mGluR4在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用，我們將不同濃度的重組質(zhì)粒（空載體0.5 μg，重組質(zhì)粒0.5、1、2、3 μg）分別轉(zhuǎn)染至6孔板中培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，48 h后將細(xì)胞傳代至96孔板中，利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果如圖4，細(xì)胞增殖活力（D450nm）隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度的增加而增強(qiáng)，并且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力顯著高于對(duì)照組。

圖3 mGluR4的亞細(xì)胞定位

圖4 mGluR4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖

3 討論

谷氨酸鹽受體是神經(jīng)信號(hào)傳遞的重要樞紐，廣泛參與神經(jīng)元調(diào)節(jié)、軸突發(fā)育及突觸可塑性形成等正常及病理狀態(tài)下的大腦神經(jīng)活動(dòng)，而mGluR是其重要的分支之一。mGluR通過(guò)胞內(nèi)段偶聯(lián)的G蛋白傳遞分子信號(hào)，激活第二信使產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝發(fā)生改變。盡管mGluR在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機(jī)制已研究得較為詳盡，但其在腫瘤，尤其是乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待發(fā)現(xiàn)。前人的一些研究為本文的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了依據(jù)：Venneti等利用正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)（PET）發(fā)現(xiàn)谷氨酸示蹤劑可以被神經(jīng)膠質(zhì)瘤吸收來(lái)輔助其生長(zhǎng)，而不會(huì)被周圍健康組織吸收[11]，這一現(xiàn)象可能與谷氨酸鹽受體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)有關(guān)[12]；而細(xì)胞分泌的谷氨酸能通過(guò)MAPK和PI3k/Akt通路促進(jìn)黑色素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[13-14]；更直接的證據(jù)表明mGluR4也可以激活MAPK/ERK通路促進(jìn)神經(jīng)元祖細(xì)胞的增殖[15]。經(jīng)過(guò)科學(xué)推測(cè)及實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們首次發(fā)現(xiàn)mGluR4能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

本研究還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即mGluR4廣泛分布于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。根據(jù)GO分析所得mGluR4的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其跨膜屬性，我們預(yù)測(cè)mGluR4可能同樣分布于一些細(xì)胞內(nèi)膜上；而mGluR4在細(xì)胞內(nèi)膜中的功能仍有待發(fā)現(xiàn)，這也是本課題組未來(lái)的研究方向之一。

總之，我們構(gòu)建并表達(dá)了mGluR4真核表達(dá)質(zhì)粒，分別利用激光共聚焦顯微鏡和CCK8試劑觀察了mGluR4的亞細(xì)胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用，這就為研究mGluR4的分子機(jī)制制備了有效的工具，為探索mGluR4在乳腺癌中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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Eukaryotic Expression of mGluR4 and its Role in the Pro?liferation of Breast Cancer Cell

XIAO Bin,CHEN Li-Dan,SUN Zhao-Hui,LIAO Yang, HANG Jian-Feng,CHEN Jian-Yun,ZHANG Rong,LI Lin-Hai*
Department of Laboratory Medicine,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guang?zhou 510010,China

Objective:To express metabotropic glutamate receptor 4（mGluR4）in breast cancer cell line MCF-7, further explore the subcellular localization and the role of mGluR4 in cell proliferation.Methods:The total RNA was extracted from MCF-7 cells and was subsequently reversed into cDNA,and from which,mGluR4 gene was amplified by PCR.Recombinant mGluR4 expression plasmid was constructed using one step cloning kit.Western blotting and immunofluorescence assays were applied to detect the expression and localization of mGluR4 respec?tively.The effect of mGluR4 on the proliferation of MCF-7 was also measured.Results:The mGluR4 was local?ized in the cytoplasm and membrane of MCF-7 cells.The expression of mGluR4 could significantly enhance the proliferation of breast cancer cells.Conclusion:This research will provide a useful tool for studying the function of mGluR4 and lay the foundation of the molecular mechanism of mGluR4 in the proliferation of breast cancer.

metabotropic glutamate receptor 4;breast cancer;eukaryotic expression;proliferation

Q78

A

1009-0002（2017）02-0109-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.008

2016-09-29

2015年廣州市科創(chuàng)委項(xiàng)目（201604040003）

肖斌（1986-），男，博士

李林海，（E-mail）mature303@126.com

*Corresponding anthor,E-mail:mature303@126.com