陸薇 梁克誠(chéng) 吳漢剛 梁新梅 覃灝

Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)中ck19、肺特異性蛋白X mRNA表達(dá)與微轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性研究

陸薇 梁克誠(chéng) 吳漢剛 梁新梅 覃灝

目的 研究Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)中細(xì)胞角蛋白19(ck19)、肺特異性蛋白X(LUNX) mRNA表達(dá)與轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性。方法 選擇68例我院胸外科術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者(觀(guān)察組)和20例確診為肺炎性假瘤病例(對(duì)照組)，將入選病例腫瘤組織、肺門(mén)旁(N1)、縱隔淋巴結(jié)(N2)蠟塊，分別做HE染色和免疫組化檢測(cè)CK19、LUNX mRNA因子表達(dá)。結(jié)果 68例Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織均有CK19、LUNX mRNA表達(dá)，肺炎性假瘤病例患者淋巴結(jié)未見(jiàn)CK19、LUNX mRNA表達(dá)。22例淋巴結(jié)可見(jiàn)CK19表達(dá)，腺癌17例，鱗癌5例；ⅠA期8例，ⅠB期14例。15例淋巴結(jié)可見(jiàn)LUNX mRNA表達(dá)，腺癌11例，鱗癌4例；ⅠA期5例，ⅠB期10例。腺癌患者淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)顯著高于鱗癌患者，ⅠB期患者淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)顯著高于ⅠA期患者。鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N1淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)差異不明顯，鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N2淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)差異顯著(P<0.05)。僅N1淋巴結(jié)表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存時(shí)間62.5個(gè)月，僅N2淋巴結(jié)表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存40.2個(gè)月，N1和N2均表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存時(shí)間36.6個(gè)月，NI和N2均為表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存時(shí)間為64.8個(gè)月。僅NI表達(dá)患者與僅N2表達(dá)及N1+N2均表達(dá)患者的生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與未表達(dá)患者的差異不顯著。僅N2表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于未表達(dá)患者，與N1和N2均表達(dá)患者的生存時(shí)間差異不顯著。結(jié)論 CK19和LUNX mRNA可作為I期非小細(xì)胞肺癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物，腺癌患者和ⅠB期患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移率更高，N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是患者影響I期非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的主要原因，N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后更差。

Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌；ck19；特異性蛋白X mRNA；預(yù)后

肺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，也是我國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡第一位原。雖然醫(yī)學(xué)對(duì)肺癌認(rèn)識(shí)不斷深入，且臨床治療療效取得顯著進(jìn)展，但是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的生存率未明顯增加，完全切除術(shù)后Ⅰ期NSCLC復(fù)發(fā)率高達(dá)25%-50%[1]。既往研究報(bào)道患者常規(guī)檢查無(wú)法發(fā)現(xiàn)隱匿性微轉(zhuǎn)移是術(shù)后復(fù)發(fā)率高的主要原因，根據(jù)NSCLC微轉(zhuǎn)移判斷腫瘤轉(zhuǎn)移及原因?qū)εR床治療和預(yù)后判斷具有重要意義[2]。CK19是臨床應(yīng)用最廣的標(biāo)記物，目前缺乏診斷肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性標(biāo)記物，且多數(shù)研究認(rèn)為單一標(biāo)記物診斷的敏感性不高，臨床需要根據(jù)多種標(biāo)記物聯(lián)合診斷，提高臨床診斷的敏感性。LUNX是經(jīng)nRNA差異顯示技術(shù)分離的一個(gè)人類(lèi)肺組織特異性基因，僅在上腭、鼻咽器官等呼吸道表達(dá)，具有明顯的組織特異性。近年來(lái)部分研究報(bào)道LUNX mRNA作為檢測(cè)肺外微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的特異性和敏感度較高，可作為理想的檢測(cè)NSCLC微轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物。本文以68例Ⅰ期NSCLC和20例肺炎假性腫瘤患者為研究對(duì)象，分析Ⅰ期NSCLC淋巴結(jié)中CK19和LUNX mRNA表達(dá)與微轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集2002年 1月1日-2008年 12月31收治的68例NSCLC患者患者，病理檢測(cè)符合國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)Ⅰ期診斷標(biāo)準(zhǔn)，ⅠA期35例，ⅠB期33例。入選標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未行放化療，采用根治性切除術(shù)，性淋巴結(jié)清掃并留取肺門(mén)旁、縱隔淋巴結(jié)?；颊吣行?6例，女22例，年齡搜集范圍18-65歲，平均(59.7±11.4)歲。病例類(lèi)型：腺癌42例，鱗癌26例；同時(shí)選擇 20例確診為肺炎性假瘤病例為對(duì)照組，男性12例，女性8例。年齡18-64歲，平均(57.6±8.7)歲。

