李高志，朱亞軍，周生財，陸云峰，張俊紅，童再康

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省慶元縣實驗林場，浙江 慶元323800）

2種葉型楨楠對低溫脅迫的生理響應及耐寒性分析

李高志1，朱亞軍1，周生財2，陸云峰1，張俊紅1，童再康1

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省慶元縣實驗林場，浙江 慶元323800）

以大葉與小葉2種葉型楨楠Phoebe zhennan的1年生實生苗為試驗材料，研究低溫脅迫對其生理生化指標的影響及耐寒性。結果表明：低溫脅迫下，2種葉型楨楠的相對電導率總體呈上升趨勢，丙二醛（MDA）質量摩爾濃度、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性及可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸質量分數(shù)總體呈先上升后下降趨勢。－4.0℃前，大葉楨楠相對電導率呈波動變化，略有上升，小葉楨楠相對電導率則持續(xù)上升，且顯著高于大葉楨楠。大葉楨楠丙二醛質量摩爾濃度增幅較小，SOD和POD活性和可溶性糖質量分數(shù)峰值高于小葉楨楠，而可溶性蛋白和脯氨酸質量分數(shù)峰值低于小葉楨楠。用主成分分析和隸屬函數(shù)法對2種葉型楨楠耐寒性進行綜合性評價，發(fā)現(xiàn)大葉楨楠耐寒性強于小葉楨楠。綜合各測定指標可以認為，小葉楨楠在0.1℃低溫下生理上即表現(xiàn)出凍害損傷，而大葉楨楠可耐－4.0℃的低溫脅迫。圖3表4參42

植物學；楨楠；低溫脅迫；生理生化指標；綜合評價

楨楠Phoebe zhennan是樟科Lauraceae楠屬Phoebe的常綠喬木，材質優(yōu)良，樹姿優(yōu)美，屬上等的材用和庭院綠化樹種，為中國著名 “金絲楠木”的重要原植物，產(chǎn)于四川、貴州西北部及湖北西部［1］。楨楠對低溫敏感，嚴重制約其栽培地域。為此，研究楨楠的耐寒特性，掌握它在低溫脅迫下的生理生化指標變化，為選育抗寒品種提供科學基礎，對擴大楨楠的栽培區(qū)域具有重要意義。低溫作為重要的非生物脅迫因子，對植物生長發(fā)育具有重要影響，可以造成植物礦質營養(yǎng)吸收、光合作用、呼吸作用和新陳代謝等生理過程的紊亂，對質膜和細胞結構造成損害［2－4］。林木抗寒性生理方面的研究已有諸多報道，在楊樹Populus，葡萄Vitis vinifera，梨Pyrus，核桃Juglans regia等植物［5-8］的抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，植物的抗寒性與相對電導率、相對含水率、水分飽和缺、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）和可溶性糖等具有相關性。目前，有關楠屬植物抗寒性方面的研究還較少，滕開瓊［9］研究發(fā)現(xiàn)超氧自由基產(chǎn)生速率，MDA，SOD和過氧化氫酶（CAT）活性能較好地反映楨楠幼苗的耐低溫能力，可作為鑒定其抗寒性的生理指標。宗衛(wèi)［10］研究發(fā)現(xiàn)，自然低溫下氯化鈣和水楊酸處理可以降低閩楠Phoebe bournei和楨楠幼苗的相對電導率和丙二醛含量，提高POD活性及可溶性糖、可溶性蛋白與葉綠素質量分數(shù)，提高植株的耐寒性。自然楨楠群落中存在大葉與小葉2種葉型，大葉型楨楠其正常葉較大，先端漸尖；小葉型楨楠的葉片較小，尾尖，觀測發(fā)現(xiàn)兩者的耐寒性不同。楨楠不同葉型對低溫的生理響應比較尚未見報道。本試驗選取了2種葉型的1年生楨楠，研究低溫脅迫對其葉片膜系統(tǒng)、抗氧化酶活性及滲透物質含量的影響，并運用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對其耐寒性進行綜合評價，為楨楠的抗寒品種評價、選育與引種栽培提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以大葉和小葉2種葉型楨楠的1年生實生苗為供試材料，選擇生長健壯、長勢相近的容器苗各12株。大葉楨楠采種于四川省雅安市（29°46′08.1″N，102°52′13.4″E，海拔為860 m）；小葉楨楠采種于貴州省黔南布依族苗族自治州甕安縣（27°06′57.7″N，107°40′32.7″E，海拔為813 m）。

