李 敏，李俐睿，岳建國(guó)，周立新，黃 勇

（1.成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 溫江 611130）

雞傳染性支氣管炎病毒重組N蛋白克隆表達(dá)與免疫原性檢測(cè)

李 敏1，李俐睿1，岳建國(guó)1，周立新1，黃 勇2

（1.成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 溫江 611130）

本文以IBV N蛋白為研究對(duì)象，首先從雞胚培養(yǎng)的IBV ZY3毒株尿囊液中提取基因組RNA，然后利用軟件對(duì)其N蛋白抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物對(duì)免疫原性好、親水性強(qiáng)、表位可能性大的保守片段進(jìn)行擴(kuò)增，片段大小為818bp；將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-32a（+）連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)的重組N蛋白大小為50kDa；用Ni-NTA Superflow純化重組N蛋白后，采用抗雞IBV血清與之進(jìn)行Western blot反應(yīng)，檢測(cè)其免疫原性，結(jié)果顯示重組蛋白免疫原性良好。該結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究IBV N蛋白及建立雞傳染性支氣管炎的診斷方法有重要意義。

雞傳染性支氣管炎病毒；N基因；原核表達(dá)；Western blot

雞傳染性支氣管炎（IB）由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起，是一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病[1-2]。IBV一直不斷的變異和發(fā)展，盡管疫苗已被廣泛使用，但因其血清型復(fù)雜、變異頻繁、不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)性，使得雞傳染性支氣管炎在世界范圍內(nèi)廣泛流行[3-6]。近年來(lái)，對(duì)IBV N蛋白的報(bào)道逐漸增多。Ignjatovic等[7]研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白免疫動(dòng)物后能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體，且與S和M蛋白相比，N蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的交叉反應(yīng)性ELISA抗體出現(xiàn)時(shí)間更早，效價(jià)也更高。Ignjatovic等[8]通過(guò)使用單抗對(duì)其進(jìn)行抗原表位檢測(cè)，結(jié)果8株單抗能與N蛋白上的7個(gè)非重疊表位發(fā)生特異性結(jié)合，確定了N蛋白上抗原表位不少于7個(gè)。Ignjatovic等[9]還發(fā)現(xiàn)N蛋白72～86 aa區(qū)域有一個(gè)抗原表位能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，還可以與所有澳大利亞經(jīng)典IBV分離株發(fā)生交叉反應(yīng)。Boots等發(fā)現(xiàn)用人工表達(dá)的融合N蛋白對(duì)小鼠和雞進(jìn)行免疫，能引起它們對(duì)IBV全病毒的免疫應(yīng)答，而且蛋白免疫對(duì)雞淋巴細(xì)胞增生、遲發(fā)型超敏反應(yīng)的產(chǎn)生具有一定的促進(jìn)作用，還能使機(jī)體產(chǎn)生抗體的時(shí)間提前[10-11]。研究還表明使用N蛋白首免、全病毒加強(qiáng)免疫的雞，有70%以上能夠避免IBV對(duì)氣管環(huán)的損害，說(shuō)明N蛋白對(duì)于激活機(jī)體輔助性T細(xì)胞，增加體液免疫和細(xì)胞免疫協(xié)同作用也具有一定的幫助[12]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體、菌株、血清、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 IBV ZY3毒株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；pMD19-T、表達(dá)載體pET-32a（+）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；雞抗IBV ZY3陽(yáng)性血清由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；SPF雞胚購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 Trizol A總RNA提取試劑、2×Tap Master Mix、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、Protein Marker均購(gòu)于北京天根生物技術(shù)有限公司；DNA Marker購(gòu)于北京博邁德科技發(fā)展公司；限制性內(nèi)切酶 EcoR I、Sal I、xho I、T4 DNA連接酶、IPTG均購(gòu)于大連寶生物工程公司；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、氨芐青霉素、Tris、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、甘氨酸、TEMED、PVDF膜、HRP標(biāo)記羊抗雞IgG、DAB底物顯色試劑盒均購(gòu)于成都博瑞克生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；SDS、考馬斯亮藍(lán)R-250、β-巰基乙醇購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他主要試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì) 采用DNASTAR軟件對(duì)ZY3毒株N蛋白（Genbank No.HQ315777）的B細(xì)胞表位、親水性、抗原性、表位可能性等參數(shù)進(jìn)行綜合分析，利用ProPred服務(wù)器對(duì)N蛋白的CTL抗原表位和Th抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，參照Z(yǔ)Y3 N基因序列設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增免疫原性好、親水性強(qiáng)、表位可能性大的N基因保守序列，片段長(zhǎng)度為818 bp。引物由大連寶生物工程有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息表

