曹陽(yáng)，韓營(yíng)營(yíng)，李杰，闞飆，閆梅英

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

沙門菌常見(jiàn)O抗原和H抗原熒光PCR檢測(cè)方法評(píng)估

曹陽(yáng)，韓營(yíng)營(yíng)，李杰，闞飆，閆梅英

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

目的：評(píng)估沙門菌常見(jiàn)A～F血清群O抗原和H抗原熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)不同血清型沙門菌的檢測(cè)效果。方法：選用不同血清型沙門菌制備模板，運(yùn)用沙門菌O抗原A～F群及不同H抗原熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)這些菌株進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，分別計(jì)算不同血清型檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、特異度、檢測(cè)下限、假陽(yáng)性率、假陰性率、Kappa值等指標(biāo)并進(jìn)行分析。結(jié)果：對(duì)7種不同沙門菌O抗原的檢測(cè)靈敏度為85.71%～100.00%，特異度為66.67%～100.00%；對(duì)7種不同沙門菌H抗原的檢測(cè)，H1,5及Hi-l的靈敏度不高，分別為35.71%及57.14%，但特異度均較高（87.50%～100.00%）；經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)，除H1,5陽(yáng)性檢測(cè)的P＞0.05（P=0.162），其余為P＜0.05；C1、C2、D1、E、F血清群及H抗原1,6、1,7、g,s,t、g,m的檢測(cè)結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性較高（Kappa值均大于0.75），而H1,5及Hi-l的檢測(cè)結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性很差（Kappa值分別為0.302及0.492）；試劑盒對(duì)不同O/H抗原核酸檢測(cè)擴(kuò)增效率較好，最低檢出限為7～137608拷貝/反應(yīng)。結(jié)論：除H1,5抗原外，該熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)沙門菌O/H抗原不同血清型的檢測(cè)效果較好，優(yōu)于傳統(tǒng)血清凝集方法，可顯著提高血清型鑒定時(shí)效，有利于疾病或暴發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)。

沙門菌；血清型；O抗原；H抗原；熒光PCR

沙門菌是常見(jiàn)的引起食源性疾病的致病菌。2007年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)2610種血清型的沙門菌[1]。至2006年，我國(guó)也已檢出近300種沙門菌血清型[2]。傳統(tǒng)的血清型鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于及時(shí)進(jìn)行疾病暴發(fā)時(shí)追蹤傳染源以及分析比較菌株間的差異。目前已有很多關(guān)于沙門菌血清型鑒定的方法學(xué)研究，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、核酸探針技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)方法，可對(duì)沙門菌進(jìn)行較為快速的鑒定[3-5]。但是，投入使用的商品化的沙門菌血清型檢測(cè)試劑盒較少，且現(xiàn)有的針對(duì)沙門菌血清型檢測(cè)的研究，一次可以鑒定出的血清型種類有限，多集中于腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌或傷寒沙門菌及副傷寒沙門菌中1種或2～3種血清型的鑒定[6-7]。天津芯片技術(shù)有限責(zé)任公司研發(fā)的沙門菌O抗原A～F不同血清群及7種常見(jiàn)H抗原不同血清型核酸擴(kuò)增（PCR-熒光探針?lè)ǎz測(cè)試劑盒（以下簡(jiǎn)稱沙門O/H抗原核酸檢測(cè)試劑盒）可分別同時(shí)檢測(cè)7種沙門菌O抗原和7種H抗原。該試劑盒采用Taq?Man熒光探針技術(shù)，利用沙門菌O抗原及H抗原不同血清型特異的熒光探針與靶核酸雜交，通過(guò)熒光PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)時(shí)判斷沙門菌屬O抗原及H抗原的型別。但該檢測(cè)試劑盒用于沙門菌血清型的判定效果如何，尚無(wú)實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。本研究中，我們利用傳統(tǒng)血清凝集鑒定的不同血清型菌株，對(duì)該試劑盒的特異性、敏感性進(jìn)行了評(píng)估，為其進(jìn)一步推廣應(yīng)用及完善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株選擇

根據(jù)O抗原A～F群血清型及7種常見(jiàn)H抗原，隨機(jī)挑選252株不同血清型菌株進(jìn)行試驗(yàn)，包括腸炎沙門菌、山夫登堡沙門菌、甲型副傷寒沙門菌等34種血清型（表1），每種抗原測(cè)試菌株平均為18株，其中含特異性靶抗原的菌株10株、非特異性菌株8株。實(shí)驗(yàn)用菌株來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所腹瀉病室，均采用API 20E試劑條及血清凝集試驗(yàn)進(jìn)行了確認(rèn)。沙門菌抗血清購(gòu)自丹麥國(guó)家食品研究所并在有效期內(nèi)使用。