1.2 試驗方法

2015年12月10日將試驗材料移入Snijders MC1000HE-EV智能低溫人工氣候箱（荷蘭Snijders公司）中進行低溫脅迫處理。將2個葉型楨楠容器苗分成3組，即設3次重復，4株·處理-1。溫度梯度設置為8.0℃（對照），4.0℃，0.1℃（該儀器不可設置0℃），－4.0℃，－8.0℃，－12.0℃，各個溫度梯度處理24 h。

1.3 樣品采集

在各溫度梯度處理結束后采集葉片，用蒸餾水擦凈表面污物，將葉片剪碎、混勻后，進行生理指標的測定，重復3次。

1.4 測定方法

質膜透性的測定：參照蔡慶生［11］的方法，采用電導儀法測定相對電導率。相對電導率（%）=（E1－E0）/（E2－E0）×100%，其中：E0為對照電導率值，E1為處理電導率值，E2為處理煮沸后電導率值。丙二醛（MDA）測定采用硫代巴比妥酸法。

抗氧化酶活性測定：過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［12］，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒測定（南京建成生物研究所）。

有機溶質測定：參照張治安等［12］的方法，可溶性糖采用蒽酮法測定，可溶性蛋白采用考馬斯亮蘭染色法測定，脯氨酸采用脯氨酸（Pro）測定試劑盒測定（南京建成生物研究所）。

1.5 楨楠耐寒性綜合評價方法

參照劉杜玲等［13-15］的方法，運用主成分分析和隸數(shù)函數(shù)法對楨楠的抗寒性進行綜合分析?？箖鱿禂?shù)=處理測定值/對照測定值×100%。隸屬函數(shù)值U（Xj）=（Xj－Xmax）/（Xmax－Xmin），j=1,2,…,n。其中：Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示第j個綜合指標的最小值；Xmax表示第j個綜合指標的最大值。權重， j=1,2,…,n。其中：權重Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度；Pj為各類型楨楠第j個綜合指標的貢獻率。綜合評定值。其中：Di值為各類型楨楠在低溫條件下用綜合指標評價所得的耐寒性綜合評價值，k為楨楠類型數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運用Excel和DPS軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對2種葉型楨楠相對電導率和丙二醛質量摩爾濃度的影響

2種葉型楨楠在8.0℃時相對電導率差異不顯著，隨溫度降低小葉楨楠相對電導率呈持續(xù)上升規(guī)律，4.0℃時已達顯著水平，－8.0℃后急劇上升，－12.0℃時升高到峰值82.0%，為對照的284.7%；大葉楨楠相對電導率至4.0℃時顯著升高，之后略有下降，－4.0℃后緩慢升高，－8.0℃時急劇升高，－12.0℃時升高到峰值66.4%，相當于對照的249.7%（圖1A）。

隨處理溫度降低，2種葉型楨楠丙二醛質量摩爾濃度變化均呈先上升后下降趨勢（圖1B）。8.0℃和4.0℃時2種葉型楨楠丙二醛質量摩爾濃度差異不顯著，4.0℃后小葉楨楠的丙二醛質量摩爾濃度急劇增加，到0.1℃時丙二醛質量摩爾濃度的增幅達72.4%，是大葉楨楠增幅的4.6倍。－4.0℃時2種葉型楨楠丙二醛質量摩爾濃度都到達峰值，分別為0.116 5和0.088 1 μmol·g－1，為對照的2.5倍和2.1倍。之后隨溫度降低，丙二醛質量摩爾濃度迅速降低，－8.0℃和－12.0℃時降至較低水平，兩者之間差異不顯著，各自與對照差異也不顯著。由圖1B可以看出：0.1℃和－4.0℃時，小葉楨楠丙二醛質量摩爾濃度和總體變化幅度均顯著高于大葉楨楠，可見低溫脅迫對小葉楨楠的破壞更嚴重。

圖1 低溫脅迫對相對電導率（A）和丙二醛質量摩爾濃度（B）的影響Figure 1 Effect of low temperature stress on relative conductivity（A）and content of MDA（B）

