焦小麗，景炅婕，喬利英，李留安，李寶鈞，劉文忠*

（1. 山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2. 天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

綿羊Lpin2基因CDS區(qū)克隆與生物信息學分析

焦小麗1,2，景炅婕1，喬利英1，李留安2，李寶鈞1，劉文忠1*

（1. 山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2. 天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

本研究應用RT-PCR、5'-RACE、TA克隆技術獲得綿羊Lpin2基因CDS區(qū)，并進行相關生物信息學分析，為其遺傳特性及編碼蛋白功能機制的研究提供基礎數(shù)據(jù)。結果獲得綿羊Lpin2基因2 754 bp，包括84 bp的5'UTR和2 670 bp的CDS區(qū)，編碼889個氨基酸。生物信息學分析編碼蛋白lipin2屬不穩(wěn)定的中性親水脂溶性蛋白，存在跨膜域、2個O-糖基化位點和89個磷酸化位點，沒有信號肽，定位于細胞質或細胞器中。存在由細胞質活性氧(ROS)主導的氧化還原機制形成的二硫鍵。二級結構包含高比例的環(huán)(80.54%)。蛋白N-末端和C-末端分別含有保守結構域Lipin_N和LSN2。綿羊與山羊、家牛、羊駝、豬、家犬、靈長類與嚙齒類動物以及原雞lipin2氨基酸序列同源，系統(tǒng)進化與其親緣關系遠近一致， Lpin2基因編碼區(qū)進化保守。綿羊lipin2與lipin1氨基酸序列相似性相對較低(66%)，可能與其有差異的功能活性有關。

綿羊；Lpin2基因；克?。簧镄畔W

脂素(Lipins)是雙向調控脂肪代謝的關鍵調控蛋白，在脂質代謝中具有Mg2+離子依賴的磷脂酸磷酸酶(PAP)活性，催化磷脂酸(PA)生成甘油二酯(DAG)，還可作為轉錄共激活因子調控脂質相關基因的表達[1,2]，其編碼基因突變可導致脂質穩(wěn)態(tài)及代謝異常[3]，哺乳動物lipins家族蛋白由lipin1、lipin2與lipin3 3個成員組成，分別被Lpin1、Lpin2與Lpin3基因編碼[1]。2個相近的蛋白lipin2和lipin3與lipin1的氨基酸序列相似性為44%～48%[4]。包括低等生物酵母到哺乳動物在內的整個發(fā)育系統(tǒng)lipin成員均含有高度保守的功能結構域N-LIP(氨基端)和C-LIP(羧基端)[5]，然而3個lipin成員在亞細胞定位[5]、PAP酶活性[6]、分子調控等方面存在差異[7]。畜禽lipins編碼基因多態(tài)性與背膘厚、大理石紋、眼肌面積等肉質性狀顯著關聯(lián)[8-9]。目前對lipin1的研究較多， lipin2與lipin3尚缺乏深入研究[1]，綿羊Lpin2基因尚未見報道。本研究擬采用RT-PCR、5'-RACE、TA克隆技術獲得綿羊Lpin2基因CDS區(qū)，應用生物信息學方法對其核酸及編碼氨基酸序列進行預測分析，為Lpin2基因在綿羊中的遺傳特性及蛋白功能活性的研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 組織樣品來自10月齡廣靈大尾羊（山西省渾源縣）的腎周脂肪組織。綿羊屠宰后，用RNA酶滅活的剪刀、鑷子剪取組織，置于無RNA酶的凍存管并迅速投入液氮中，隨后-80℃冰箱超低溫保存。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒、pMD18-T克隆載體試劑盒、TaKaRa LA Taq with GC Buffer、氨芐青霉素(Amp)、X-Gal、IPTG、胰蛋白胨、酵母提取物購自寶生物工程（大連）有限公司；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、0.1～10 kb DNA Ladder Marker、超級感受態(tài)細胞制備試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，5'RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends為Invitrogen產品。異戊醇、Tris飽和酚、溴酚藍、DEPC、無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷、瓊脂糖購自北京天根生化科技有限公司。