二、方法

將入選病例腫瘤組織、肺門(mén)旁(N1)、隆突下(N2)淋巴結(jié)蠟塊，重新切片4-6張，分別做HE染色和免疫組化檢測(cè)ck19、肺特異性蛋白X mRNA因子表達(dá)。具體操作：石蠟切片，脫蠟至水3% H2O2室溫孵育5-10 min。蒸餾水清晰后使用PBS浸泡5 min，加入適當(dāng)比例稀釋一抗工作液，37 ℃孵育1-2 h或放置于4℃環(huán)境下過(guò)夜保存。使用PBS沖洗3次，2min/次。滴加二抗室溫或37℃孵育20-30 min，再次使用PBS沖洗3次，2min/次。顯色自來(lái)水沖洗、復(fù)染，脫水透明至封片。

術(shù)后當(dāng)日開(kāi)始隨訪(fǎng)，直至患者死亡或末次隨訪(fǎng)日。隨訪(fǎng)檢查內(nèi)容包括胸部普通CT、增強(qiáng)CT掃描、頭顱CT及頭顱核磁共振掃描、腹部B超或CT平掃、腎上腺B超，必要時(shí)行全身放射性骨掃描、結(jié)合放射性濃聚部位骨核磁共振掃描，并根據(jù)Ⅰ期NSCLC診療指南給予局部或全身放化療等抗腫瘤綜合治療措施。術(shù)后1年內(nèi)IA其患者定期接受隨訪(fǎng)和復(fù)查，未給予輔助放化療治療，ⅠB期患者接受放化療或免疫治療，未行放化療患者定期接受隨訪(fǎng)及復(fù)查。術(shù)后隨訪(fǎng)1年后，以電話(huà)、電子郵件方式隨。隨訪(fǎng)時(shí)間9個(gè)月-85個(gè)月，平均(37.5±28.6)個(gè)月，中位隨訪(fǎng)期3年。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS21.0軟件處理，技術(shù)資料使用頻數(shù)和率(%)表示，兩組間比較使用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CK19、LUNX mRNA表達(dá)

68例Ⅰ期NSCLC患者腫瘤組織均有CK19、LUNX mRNA表達(dá)，肺炎性假瘤病例患者淋巴結(jié)未見(jiàn)CK19、LUNX mRNA表達(dá)。22例淋巴結(jié)可見(jiàn)CK19表達(dá)，腺癌17例，鱗癌5例；ⅠA期8例，ⅠB期14例。15例淋巴結(jié)可見(jiàn)LUNX mRNA表達(dá)，腺癌11例，鱗癌4例；ⅠA期5例，ⅠB期10例。腺癌患者淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)顯著高于鱗癌患者，ⅠB期患者淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)顯著高于ⅠA期患者。(見(jiàn)表1)。

表1 淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)情況

注：a表示鱗癌與腺癌患者CK19表達(dá)差異顯著(t=2.574,P=0.024)；b表示鱗癌與腺癌患者LUNX mRNA表達(dá)差異顯著(t=3.541,P=0.037)；c表示ⅠB期與IA其患者CK19表達(dá)差異顯著(t=2.077,P=0.001)；d表示ⅠB期與ⅠA期患者LUNX mRNA表達(dá)差異顯著(t=2.569,P=0.002)

二、N1和N2淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)

鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N1淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)差異不明顯，鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N2淋巴結(jié)CK19、LUNX mRNA表達(dá)差異顯著(P<0.05)。(見(jiàn)表2，3)。

表2 N1和N2淋巴結(jié)CK19表達(dá)比較

表3 N1和N2淋巴結(jié)LUNX mRNA表達(dá)比較

三、生存時(shí)間

僅N1淋巴結(jié)表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存時(shí)間62.5個(gè)月，僅N2淋巴結(jié)表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存40.2個(gè)月，N1和N2均表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存時(shí)間36.6個(gè)月，NI和N2均為表達(dá)CK19、LUNX mRN患者的生存時(shí)間為64.8個(gè)月。僅NI表達(dá)患者與僅N2表達(dá)及N1+N2均表達(dá)患者的生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與未表達(dá)患者的差異不顯著。僅N2表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于未表達(dá)患者，與N1和N2均表達(dá)患者的生存時(shí)間差異不顯著。(見(jiàn)表4)。