1.3 IBV N蛋白基因擴(kuò)增與克隆

1.3.1 病毒N蛋白基因擴(kuò)增 將毒株IBV ZY3接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，盲傳后無(wú)菌收集尿囊液。將尿囊液用Trizol A提取病毒總RNA，用Prime ScriptTMRT reaqent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)完成后取5μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 N蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 使用DNA膠回收試劑盒回收凝膠上的目的條帶，并連接到pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，從平板上挑取若干單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Sal I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒pMD19-T-N和pET-32a（+）分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，回收N蛋白基因和pET-32a（+）質(zhì)粒DNA，用T4 DNA連接酶連接回收的目的片段與載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒DNA，然后再次進(jìn)行EcoR I、xho I雙酶切鑒定，以得到陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒。1.3.3 N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 取鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，挑取單個(gè)菌落接種于含Amp（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；菌液再以1∶100比例接種于相同培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；同時(shí)設(shè)空載體和未誘導(dǎo)對(duì)照，誘導(dǎo)完后取出1mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

大量誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，用包涵體洗滌液勻漿洗滌3次，初純蛋白樣品經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，使用Ni-NTA Superflow進(jìn)行親和層析純化，將最佳洗脫條件下收集的洗脫液裝入已處理的透析袋中，置于復(fù)性緩沖液中透析。透析完后，用核酸蛋白儀測(cè)定蛋白含量，取10μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。1.3.4 重組蛋白Western Blot分析 對(duì)純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后放于半干式電轉(zhuǎn)移槽內(nèi)以1 V/cm2恒壓轉(zhuǎn)移2～3 h到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印后取出PVDF膜放于平皿中，用TBST洗膜，加入封閉液封閉1 h；然后加入雞抗IBV陽(yáng)性血清，37℃孵育1 h后洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，37℃孵育1 h，TBST洗膜3次后用DAB顯色試劑盒避光顯色5～10min至可看到藍(lán)紫色條帶，立即加雙蒸水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 N基因的擴(kuò)增與克隆

2.1.1 N基因生物信息學(xué)分析 采用DNASTAR軟件預(yù)測(cè)IBV ZY3 N蛋白B細(xì)胞表位，當(dāng)抗原指數(shù)＞0，親水性指數(shù)≥0，表面可能性指數(shù)≥1，如果其內(nèi)部或附近具有柔性結(jié)構(gòu)，則較有可能是B細(xì)胞表位。結(jié)果表明B細(xì)胞表位可能存在于以下氨基酸位置：120～140，200～220，240～260，300～310，320～340，350～370，380～390。

利用ProPred服務(wù)器（http：//www.imtech.res.in/）對(duì)N蛋白CTL抗原表位和Th抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)（各結(jié)構(gòu)蛋白分別選取了軟件分析所得出的分值最高的前4個(gè)表位），結(jié)果顯示：T細(xì)胞表位主要存在于77～391之間。見(jiàn)表2。

表2 IBV N蛋白CTL和Th抗原表位預(yù)測(cè)

2.1.2 N蛋白基因RT-PCR結(jié)果 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳得到一條特異性條帶，與預(yù)期N基因（818bp）大小一致，見(jiàn)圖1。

圖1 N基因PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒pMD19-T-N酶切鑒定電泳圖

2.1.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-N的鑒定 將N基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接到pMD19-T載體上，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I、Sal I雙酶切，于瓊脂糖凝膠中電泳,分別得到約2600bp和818bp的兩條目的片段，與預(yù)期一致。見(jiàn)圖2。

2.2 N蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 提取構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行EcoR I、xho I雙酶切鑒定，約有5900bp和818bp兩條目的片段（見(jiàn)圖2），結(jié)果說(shuō)明N基因已經(jīng)成功克隆于表達(dá)載體中。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N酶切鑒定電泳圖

2.3 重組N蛋白的表達(dá)、純化及抗原性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 重組N蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定結(jié)果 將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET-32a-N轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在凝膠的50kDa處出現(xiàn)特異性蛋白帶，與預(yù)期大小一致，結(jié)果如圖3所示。