1. 3 實驗方法

1.3.1 總RNA提 取及RT-PCR反 應 根據(jù)RNAiso Plus總RNA提取試劑說明書提取總RNA，核酸蛋白測定儀ND-100檢測RNA的濃度及純度，1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量及完整性。按照試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，Oligo dT引物序列為5'-GGTCCTTTCTT GTATCAGCTCGCCCT-3'，cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計 參照GenBank綿羊Lpin2基因 預 測 序 列 (登 錄 號： XM_004020631.2，XM_012103527.2)，用Primer Premier 5.0生物軟件設計PCR擴增引物（P1與P7產物）以及2條5′RACE巢式接頭引物、GSP1和GSP2特異性引物（P2～P6、P8產物）。引物序列及產物大小如表1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 PCR擴增 分別使用Taq酶和LA Taq酶擴增綿羊Lpin2基因CDS片段。擴增P1產物的反應總體系為15μL：上下游引物各0.5 μL，10×Taq Buffer 1.5 μL，dNTP(2.5 mM)1.2 μL，cDNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL，RNase-Free ddH2O 10.1 μL；擴增P7產物的反應總體系為25 μL：上下游引物各0.5 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，cDNA模板1 μL，LA Taq酶0.2 μL，RNase-Free ddH2O 6.3 μL。PCR反應條件為95℃預變性3 min，94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸60～120 s，33～35個循環(huán)，72℃修復延伸6～7 min。應用巢式PCR擴增綿羊Lpin2基因CDS片段（P2～P6、P8產物），操作步驟參照5' RACE說明書。第一輪反應體系為25 μL，包括12.5 μL的2×GC Buffer I，0.5 μL的AAP，0.5 μL 的GSP1引 物（R1/ R3/R5/R7/R9/R13），1 μL cDNA模 板，4 μL dNTP，LA Taq酶 0.2 μL，RNase-Free ddH2O 6.3 μL；第二輪反應體系為50 μL，包括25 μL的2×GC Buffer I，1 μL的AUAP，1 μL的GSP2(R2/R4/R6/R8/R10/R14)，1 μL cDNA模板（第一輪PCR稀釋產物），8 μL dNTP，LA Taq酶0.5 μL，RNase-Free ddH2O 12.5 μL。反應條件為95℃預變性3 min，94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環(huán)，最后72℃修復延伸7 min。

1.3.4 目的片段TA克隆與鑒定 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR目的片段，與pMD18-T克隆載體在16℃條件下連接過夜，連接反應總體系為10 μL：Solution I 4 μL，PCR回收產物5 μL，載體0.2 μL，ddH2O 0.8 μL。連接產物轉化步驟如下：10 μL連接液轉化至100 μL感受態(tài)細胞，轉化后加入400 μL 2×YT無抗生素液體培養(yǎng)基，37℃條件下復蘇1 h。將復蘇后的菌液均勻涂布在預先用IPTG和X-gal涂布的氨芐青霉素（Amp）平板上，倒置培養(yǎng)過夜。次日，用滅菌槍頭挑取白色單一菌落于裝有7 mL含Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)7～8 h，之后進行菌液PCR鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.5 生物信息學分析 應用DNAMAN和Contig軟件比對拼接序列片段， ApE軟件預測開放閱讀框（ORF）并翻譯編碼區(qū)成氨基酸序列。應用 Protparam、SCRATCH Protein Predictor、SignalP4.0、TMHMM Server v.2.0和 TMpred Server、NetOGlyc 3.1、NetNGlyc 1.0、NetPhos 2.0在線軟件分別預測蛋白質理化性質、二硫鍵、信號肽、跨膜域、O-糖基化位點、N-糖基化位點以及磷酸化位點。應用PredictProtein在線軟件預測蛋白質二級結構。應用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白質功能結構域，NCBI中的Blastp比對氨基酸序列。應用MEGA5.0軟件基于遺傳距離的鄰接法(NJ)構建遺傳距離進化樹。

2 結 果

2.1 總RNA檢測 核酸蛋白測定儀測定總RNA的OD260/280在1.8～2.0，濃度在700～900 ng/μL，電泳檢測到清晰完整的28S rRNA和18S rRNA條帶(圖1)，說明RNA純度及濃度較高，完整性較好，RNA無降解及無DNA、蛋白質污染，適合用做RT-PCR反應。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖2 綿羊Lpin2基因CDS區(qū)PCR擴增產物

2.2 綿羊Lpin2基因PCR擴增與克隆測序 電泳檢測RT-PCR擴增產物為單一特異性條帶，片段大小與預擴增片段大小一致(圖2)。經測序獲得P1(815 bp)、P2(268 bp)、P3(803 bp)、P4(539 bp)、P5(421 bp)、P6(435 bp)、P7(674 bp)、P8(247 bp)擴增片段，比對拼接后得到綿羊Lpin2基因2 754 bp，包含84 bp的5'UTR 以及2 670 bp的ORF，序列比對發(fā)現(xiàn)ORF與GenBank預測的轉錄本X3(登錄號：XM_012103527.2)CDS區(qū)相一致，編碼889個氨基酸，核酸序列提交至GenBank(登錄號：KX097051)。