1.2 引物信息

依據(jù)O抗原及H抗原編碼基因的可變區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針，具體引物及探針信息涉及商業(yè)機(jī)密，故在此不做詳細(xì)表述。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 模板制備 采用熱裂解法。挑取單個(gè)純菌培養(yǎng)的新鮮菌落于100 μL純水中，制成懸濁液，100℃煮沸10 min，冰浴10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清作為反應(yīng)模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熒光PCR 采用沙門菌O抗原A～F（A、B、C1、C2、D1、E、F）不同血清型核酸擴(kuò)增（PCR-熒光探針?lè)ǎz測(cè)試劑盒及沙門菌H抗原7種（1,5、1,6、1,7、i-l、g,s,t、g,m、f,g）常見(jiàn)不同血清型核酸擴(kuò)增（PCR-熒光探針?lè)ǎz測(cè)試劑盒（天津芯片有限公司研發(fā)且在有效期內(nèi)使用）進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體包括：配制25 μL反應(yīng)體系，其中模板量為1 μL，酶0.3 μL（廠家提供），反應(yīng)所需引物及反應(yīng)緩沖液均由廠家制備成凍干粉，使用時(shí)溶于23.7 μL超純水中。采用CFX96熒光PCR儀（擴(kuò)增條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)）。Ct值＜33判為陽(yáng)性結(jié)果，Ct值＞35為陰性結(jié)果。如果33≤Ct值＜35，則復(fù)檢2次：若Ct值無(wú)，判為陰性結(jié)果；若其中至少1次Ct值＜35，判為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.3 細(xì)菌總DNA的提取及檢測(cè)下限測(cè)定 每種O抗原及H抗原選取1株代表菌株，從平板上挑取單克隆，在LB液體中培養(yǎng)6～8 h，至D600nm值約為0.6時(shí)收集菌體，用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega公司）提取細(xì)菌總DNA，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)提取的總DNA測(cè)定濃度后，進(jìn)行1∶10及1∶3梯度稀釋，不同濃度梯度各取1 μL作為熒光PCR檢測(cè)模板，測(cè)定該試劑盒檢測(cè)下限或敏感度。以模板DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別計(jì)算試劑盒中7種沙門O抗原及7種沙門H抗原對(duì)沙門血清型檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、特異度、假陽(yáng)性率、假陰性率，并用χ2檢驗(yàn)、McNemar檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；計(jì)算Kappa值以評(píng)價(jià)與血清凝集結(jié)果的一致性，本研究按照一般規(guī)則，認(rèn)為Kappa值大于0.75一致程度較好，小于0.5一致程度較差。

2 結(jié)果

2.1 O/H抗原不同血清型核酸擴(kuò)增效果評(píng)估

利用252株沙門菌，以血清凝集結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分別評(píng)估沙門O抗原及H抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)不同沙門血清型的鑒定效果（表2），其中O抗原共進(jìn)行136個(gè)檢測(cè)反應(yīng)（含7個(gè)陽(yáng)性對(duì)照及相應(yīng)的空白對(duì)照），H抗原共進(jìn)行162個(gè)檢測(cè)反應(yīng)（含7個(gè)陽(yáng)性對(duì)照及相應(yīng)的空白對(duì)照）。7種不同沙門菌O抗原檢測(cè)的靈敏度不同，但均較高，其中C1、C2、E、F的靈敏性均高達(dá)100.00%，次之為D1群（90.91%），最低為B群（80.00%）。不同O抗原檢測(cè)的特異度也不同，最低為A群（66.67%），最高為E群，達(dá)100.00%。在7種不同沙門氏菌H抗原的檢測(cè)中，H1,5的靈敏度最低，僅為35.71%，次之為Hi-l相（靈敏度為57.14%），但H抗原檢測(cè)的特異度均較高，特異度為87.50%～100.00%（表2）。經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)，除H1,5抗原檢測(cè)的P＞0.05（P=0.162），其余為P＜0.05。O抗原C1、C2、D1、E、F群及H1,6、1,7、g,s,t、g,m的檢測(cè)結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性較高（Kappa值均大于0.75），但H1,5及Hi-l的檢測(cè)結(jié)果與血清凝集結(jié)果的一致性很差（Kappa值分別為0.302及0.492）。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株信息