表4 生存時(shí)間比較

討 論

微轉(zhuǎn)移是指非血液系統(tǒng)惡性腫瘤在發(fā)展過(guò)程中，癌細(xì)胞播散并存活于血液循環(huán)、淋巴道、骨髓或組織器官內(nèi)，但未形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，患者無(wú)臨床表現(xiàn)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[3]，肺癌淋巴結(jié)存在肺癌在無(wú)N1轉(zhuǎn)移情況下發(fā)生N2轉(zhuǎn)移，且跳躍轉(zhuǎn)移患者多為腺癌患者。但是肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移診斷缺乏統(tǒng)一性標(biāo)記物，而標(biāo)記物需要具備特異性強(qiáng)和敏感性高兩個(gè)特點(diǎn)，因而越來(lái)越多研究人員聯(lián)合多個(gè)標(biāo)記物檢測(cè)肺癌微轉(zhuǎn)移，以提高檢測(cè)結(jié)果的敏感度[4]。本研究選擇CK19和LUNX mRNA作為標(biāo)記物，結(jié)果顯示Ⅰ期NSCLC患者的肺癌組織均存在CK19和LUNX mRNA表達(dá)，未見(jiàn)假陰性及假陽(yáng)性，表明CK19及LUNX mRNA的敏感性和特異性高。肺門(mén)及縱隔淋巴結(jié)檢查顯示CK19和LUNX mRNA的陽(yáng)性率分別為16.2%、11.0%，符合既往研究報(bào)道的NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移率[5]。ⅠB期患者的CK19和LUNX mRNA表達(dá)率顯著高于ⅠA期患者，表明IB和ⅠA期患者的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移率存在明顯差異，ⅠB期淋巴結(jié)發(fā)生微轉(zhuǎn)移的幾率更高。在肺癌病例類(lèi)型與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移關(guān)系方面，現(xiàn)有研究未對(duì)兩者關(guān)系作出明確定論，部分研究報(bào)道肺癌類(lèi)型與微轉(zhuǎn)移無(wú)明顯關(guān)系[6]，另一部分研究認(rèn)為腺癌患者的微轉(zhuǎn)移率更高[7]。本研究中腺癌患者的CK19和LUNX mRNA表達(dá)率更高，且顯著高于腺癌(P<0.05)，提示CK19和LUNX mRNA表達(dá)情況可能用于判斷肺癌病例類(lèi)型。

NSCLC治療及預(yù)后與腫瘤TNM分期關(guān)系密切，縱隔淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移是判斷預(yù)后質(zhì)量的重要標(biāo)志。國(guó)外研究顯示[8]，肺癌患者可能存在N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且多為侵襲性低分化腺癌患者，并且該研究認(rèn)為N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致預(yù)后不良。國(guó)外相似研究也報(bào)道早期NSCLC患者存在N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后不佳，且發(fā)生復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率高[9]。本研究將患者分為N1和N2淋巴結(jié)兩組，結(jié)果顯示腺癌患者N2淋巴結(jié)CK19和LUNX mRNA表達(dá)率高于鱗癌患者，提示微轉(zhuǎn)移率更高；ⅠB期患者N2淋巴結(jié)表達(dá)CK19和LUNX mRNA表達(dá)率高于ⅠA期患者，提示ⅠB期患者N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移更高。

越來(lái)越多研究證實(shí)微轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是NSCLC患者預(yù)后不良的主要原因。國(guó)外研究報(bào)道腫瘤直徑低于2 cm的肺癌患者仍存在N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N2轉(zhuǎn)移提示患者可能預(yù)后不良[10]。本研究對(duì)N1和N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移情況分析患者的生存時(shí)間，結(jié)果顯示N1和N2淋巴結(jié)未表達(dá)患者的生存時(shí)間最長(zhǎng)，N1和N2表達(dá)CK19和LUNX mRNA患者的生存期最短，且生存時(shí)間與N1表達(dá)和N1+N2表達(dá)患者的生存時(shí)間差異顯著，僅N2表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于僅N1表達(dá)患者，結(jié)果表明N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者的生存率更低，預(yù)后質(zhì)量更差。但是N1+N2表達(dá)患者的生存時(shí)間雖然高于僅N2表達(dá)患者，但是差異不顯著，提示，Ⅰ期NSCLC患者N1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)其生存率不影響。

綜上所述，CK19和LUNX mRNA可作為Ⅰ期NSCLC患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物，腺癌患者和ⅠB期患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移率更高，N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是患者影響Ⅰ期NSCLC患者預(yù)后的主要原因，N2淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后更差。

[1] 余輝,黃秀英,王欣,王等. 非小細(xì)胞肺癌患者外周血CK19 mRNA檢測(cè)臨床意義的探討[J]. 中華腫瘤防治雜志,2011,18(13):1024-1026.

[2] 宋平平,張百江,張為迪,等. 非小細(xì)胞肺癌組織CD44V6和CK19表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系[J]. 中華腫瘤防治雜志,2010,17(22):1821-1823.