圖3 重組N蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定結(jié)果

2.3.2 重組蛋白的純化效果鑒定 將大量誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌通過(guò)包涵體洗滌法初提純后，用Ni-NTA Superflow親和層析對(duì)其進(jìn)一步純化，核酸蛋白儀測(cè)得蛋白含量為1.66mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE分析后，得到單一特異的蛋白條帶，與預(yù)期一致，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3.3 重組蛋白Western Blot分析結(jié)果 將純化的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上與雞抗IBV陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot反應(yīng)，結(jié)果顯示雞抗IBV多克隆血清能夠識(shí)別重組N蛋白（見(jiàn)圖4）。

圖4 重組蛋白的純化和Western blot分析結(jié)果

3 小結(jié)

IB是由傳染性支氣管炎病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。由于IBV基因組的突變和重組，不同血清型IBV毒株之間缺乏交叉保護(hù)，雖然疫苗一直在使用，但I(xiàn)B仍不斷暴發(fā)與流行。

IBV N蛋白作為一種病毒內(nèi)部蛋白，占病毒蛋白總量的40%。其誘導(dǎo)的ELISA抗體出現(xiàn)最早，效價(jià)也最高，說(shuō)明N蛋白上有更多的交叉反應(yīng)表位，或者說(shuō)N蛋白具有更高的免疫原性。

本實(shí)驗(yàn)利用軟件對(duì)IBV N蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，對(duì)免疫原性好、親水性強(qiáng)、表位可能性大的保守片段（114～386aa）進(jìn)行了擴(kuò)增，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增出了818bp的目的條帶，且無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)，表明引物的特異性較高。因pET表達(dá)系統(tǒng)的T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制、T7 RNA聚合酶高效誘導(dǎo)、目的蛋白的高表達(dá)量以及表達(dá)蛋白帶有His標(biāo)簽等特點(diǎn)，故利用原核表達(dá)載體pET-32a對(duì)IBV N蛋白進(jìn)行重組表達(dá)具有可行性，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度的篩選，得到了較為優(yōu)化的表達(dá)條件，表達(dá)后對(duì)重組IBV N蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，在50kDa處得到一條清晰的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，為重組N蛋白。將大量誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌通過(guò)包涵體洗滌法初提純之后，用Ni-NTA Superflow親和層析，通過(guò)不同的Ni離子濃度梯度洗脫對(duì)其進(jìn)一步純化，再經(jīng)SDS-PAGE分析，同樣得到單一特異的蛋白條帶。隨后我們采用抗雞傳染性支氣管炎病毒血清與純化后的重組IBV N蛋白進(jìn)行了Western blot反應(yīng)，結(jié)果表明此重組N蛋白具有良好的免疫原性，并能反映天然蛋白的生物學(xué)活性，為下一步的疫病診斷和基因工程疫苗的制備打下了良好的基礎(chǔ)?！?/p>

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The Expression and Characterization of Highly Antigenic Region of Nucleoprotein of Prevalent Infectious Bronchitis Virus in Escherichia coli

Li Min1，Li Lirui1，Huang Yong2，et al.
（1.Animal Disease Prevention and Control Center of Chengdu City，Sichuan Chengdu 610041；2.Sichuan Agricultural University，Sichuan Wenjiang 611130，China）

IBV N protein was regarded as a target protein in our study，IBV genomic RNA was extracted from chicken embryo allantoic fluid，using software to predict and analyse the epitope of N protein.A pair of specific primers were designed to amplify the fragments which showed good immunogenic，hydrophilicity and epitope possibility，amplified fragment was 818 bp.It ligated into the vector pET-32a（+）and then transformed into E.coli BL21，after induction of expression，the SDS-PAGE results showed that the protein was about 50 kDa.Purified on a column packed with Ni-NTA His·Bind superflow，the recombinant protein then reacted with chicken anti-IBV serum by western blot to test its antigenicity，the results showed that the recombinant protein had good antigenicity.It was important to further research on IBV N protein and the diagnosis of avian infectious bronchitis.

Infectious bronchitis virus；N gene；Prokaryotic expression；Western blot

S858.315.3

：B

：1001-8964（2017）04-0024-04

2017-02-21

李敏（1986-），女，四川成都人，獸醫(yī)師，碩士，現(xiàn)在成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心從事實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。