何少斌, 張一帆, 黃惠南, 林志強(qiáng)*, 陳 偉

(1.泉州市傳染病防治醫(yī)院,福建泉州 362000; 2.泉州市第一醫(yī)院,福建泉州 362000;3.福建醫(yī)科大學(xué)納米醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所,福建福州 350000)

1 引言

生物在進(jìn)化過程中形成外形多樣化并能在生物體復(fù)制的復(fù)雜生物，而自身通過生物礦化形成硬質(zhì)的無機(jī)材料[1 - 3]，如趨磁性細(xì)菌產(chǎn)生Fe3O4或FeS納米粒子，可以在磁場定位和遷移[4 - 5]，海膽的脊椎內(nèi)能形成非晶相的礦化物[6]，海綿產(chǎn)生有光導(dǎo)纖維特性的SiO2，硅藻產(chǎn)生SiO2作為細(xì)胞壁等[7 - 10]?？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)用生物分子中的小肽或蛋白質(zhì)制備納米材料是一種有效手段，在表面修飾以及生物檢測等領(lǐng)域有應(yīng)用前景。生物轉(zhuǎn)化過程可以在溫和條件下進(jìn)行,利用生物體或生物質(zhì)為模板還原制備納米顆粒過程環(huán)保，可以充分利用綠色的生物質(zhì)資源[11]，因而通過生物礦化法，利用蛋白質(zhì)為模板合成特異性多功能納米材料成為近年來的熱點。一些常見的蛋白質(zhì)在序列性質(zhì)上與礦化的蛋白質(zhì)相似，利用這些蛋白質(zhì)作為模板制備納米材料具有明顯優(yōu)勢[12]，如溶菌酶[13]、淀粉酶[14]、胃蛋白酶[15]以及牛血清白蛋白(BSA)[16]等。

BSA包含583個氨基酸殘基，等電點為4.7，在生化實驗中常作為封閉劑(Blocking Agent)應(yīng)用在免疫印跡技術(shù)(Western Blot)中。結(jié)合納米金屬材料(Au、Ag、Cu、Pt)優(yōu)良的電學(xué)、熒光、催化等性能，BSA模板法制備金屬納米材料在近年得到飛速發(fā)展。酪氨酸的酚羥基，天冬氨酸的羧基等，使BSA不僅是模板，也是離子的還原劑，BSA外殼也可明顯提高材料的穩(wěn)定性，易于表面修飾等優(yōu)勢，此外，半胱氨酸殘基還能夠用于量子點的生長[17 - 18]。本文就近年來利用BSA為模板制備金屬復(fù)合納米材料的研究進(jìn)行綜述，包括種類、合成方法、性能和在生物檢測中的應(yīng)用。

2 牛血清白蛋白-金屬復(fù)合納米材料的制備及應(yīng)用

2.1 牛血清白蛋白-金復(fù)合納米材料

Xie等[19]首先報道BSA介導(dǎo)的紅色熒光金納米簇(BSA-AuNCs的制備)，在堿性條件下BSA中的還原基團(tuán)還原氯金酸生成Au納米簇，合成過程溫和無毒，且產(chǎn)物擁有尺寸小、水溶性好、易于修飾、模擬酶活性好及熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點，在傳感檢測、納米標(biāo)記、醫(yī)學(xué)成像和光電子學(xué)等領(lǐng)域具有潛質(zhì)。隨后，越來越多與BSA-AuNCs相關(guān)的制備方法及檢測方法被陸續(xù)報道。BSA-AuNCs作為熒光探針已成功用于陽離子、陰離子及重要的生物物質(zhì)，如H2O2、葡萄糖、谷胱甘肽、三磷酸腺苷、氨基酸等小分子化合物的檢測，利用其模擬酶活性，H2O2、黃嘌呤、尿酸被成功檢測。

2.1.1基于BSA-AuNCs熒光特性的離子檢測作為一種普遍存在于大自然中的有毒離子，Hg2+可對大腦、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟等造成極大的傷害，因此對Hg2+的檢測尤為重要。已合成的BSA-AuNCs熒光團(tuán)簇由25個金原子組成，具有紅色熒光(發(fā)射波長=640 nm)，熒光量子產(chǎn)率為6%。Xie等[20]的研究認(rèn)為Hg2+與Au+能夠相互作用，該作用使原本擁有熒光的BSA-AuNCs發(fā)生熒光猝滅，Hg2+的檢測限可低至0.5 nmol/L。Hu等[21]同樣利用Hg2+對BSA-AuNCs熒光選擇性猝滅作用，成功檢測湖水、自來水等實際樣品中的Hg2+，檢測限為80 nmol/L。Hu提出了可能的檢測機(jī)制，認(rèn)為檢測過程是光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的過程，該過程的BSA-AuNCs與Hg2+首先通過Hg-S鍵結(jié)合，電子在光照條件下被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，Hg2+攔截電子還原成Hg+，從而破壞了空穴和激發(fā)電子的輻射重組，進(jìn)而抑制熒光特性。隨著BSA-AuNCs研究的進(jìn)展，Wang等[22]提出了不同的抑制機(jī)理，認(rèn)為Hg2+是結(jié)合BSA表面豐富的氨基和羧基導(dǎo)致金納米簇?zé)晒忖?，利用此機(jī)理構(gòu)建了Hg2+的檢測體系，檢測限為0.1 nmol/L，該方法成功應(yīng)用于湖水中Hg2+的檢測。在Hg2+檢測的啟發(fā)下，更多的團(tuán)隊借鑒并取得不錯的研究進(jìn)展[23 - 24]。