[3] Ah Young Lee,Su Jung Choi,Kyung Pyo Jung,et al. Characteristics of Metastatic Mediastinal Lymph Nodes of Non-Small Cell Lung Cancer on Preoperative F-18 FDG PET/CT[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging,2014, 48(1):41-46.

[4] Shinichiro Miyoshi,Kazuhiko Shien,Shinichi Toyooka,et al. Validity of using lobe-specific regional lymph node stations to assist navigation during lymph node dissection in early stage non-small cell lung cancer patients[J]. Surg Today,2014, 44(11):2028-36.

[5] Benedikova A, Srovnal J, Szkorupa M, et al. Biomarkers in the detection of minimal systemic dissemination in lung cancer patients. Rozhl Chir. 2012,91(4):209-215.

[6] Hao yuan, Yang,Lin-Kun Lee,Cheng-Hwai Tzeng. Successful Treatment of Synchronous Solitary Ipsilateral Axillary Lymph Node Metastasis from Non-Small Cell Lung Cancer with Radical Resection and Perioperative Chemotherapy[J]. J Cancer Surviv,2015,2(1):42-48.

[7] 郝穎,付秀華,王立紅,等. 非小細(xì)胞肺癌患者外周血中多參數(shù)檢測(cè)對(duì)診斷微轉(zhuǎn)移的作用[J]. 中華肺部疾病雜志(電子版),2014,7(3):294-298.

[8] Maniwa T, OkumuraT，Isaka M ，et al.Recurrence of mediastinal node cancer after lobe-specific systematic nodal dissection for non-small-cell lung cancer[J].Eur J Cardio-Thorac,2013, 44(1):59-64.

[9] 陳曹陽(yáng),李軍,陳濤,等. RT-P檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床研究[J]. 中華肺部疾病雜志(電子版),2015,8(4)::436-439.

[10] Saji H，Tsuboi M，Shimada Y，et al.A Proposal for Combination of Total Number and Anatomical Location of Involved Lymph Nodes for Nodal Classification in Non-small Cell Lung Cancer.CHEST, 2013, 143(6):1618-25.

Correlation of CK19, lung specific protein mRNA X expression with micro metastasis and prognosis in primary non small cell lung cancer

LUWei,LIANGKe-cheng,WUHan-gang,LIANGXin-mei,TAN

HaotheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiScienceandTechnologyUniversity,Liuzhou,Guangxi545000,China

Objective To study the correlation between the expression of cell keratin 19 (CK19), non specific protein X (LUNX) mRNA expression and prognosis in patients with stage I non-small cell lung cancer. Methods 68 cases after thoracic surgery pathologically confirmed as stage I non small cell lung cancer patients were selected as the observation group, and 20 cases diagnosed as inflammatory pseudotumor as the control group. Their tumor tissue and paraffin block near the door of pulmonary (N1) and mediastinal lymph (N2) were given HE staining and immunohistochemical detection to detect CK19 and LUNX mRNA expression. Results The expression of CK19 and LUNX mRNA was detected in tumor tissues of the observation group, but it wasn't detected in pulmonary inflammatory pseudotumor patients.CK19 expressed in 22 cases of lymph node, 17 cases of adenocarcinoma, 5 cases of squamous cell carcinoma, 8 cases at stage IA, and 14 cases at stage IB. LUNX mRNA expressed in 15 cases of lymph node, 11 cases of adenocarcinoma, 4 cases of squamous cell carcinoma, 5 cases at stage IA, and 10 cases at stage IB. The expression of CK19 and LUNX mRNA was significantly higher in lymph nodes of patients with adenocarcinoma than in patients with squamous cell carcinoma, and stage IB lymph node higher than stage IA. There was no significant difference in N1 lymph node of CK19 and LUNX mRNA expression between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients, stage IB and stage IA patients. There were significant differences in N1 lymph node of CK19 and LUNX mRNA expression between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients, stage IB and stage IA patients (P<0.05). The survival duration of only N1 lymph node expression of CK19 and LUNX mRNA was 62. 5 months, and 40.2 months for only N2 lymph node expression of CK19 and LUNX mRNA, and 36.6 months for N1 and N2 expressed CK19 and Lu Nx mRNA. The survival time of Ni and N2 expression of CK19 and LUNX mRNA was 64.8 months. Conclusion CK19 and LUNX mRNA can be as markers for stage I non small cell lung cancer micrometastasis in lymph nodes of patients, and patients with adenocarcinoma patients at stage IB have higher transfer rate. N2 lymph node micrometastasis is main reason for the prognosis of patients with small cell lung cancer (NSCLC) and N2 lymph node micrometastasis prognosis is worse.

stage I non-small cell lung cancer; CK19; specific protein X mRNA; prognosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.008

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題基金(No Z2014580)

545000 廣西 柳州，廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院

2016-09-26]