表2 沙門菌O/H抗原不同血清型核酸擴(kuò)增效果評(píng)估

2.2 純菌樣本中O/H抗原核酸擴(kuò)增檢測(cè)下限測(cè)定

將提取的純DNA以1∶3梯度稀釋5個(gè)濃度，以此為模板檢測(cè)沙門O/H抗原核酸檢測(cè)試劑盒反應(yīng)的敏感性。以模板DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表3）。R2值均大于0.9，說(shuō)明擴(kuò)增效率均較高，但針對(duì)不同抗原，其擴(kuò)增效率存在差異。如沙門菌H1,6群血清型（圖1）及O：B群血清型（圖2）的擴(kuò)增效果最好，次之為Hg,m、H1,7，Hf,g擴(kuò)增效率相對(duì)最低（圖譜未展示）。另外，不同O/H抗原核酸檢測(cè)最低檢出限亦不同（表4）。對(duì)沙門菌O:B群血清型檢測(cè)的敏感性最高，最低檢測(cè)下限為0.004 fg/μL，約7個(gè)拷貝/反應(yīng)。其次為沙門菌O：C2、D1、E及H：i-l、g,m，檢測(cè)下限平均約0.05 fg/ μL，約92個(gè)拷貝/反應(yīng)。對(duì)沙門菌O：A群及Hf,g群血清型檢測(cè)的敏感性較差，平均約0.05 ng/μL，約9200個(gè)拷貝/反應(yīng)。

表3 純菌樣本中O/H抗原不同血清型核酸擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

圖1 沙門菌H1,6群血清型檢測(cè)擴(kuò)增曲線（A）及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（B）

表4 純菌樣本中O/H抗原不同血清型核酸擴(kuò)增最低檢出限

3 討論

O抗原和H抗原作為沙門菌的主要抗原，用于沙門菌的血清學(xué)分型。具有共同O抗原的各血清型沙門菌歸為一群，再根據(jù)H抗原的差異分為不同的血清型[8]。A～F群血清型，尤其是A、B、C1、C2、D1、E、F群沙門菌為臨床常見(jiàn)，涵蓋我國(guó)前50位沙門菌血清型，其中B群的鼠傷寒、C群的豬霍亂和D群的腸炎沙門菌是引起食物中毒最常見(jiàn)的病原體[9]。在A～F群沙門菌中，H抗原多種多樣，但其中7種（1,5、1,6、1,7、i-l、g,s,t、g,m、f,g）占全部已有A～F群沙門菌血清型的53%左右。通過(guò)引物及探針篩選，最終建立了檢測(cè)7種O群（A～F群）抗原及7種H抗原的沙門菌熒光PCR試劑盒，使我們?cè)诿鎸?duì)沙門菌感染暴發(fā)尤其是食物中毒來(lái)源的沙門菌時(shí)，運(yùn)用該試劑盒可以同時(shí)判定這些菌株所具有的O抗原及H抗原，大致了解該暴發(fā)中的優(yōu)勢(shì)血清型，在此基礎(chǔ)上，輔助少量、小范圍、有針對(duì)性的O、H血清因子做玻片凝集即可確定血清型，可大大節(jié)省傳統(tǒng)血清凝集所需要的時(shí)間，有效減少血清凝集結(jié)果的不確定性及由于血清質(zhì)量問(wèn)題造成的血清型誤判。

目前已有基于基因擴(kuò)增或雜交的沙門菌分子血清分型方法及應(yīng)用的報(bào)道[10-14]，如Luminex公司的沙門菌分子血清分型試劑盒可檢測(cè)常見(jiàn)的前100種血清型[13-14]，但價(jià)格昂貴（每株菌的檢測(cè)費(fèi)用約為300元人民幣），需特定的液相芯片平臺(tái)（儀器昂貴），操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。結(jié)合我國(guó)臨床及疾病控制系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室硬件實(shí)際條件，在已知基因及PCR設(shè)備易得的基礎(chǔ)上，熒光PCR不失為一種首選的理想檢測(cè)方法。利用TaqMan探針?lè)?，以沙門菌O/H抗原核酸為靶標(biāo)，在國(guó)內(nèi)及國(guó)際上建立沙門菌常見(jiàn)抗原或血清型的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，相對(duì)于采用熒光染料SYBR Green等的方法，避免了引物二聚體和其他非目標(biāo)DNA擴(kuò)增并與染料相結(jié)合引起非特異信號(hào)的現(xiàn)象，提高了實(shí)驗(yàn)的特異性、敏感性[15]。