2.2 低溫脅迫對楨楠抗氧化酶活性的影響

圖2A可以看出：低溫處理前期楨楠的SOD活性升高。8.0℃時小葉楨楠SOD活性顯著高于大葉楨楠，至4.0℃時2種葉型楨楠的SOD活性均顯著增加到較高水平。其中大葉楨楠SOD活性上升速度更快，之后保持在較高水平，4.0℃和0.1℃時，兩者差異不顯著，－4.0℃時大葉楨楠SOD仍保持較高活性，而此時小葉楨楠SOD活性已顯著降低，兩者差異顯著。POD活性變化趨勢2種葉型楨楠相似，呈先上升后下降（圖2B）， 從8.0℃至4.0℃間，小葉楨楠POD活性增加了116.3%，達到顯著水平，大葉楨楠僅增加了29.3%，未達到顯著水平?？梢娦∪~楨楠比大葉楨楠對低溫更敏感。之后，兩者POD活性都急劇上升，至0.1℃時大葉楨楠和小葉楨楠的POD活性都達到峰值，分別為2 753.3×16.67 nkat·g－1，1 776.7×16.67 nkat·g－1，為對照的224.5%和464.8%，且在各溫度下大葉楨楠的POD活性均顯著高于小葉楨楠。從圖2可見：低溫脅迫下大葉楨楠的SOD和POD活性均明顯高于小葉楨楠，－4.0℃時活性分別是小葉楨楠的1.6倍，1.5倍。

圖2 低溫脅迫對SOD（A）和POD（B）活性的影響Figure 2 Effect of low temperature stress on the activity of SOD（A）and POD（B）

2.3 低溫脅迫對有機溶質質量分數(shù)的影響

不同低溫脅迫下2種葉型楨楠的可溶性糖質量分數(shù)的測定結果見圖3A。處理溫度在不低于－4.0℃時，2種葉型楨楠的可溶性糖質量分數(shù)隨溫度降低均連續(xù)上升，－4.0℃時2種葉型楨楠可溶性糖質量分數(shù)都升高到峰值，分別為77.52，84.27 mg·g－1，是對照的1.7倍和1.5倍。小葉楨楠可溶性糖質量分數(shù)在4.0℃，0.1℃，－4.0℃時增幅分別為14.9%，23.4%，16.7%，變化均達到顯著水平；大葉楨楠可溶性糖質量分數(shù)4.0℃時變化未達到顯著水平，之后增幅較大，0.1℃和－4.0℃時分別為17.6%和20.1%，差異顯著。各處理溫度下，大葉楨楠可溶性糖質量分數(shù)始終高于小葉楨楠，除0.1℃外，差異都到達顯著水平。

圖3 低溫脅迫對可溶性糖（A），可溶性蛋白（B）和脯氨酸（C）質量分數(shù)的影響Figure 3 Effect of low temperature stress on the content of soluble sugar（A）,soluble protein（B）and proline（C）

2種葉型楨楠不同處理溫度下的可溶性蛋白質量分數(shù)如圖3B所示，8.0℃至4.0℃間均顯著升高，4.0℃時均達到了顯著差異水平。隨著處理溫度的進一步降低，小葉楨楠進一步升高，0.1℃時達到峰值；而大葉楨楠4.0℃后已呈下降趨勢。0.1℃后2種楨楠的可溶性蛋白質量分數(shù)均下降，－4.0℃，－8.0℃，－12.0℃時與對照差異都不顯著。低溫脅迫下小葉楨楠可溶性蛋白質量分數(shù)和變化幅度都大于大葉楨楠。

不同處理溫度下2種葉型楨楠的脯氨酸質量分數(shù)變化如圖3C所示，均呈先升高后降低的變化趨勢。其中小葉楨楠增長幅度顯著大于大葉楨楠，4.0℃，0.1℃和－4.0℃時脯氨酸質量分數(shù)增長都達到顯著水平，－4.0℃時質量分數(shù)最大為116.54 μg·g－1，較對照增長174.3%。大葉楨楠在0.1℃之前脯氨酸質量分數(shù)變化呈緩慢增加，0.1℃至－4.0℃間急劇上升，達到峰值58.65 μg·g－1，較對照增長149.2%。小葉楨楠對低溫響應較早，且相對增幅顯著高于大葉楨楠。

2.4 2種葉型楨楠耐寒性的綜合評價

植物在逆境條件下產(chǎn)生復雜的生理變化過程，單一生理生化指標難以科學評定植物對逆境的適應能力［5,13］。對各指標進行相關性分析，得出相關系數(shù)矩陣（表1）。由相關系數(shù)矩陣可以看出，各項生理指標之間存在相關性，使得它們提供的信息發(fā)生重疊，各單項生理指標在楨楠耐寒中發(fā)揮的作用也不盡相同，為此采用主成分分析法進行綜合性評價。綜合考慮各種溫度處理下各生理生化指標變化趨勢，選?。?.0℃低溫處理下的各項指標進行2種葉型楨楠耐寒性的綜合評價。根據(jù)各項指標值，計算各項指標的耐寒系數(shù)（表2）。