2.3 綿羊lipin2蛋白序列分析及結構預測

2.3.1 理化性質 綿羊lipin2由889個氨基酸組成，分子式為C4358H6794N1192O1362S26，分子量為98 512.6 D，理論等電點(pI)為5.54，為中性蛋白質。氨基酸殘基中Ser(10.3%)頻率最高，Met(1.3%)頻率最低，含有14個Cys。消光系數(shù)(M-1cm-1γ=280 nm)為115 125，不穩(wěn)定系數(shù)為54.68，屬不穩(wěn)定類蛋白質。在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h。脂溶指數(shù)為71.19，平均親水性為-0.613，屬親水性脂溶蛋白。

2.3.2 信號肽、跨膜域與二硫鍵 信號肽預測表明綿羊lipin2前70個氨基酸的C-max(0.109)、S-max(0.163)、Y-max(0.109)均小于閾值0.5，表明該蛋白沒有信號肽。TMHMM軟件預測該蛋白不存在跨膜結構域，TMpred軟件預測存在507～528氨基酸膜內到膜外，以及511～529氨基酸膜外到膜內的雙向跨膜，分值分別為609和628，大于500，認為該蛋白有2次跨膜。預測綿羊lipin2蛋白14個Cys中，12個Cys形成6對二硫鍵。

表1 綿羊Lpin2基因PCR引物序列及產物長度

2.3.3 糖基化和磷酸化 預測綿羊lipin2存在潛在的O-糖基化和N-糖基化位點，Thr430和Ser589的O-糖基化潛力值分別為0.532和0.521，Asn200和Asn839的N-糖基化潛力值分別為0.529和0.577，均大于閾值0.5。預測綿羊lipin2存在89個潛在的磷酸化位點，分別為67個Ser、12個Thr和10個Tyr磷酸化位點，潛力值均大于0.5。

2.3.4 結構域與高級結構 預測綿羊lipin2蛋白N-末端(N-LIP，1～106氨基酸)和C-末端(C-LIP，630～855氨基酸)分別存在Lipin_N和LNS2（Lipin/ Ned1/Smp2）超家族結構域(圖3)。Lipin_N是小鼠lipin1調節(jié)脂肪代謝的關鍵結構域，LNS2具有鹵酸脫鹵酶超家族(HAD_like)中Mg2+依賴性的PAP酶活性，結構上包括PAP酶活性模序DXDXT以及轉錄共調控LXXIL模序，這2種結構域是lipin家族蛋白共有的[4]，表明lipin家族蛋白功能的保守性。PredictProtein軟件中的REPROFSec程序預測綿羊lipin2包含10.80%的α螺旋(Helix, H)，8.66%的β折疊(Extended Strand, E)和80.54%的環(huán)(Loop)。PROFAcc程序預測氨基酸殘基溶劑可及性，發(fā)現(xiàn)埋藏態(tài)(buried)為26.21%，中間態(tài)(Intermediate)為6.41%，暴露態(tài)(Exposed)為67.38%。ISIS程序預測168、205、312、390、510～511、547、664、794氨基酸為蛋白質結合位點。MD程序預測1、91～96、104～259、265～450、456、469～477、528～627、629、633～634、861～863、882～884、886 氨 基 酸為無序結構區(qū)域。且發(fā)現(xiàn)α螺旋和β折疊以及氨基酸殘基溶劑可及性的埋藏態(tài)主要位于Lipin_N和LSN2保守功能域，構成了該蛋白二級結構空間折疊的結構基礎，而高比例的環(huán)、氨基酸殘基溶劑可及性的暴露態(tài)以及大部分無序結構位于非保守序列(圖4)。

圖3 綿羊lipin2蛋白保守結構域預測

圖4 綿羊lipin2蛋白二級結構預測

2.3.5 序列相似性比對及聚類分析 綿羊與山羊、家牛、羊駝、豬、家犬及靈長類與嚙齒類物種lipin2氨基酸序列相似性在90%以上，與原雞的相似性也高達87%，與所有比對物種氨基酸序列一致性在80%以上(表2)，lipin2發(fā)育樹與生物進化物種樹基本一致(圖5)。綿羊lipin1(AFR45924.1)與lipin2(XP_011958917.1)氨基酸序列一致性和相似性分別為53%和66%，同一家族lipin蛋白氨基酸序列相似性較低，可能與其有差異的功能活性有關。