本研究中，沙門菌O/H抗原核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)不同抗原的檢測(cè)靈敏度不一致。對(duì)O抗原的檢測(cè)靈敏度均超過(guò)85%，其中C1、C2、E及F達(dá)100%。但檢出O抗原的特異度較H抗原低，表明其假陽(yáng)性結(jié)果較多，可能與引物設(shè)計(jì)或操作過(guò)程中的細(xì)微污染有關(guān)[16]。該試劑盒對(duì)H抗原的靈敏度稍差，檢出1,5項(xiàng)的靈敏度僅35.71%，可能與1, 5是H抗原的非特異項(xiàng)，目前針對(duì)該抗原的特異性基因研究較少，本試劑盒所設(shè)計(jì)的引物特異性可能不夠理想等有關(guān)，有待改善引物及探針序列，擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究。另外，分子生物學(xué)方法在檢測(cè)準(zhǔn)確性方面也存在一定的誤差，與其他方法的聯(lián)用是未來(lái)發(fā)展方向[17]。

圖2 沙門菌O：B群血清型檢測(cè)擴(kuò)增曲線（A）及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（B）

沙門菌O/H抗原核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)O抗原的敏感性總體強(qiáng)于對(duì)H抗原的檢測(cè)，尤其對(duì)B群的O抗原，低于10拷貝/反應(yīng)即可檢出。其他幾種抗原檢測(cè)敏感性尚可，檢測(cè)下限為102～104拷貝/反應(yīng)，對(duì)A群O抗原及H抗原f,g項(xiàng)的檢測(cè)敏感性差，檢測(cè)下限為105拷貝/反應(yīng)。雖然不及程蘇云[18]等所建方法的最低檢測(cè)限為7.1×10-2拷貝/μL的敏感程度，但考慮該試劑盒檢測(cè)的主要目的在于定性，一般水煮模板或純菌提取DNA的濃度遠(yuǎn)高于該檢測(cè)下限，故不能單純以檢測(cè)敏感性不高而否定該試劑盒的檢測(cè)效果。

總之，本研究結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)率先建立的基于抗原編碼基因的沙門菌分子血清分型-沙門菌常見(jiàn)O及H抗原熒光PCR檢測(cè)試劑盒除對(duì)H抗原1,5項(xiàng)檢測(cè)效果不理想外，對(duì)其他幾種O/H抗原檢測(cè)結(jié)果尚可，與血清凝集鑒定結(jié)果的一致性較高，結(jié)合其他確證手段，可初步試用于沙門菌純菌實(shí)驗(yàn)室血清分型。

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Assessment of Fluorescent PCR Assay for Detecting Gomi?nant O/H Serogroups of Salmonella

CAO Yang,HAN Ying-Ying,LI Jie,KAN Biao,YAN Mei-Ying*
National Institute for Communicable Disease Prevention and Control,Chinese Center for Disease Control and Pre?vention,Beijing 102206,China

Objective:To evaluate the efficiency of fluorescent PCR assays for detecting main Salmonella sero?groups.Methods:Different serotypes of Salmonella were purified and detected by fluorescent PCR assays using dif?ferent O&H antigens detection kits.The specificity,sensitivity,lower limit of detection,positive and negative pre?dicted values,and Kappa value for different O&H antigens were calculated,and evaluated by the gold standard se?rum agglutination test.Results:The results showed that the sensitivity of 7 groups of O antigens ranged from 85.71%to 100.00%and the specificity ranged from 66.67%to 100.00%.The higher specificity was found for the detection of 7 groups of H antigens（87.50%～100.00%）.However,the sensitivity of H1,5 and Hi-l were lower with 35.71%and 57.14%,respectively.The H antigen assay exhibited a high consistency with serum agglutination test,except the detection of H1,5 and Hi-l（Kappa=0.302 and 0.492,respectively）.The amplification efficiency of different O/H antigens was high,and the lower limit of detection ranged from 7～137608 copies per action.Conclu?sion:Except for detecting H1,5,the assay of O&H antigens using fluorescent PCR has a better performance com?pared with traditional serotyping method for distinguishing different serogroups of Salmonella,especially at the as?pect of time saving,and it will be useful for early detection of Salmonella infection or outbreaks.

Salmonella;serotype;O antigens;H antigens;Taqman PCR

R392.1;Q78

A

1009-0002（2017）02-0084-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.003

2016-10-26

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2013ZX10004216）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2013CB127204）

曹陽(yáng)（1990-），女，碩士研究生

閆梅英，（E-mail）yanmeiying@icdc.cn

*Corresponding anthor,E-mail:yanmeiying@icdc.cn