表1 各單項測定指標的相關系數(shù)矩陣Table 1 Correlation matrix of each single index

表2 各單項指標的耐寒系數(shù)Table 2 Freezing resistant coefficient of each single index

對各單項指標進行主成分分析，提取前2個主成分作為綜合指標，它們的貢獻率分別為：73.17%和19.73%，累積貢獻率達到92.90%（表3）。根據(jù)隸屬函數(shù)計算公式計算出2種葉型楨楠綜合指標的隸屬函數(shù)值，再取各綜合指標的貢獻率，用權重計算公式計算各綜合指標的權重，得出2個綜合指標的權重為0.787 6和0.212 4（表4）。

表3 各綜合指標的系數(shù)和貢獻率Table 3 Coefficient of comprehensive index and their contribution rate

表4 各綜合指標值、權重、隸屬函數(shù)值和綜合評定值Table 4 The value of comprehensive index,index weight,U（Xi）and Di

用綜合評定值公式計算各類型楨楠低溫脅迫下綜合評定值Di。根據(jù)D值（表4），對不同類型楨楠的耐寒性進行比較，D值越大，耐寒性越強。結果顯示，小葉楨楠和大葉楨楠的綜合評定值分別為0.414 1和0.514 3，表明大葉楨楠的耐寒性強于小葉楨楠。

3 討論與結論

相對電導率和丙二醛在低溫脅迫下變化的研究已有諸多報道，植物受到低溫逆境脅迫后，其膜脂首先發(fā)生相變，由液晶相轉變成凝膠相，使膜透性發(fā)生改變，胞內離子外滲［16］，引起相對電導率升高。丙二醛是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物［17］，為此，相對電導率和丙二醛質量摩爾濃度常作為反映生物膜受傷害程度的指標［18-20］，且與植物的抗寒能力呈負相關。本研究表明，2種葉型楨楠經(jīng)低溫處理后，葉片相對電導率升高，與葡萄，杏Armeniaca vulgaris，藜麥Chenopodium quinoa等植物［6,21-22］低溫脅迫下的測定結果一致，說明在一定低溫下，楨楠葉片的細胞膜透性被損壞。2種葉型楨楠丙二醛質量摩爾濃度均先上升后下降，這與黑殼楠Lindera megaphylla，墨西哥玉米Zea mexicana等植物［23-24］低溫脅迫下的測定結果一致，前期上升說明低溫引起楨楠葉片細胞膜質過氧化，且隨著溫度降低，過氧化程度不斷加劇。2種葉型楨楠相對電導率和丙二醛質量摩爾濃度變化幅度明顯不同，表明2種葉型楨楠的耐寒性存在差異，在0.1℃時，小葉楨楠雖然葉片、枝干上尚未出現(xiàn)外觀變化，但已出現(xiàn)明顯的細胞膜傷害，而大葉楨楠則在－4.0℃時出現(xiàn)這種生理變化，可以認為大葉楨楠耐寒性顯著高于小葉楨楠。

植物體內存在抗氧化酶保護系統(tǒng)，正常條件下活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)［25］。低溫脅迫下，植物會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，為抵御活性氧對細胞的傷害，植物抗氧化酶活性增強，以清除活性氧。但這種清除作用存在限制，隨著自由基的大量產(chǎn)生，當清除速度小于生成速度時，則動態(tài)平衡被打破，對植物細胞造成傷害［26］。本試驗發(fā)現(xiàn)，SOD和POD活性均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，說明楨楠在脅迫前期，產(chǎn)生了顯明的應激反應，通過提高SOD和POD活性來消除體內產(chǎn)生的自由基，抵御低溫帶來的傷害，與前人的研究結果一致［6,27-28］。大葉楨楠SOD上升幅度顯著高于小葉楨楠，該結果印證了細胞膜透性的變化趨勢，證實在0.1℃脅迫下，小葉楨楠的的活性氧自由基已超出其自身的清除能力，產(chǎn)生了冷凍傷害，而大葉楨楠此時還處于上升階段，但到－4.0℃后呈下降趨勢。