3 討 論

3.1 綿羊Lpin2基因序列及編碼蛋白理化性質 小鼠Lpin2定位于MMU 17，編碼893個氨基酸；大鼠Lpin2定位于RNO 9，編碼894個氨基酸，人Lpin2基因定位于HAS 18p，編碼896個氨基酸。豬Lpin2基因位于SSC 6q24-(1/2)q31，編碼891個氨基酸，以上物種lipin2均含有20個外顯子。本研究得到綿羊Lpin2基因2 670 bp 的CDS區(qū)，定位于OAR23，編碼889個氨基酸，含有20個外顯子，與上述物種相接近。預測分析該蛋白pI為5.54，分子量99.51 ku，為中性親水性蛋白。蛋白質半衰期與其穩(wěn)定性密切相關，一般而言，半衰期長則蛋白質穩(wěn)定性高[10]。綿羊lipin2具有較長的半衰期，但卻屬于不穩(wěn)定蛋白，這一特性是否與其雙重功能活性有關值得研究。

表2 綿羊與11種物種lipin2氨基酸序列一致性與相似性比對

圖5 12個物種lipin2氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

3.2 蛋白質結構與功能 基于TMpred軟件預測綿羊lipin2存在2次跨膜。研究表明lipin蛋白定位于細胞質，可轉移至細胞膜發(fā)揮PAP酶活性，也可定位于細胞核發(fā)揮轉錄共調控活性[1]，推測該蛋白可能存在跨膜結構域，且不存在信號肽，不是分泌蛋白，定位于細胞質或細胞器中。N-糖基化發(fā)生在粗面內質網(ER)和高爾基體中[11]，由于沒有信號肽，不可能進入ER發(fā)生N-糖基化，推測N-糖基化位點可能不存在。真核生物最普遍的是發(fā)生在高爾基體和ER中的O-GalNAc(O-乙酰半乳糖胺)。研究發(fā)現(xiàn)，大量定位于細胞質和細胞核的蛋白存在單低聚糖O-GlcNAc(O-乙酰葡萄糖胺)方式，這些O-GlcNAc常發(fā)生在Ser/Thr殘基并與磷酸化競爭[12]，這種競爭性修飾對轉錄尤其重要[13]。預測綿羊lipin2存在Thr430和Ser589O-糖基化位點，且分析發(fā)現(xiàn)2個O-糖基化位點位于蛋白無序結構區(qū)域，而大部分的O-GalNAc和O-GlcNAc出現(xiàn)在無序結構中[14]。由于預測綿羊lipin2可能位于細胞質或細胞器，推測該蛋白可能在細胞質或細胞核中發(fā)生O-GlcNAc，并與磷酸化存在競爭關系，參與轉錄調控。磷酸化調控lipins亞細胞定位進而調控其功能的發(fā)揮。高度磷酸化的lipin1在細胞質中富集，去磷酸化的lipin1在ER/核膜上富集，肝細胞質中檢測到了磷酸化的lipin2[1]。這與磷酸化調控蛋白質亞細胞定位相一致[15]。預測綿羊lipin2存在Ser、Thr和Tyr共89個磷酸化位點，包括Ser 106。Ser106是哺乳動物lipins和酵母Pah1p/Smp2p的保守位點，位于Lipin_N結構域內，是胰島素刺激lipin1和lipin2磷酸化的主要位點[1]。預測發(fā)現(xiàn)大多數(shù)磷酸化位點位于該蛋白無序結構區(qū)域，而無序結構是磷酸化的熱點區(qū)域[16]。因此綿羊lipin2可能存在多個磷酸化位點，對細胞定位和功能活性發(fā)揮調控作用。二硫鍵影響蛋白質的正確折疊和結構穩(wěn)定性。真核生物二硫鍵的氧化發(fā)生在ER腔，然而研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)定位于還原性細胞漿中的蛋白質也會受細胞氧化還原狀態(tài)的影響形成暫時的二硫鍵，從而影響蛋白質功能與性狀。由細胞質線粒體產生的活性氧(ROS)參與細胞表面蛋白質二硫鍵的形成，并通過這一新機制調節(jié)蛋白質的折疊與轉運[17]。因此認為兩類亞蛋白質組(Sub-proteomes)構成二硫化物蛋白質組，即一個結構基團和一個氧化還原基團，后者對于細胞有直接的功能活性，并且是對氧化還原很敏感的基團[17]。預測綿羊lipin2 14個Cys中形成6對二硫鍵，由于預測不含信號肽，不可能進入ER內完成巰基氧化二硫鍵的形成，此外預測綿羊lipin2為不穩(wěn)定蛋白，可能不存在結構性二硫鍵。推測綿羊lipin2定位于細胞質或細胞核中，接受來自細胞質線粒體產生的ROS，氧化Cys生成二硫鍵。是否形成二硫鍵及其與蛋白功能的關系尚待研究證實。