低溫脅迫下植物通過積累可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等物質降低細胞滲透勢，保護生物膜，維持細胞結構提高植物自身對低溫的適應性［29-33］。多數(shù)研究認為低溫脅迫下，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等物質的質量分數(shù)與植物抗寒性正相關。但在黑麥草Lolium perenne［34］和結縷草Zoysia japonica［35］等的研究中發(fā)現(xiàn)可溶性糖質量分數(shù)與植物抗寒性無相關關系；武蘭芳［36］在研究低溫下玉米Zea mays可溶性蛋白質量分數(shù)變化時發(fā)現(xiàn)，隨著低溫處理時間的延長可溶性蛋白質量分數(shù)逐漸降低；JACKSON［37］，何開躍等［38］認為：脯氨酸的積累可能是植物對低溫的一種適應或者細胞受損的一種表現(xiàn)，與植物的耐寒能力無明確相關關系。本研究表明：低溫脅迫下，楨楠的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸質量分數(shù)均逐漸升高，在達到一定的臨界低溫后，呈現(xiàn)下降的趨勢，這與楊玉珍等［39］的研究一致。可以認為：低溫脅迫下楨楠可通過生成有機溶質來抵御低溫傷害，但3類物質出現(xiàn)峰值的低溫不同，且2種葉型楨楠間也不相同。其中大葉楨楠的可溶性糖質量分數(shù)顯著高于小葉楨楠，而可溶性蛋白和脯氨酸質量分數(shù)則顯著低于小葉楨楠。由此可見：植物在低溫脅迫下可誘導有機溶質的產(chǎn)生，并隨細胞功能的損害而下降，但其質量分數(shù)直接用于衡量其耐寒能力具有一定的局限性。

植物的耐寒性是受多種因素影響的數(shù)量性狀［13］，在低溫脅迫下涉及多種生理生化指標的變化，難以采用單一指標對耐寒性做出準確評價［40］。主成分分析法作為綜合評價植物抗性的方法，目前已在茶樹Camellia sinesis，葡萄等［41-42］多種植物的耐寒性評價上被采用。本試驗采用7個單項指標并根據(jù)其貢獻率的大小組合成2個綜合指標評價楨楠的耐寒性強弱，再結合隸屬函數(shù)法，得到2種葉型楨楠的綜合評定值，對小葉楨楠和大葉楨楠的耐寒性做出綜合性評價，證實了大葉楨楠耐寒性優(yōu)于小葉楨楠。

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Physiological indices at low temperature stress for two types of Phoebe zhennan

LI Gaozhi1,ZHU Yajun1,ZHOU Shengcai2,LU Yunfeng1,ZHANG Junhong1,TONG Zaikang1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Experimental Forest Farm of Qingyuan County,Qingyuan 323800,Zhejiang,China）

Phoebe zhennan is vulnerable to low temperature,triggering the physiological and phenotypic damages in plants.To make scientific and accurate evaluations for cold-resistance with two types of P.zhennan（large-leaf and small-leaf）,a comparison of physiological and biochemical characteristics between the two types was conducted using 1-year-old seedlings with artificial low temperature stress,using complete randomized block design,with three replication.A membership function method was conducted,and analysis included a principal components analysis.Results showed that the relative conductivity of the two leaf types increased significantly with low temperature stress;whereas,contents of malondialdehyde （MDA）,soluble sugar,soluble protein and proline,and the activity of peroxidase（POD）and superoxide dismutase（SOD）increased significantly,peaked at 0.1℃and－4.0℃in small-leaf and large-leaf type,respectively,and then decreased significantly.The leaf relative conductance rate of the large-leaf type fluctuated from 8.0 to－8.0℃,but the smallleaf type continued to rise higher significantly than the large-leaf type.The increases in MDA,soluble protein, and proline content in the large-leaf type were lower significantly than those of the small-leaf type,and peak values of soluble protein and proline were higher significantly in the large-leaf type.Analysis revealed that the small-leaf type exhibited cold damage at 0.1℃,but the large-leaf type resisted damage to－4.0℃stress,which provides important clues for the breeding and introduction cultivation in P.zhennan.［Ch,3 fig.4 tab.42ref.］

botany;Phoebe zhennan;low-temperature stress;physiological and biochemical indexes;comprehensive evaluation

S718.43；Q945.78

A

2095-0756（2017）02-0310-09

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.015

2016-04-19；

2016-05-30

“十三五”浙江省科學技術重大專項（2016C02056-2）；中央財政林業(yè)科技推廣示范項目（2015-TS-02）

李高志，從事珍貴樹種遺傳育種研究。E-mail：ligaozhi0919@163.com。通信作者：童再康，教授，博士，博士生導師，從事珍貴樹種新品種選育研究。E-mail：zktong@zafu.edu.cn