3.3 Lipin2氨基酸序列相似性及不同種群遺傳分化綿羊與山羊、家牛等11種脊椎動物lipin2氨基酸序列相似性較高，綿羊與比對物種lipin2氨基酸序列同源，系統(tǒng)發(fā)育樹與生物進化的物種樹以及動物分類學基本一致，表明該基因在進化上高度保守，這與有重要功能的蛋白質氨基酸替換速率較低[18]相一致。綿羊lipin1和lipin2氨基酸序列相似性較低(66%)，比對發(fā)現(xiàn)保守區(qū)域(N-末端和C-末端)相似性較高，非保守序列相似性較低。研究表明3個lipin蛋白在 亞細胞定位[5]、PAP酶活性[6]以及轉錄共激活調控機制[7]等存在較大差異。且二級結構預測發(fā)現(xiàn)lipin2的蛋白質結合位點大多位于非保守序列，認為低相似性的非保守序列可能對各lipin成員具有特定調控作用，導致同一物種lipin成員間功能活性的差異。

4 結 論

綿羊Lpin2基因CDS區(qū)全長2 670 bp，編碼889個氨基酸組成的不穩(wěn)定中性親水性蛋白。預測綿羊lipin2沒有信號肽，存在2次跨膜，定位于細胞質或細胞器中。預測存在2個O-糖基化位點和89個磷酸化位點，預測存在二硫鍵。綿羊與山羊、家牛等11種脊椎動物lipin2氨基酸序列同源，Lpin2基因編碼區(qū)生物進化高度保守。

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Cloning and Bioinformatics Analysis on CDS of Lpin2 Gene in Sheep

JIAO Xiao-li1,2, JING Jiong-jie1, QIAO Li-ying1, LI Liu-an2, LI Bao-jun1, LIU Wen-zhong1
( 1. College of Animal Science and Technology, Shanxi Agricultural University, Shanxi Taigu 030801, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

In this study, the CDS region of sheep Lpin2 gene was cloned by using the RT-PCR, 5'-RACE, TA cloning techniques and the bioinformatics analysis was performed, so as to provide the basic data for further exploring the genetic characters of this gene and the function mechanism of its encoding protein. As a result, the 2 754 bp length Lpin2 gene was obtained by cloning, including the 84bp length 5'UTR and the 2 670bp length CDS regionand encoding 889 amino acids. Bioinformatics analysis revealed that the encoding protein of sheep lipin2 was an unstable, neutral and hydrophilicfat-soluble proteinwith transmembrane domains, two potential O-glycosylation sites and 89 phosphorylation sites, while without signal peptide, resides in the cytosol or organelle. The potential disulphide bonds may be formed by the reactive oxygen species (ROS) produced by mitochondria in cytoplasm by the mechanism of cell redox status regulation. The secondary structure of lipin2 was mainly loop (80.54%). Two evolutionarily conserved domains of Lipin_N and LSN2 were located at the N- terminal and C-terminal of lipin2, respectively. Amino acid sequences of lipin2 were homologous between sheep and goat, cattle, alpaca, pig, dog, primates and rodents as well as chicken, and phyletic evolution was the same as their genetic relationship, which suggested that the coding region of Lpin2 gene was conservative in the course of evolution. The amino acid sequence similarity was low between lipin1 and lipin2 in sheep (66%) which was possibly related to the dif f erent function activities between them.

Sheep; Lpin2 gene; Cloning; Bioinformatics

S826 .2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-049

2016-10-19；

2017-01-11

國家自然科學基金（31372292）

焦小麗(1974-)，女，山西壺關人，博士，講師，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail: jxlwjh@126.com

* 通訊作者：劉文忠，E-mail: tglwzyc@163.com