Sreenivasan等[25]在研究離子對BSA-AuNCs的影響時發(fā)現(xiàn)，Cu2+能夠與包覆表面的BSA結(jié)合從而影響AuNCs的熒光，該檢測方法成功地檢測了活體細(xì)胞中的Cu2+，方法的檢測限為50 μmol/L。根據(jù)BSA在等電點時有很好的成膜能力，Chi等[26]制備了熒光金納米簇膜(FGM)，利用Cu2+對FGM的熒光抑制檢測Cu2+，此外加入組氨酸可以恢復(fù)FGM的熒光，繼而達(dá)到FGM的可持續(xù)使用性，Cu2+的檢測限為0.5 μmol/L。Yu等[27]發(fā)現(xiàn)利用超聲化學(xué)法合成的BSA-AuNCs可以提高其對Cu2+的靈敏檢測，其檢測限低至0.3 nmol/L。

Chen等[28]首次利用BSA-AuNCs的電致化學(xué)發(fā)光實現(xiàn)了對Pb2+的檢測，推測其原理為：當(dāng)Pb2+的加入，因與硫鍵有較強(qiáng)的結(jié)合力，使得BSA-AuNCs的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低，從而實現(xiàn)對Pb2+的檢測。Zheng等[29]提出了Ni2+與BSA-AuNCs之間的靜態(tài)抑制作用，進(jìn)而抑制了Au納米簇的熒光強(qiáng)度，其檢測限為10 nmol/L。Wu等[30]利用微波輔助合成熒光增強(qiáng)傳感器，其內(nèi)核有16個納米Au原子，Ag+通過金屬鍵結(jié)合后被BSA還原沉積在納米Au表面，使得熒光增強(qiáng)，從而測定Ag+，檢測限為0.10 μmol/L。CN-能夠通過生物鏈的富集作用沉積在生物體內(nèi)使其引發(fā)疾病，對人體也有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，因而對于CN-的檢測有重要意義。Lu[31]的團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)CN-能夠作用Au原子發(fā)生刻蝕，通過此作用能夠是BSA-AuNCs熒光猝滅，CN-的檢測限為200 nmol/L。

2.1.2基于BSA-AuNCs熒光特性的生物分子檢測根據(jù)Chang等[32]所述原理，H2O2能夠氧化Au-S鍵是其成為有機(jī)二硫化物，導(dǎo)致熒光減弱?；谙嗤脑?，Dong等[33]合成BSA-AuNCs檢測H2O2，檢測限為300 nmol/L。Dong的團(tuán)隊還檢測了血液的葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶系統(tǒng)和BSA-AuNCs可間接地檢測葡萄糖，檢測限為5.0 μmol/L。腦內(nèi)的乙酰膽堿與認(rèn)知活動，神經(jīng)信號的傳遞密切相關(guān)，基于乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶系統(tǒng)，可將乙酰膽堿選擇性水解和氧化為H2O2，如先前所述，Chen等[34]利用H2O2抑制BSA-AuNCs的熒光可檢測乙酰膽堿的含量，其檢測范圍為0.1～20 nmol/L，檢測限為5 pmol/L。

眾所周知，氨基酸作為構(gòu)建生物機(jī)體的生物分子，也是構(gòu)建細(xì)胞的基本。Zhang等[35]利用BSA-AuNCs中的BSA和AuNCs分別具有藍(lán)色和紅色熒光(發(fā)射波長在425和635 nm)，通過靜電的作用制成BSA-AuNCs-Ni2+、BSA-AuNCs-Pb2+、BSA-AuNCs-Cd2+和BSA-AuNCs-Zn2+，利用氨基酸與上述離子的結(jié)合使得BSA-AuNCs熒光增強(qiáng)，可以實現(xiàn)對不同氨基酸的檢測。基于BSA-AuNCs-Ni2+，Song等[36]成功檢測了人體血樣的組氨酸，檢測限為30 nmol/L，原理認(rèn)為是因為Ni2+與組氨酸的氨基、羧基以及咪唑相結(jié)合，成功恢復(fù)了BSA-AuNCs的熒光。Liu等[37]提出半胱氨酸可以通過其巰基與BSA-AuNCs結(jié)合降低其表面缺陷使得BSA-AuNCs的熒光增強(qiáng)，檢測限為1.2 nmol/L，此為少數(shù)通過熒光增強(qiáng)機(jī)理用BSA-AuNCs檢測有機(jī)分子的方法之一。作為氨基酸衍生物及重要的抗腫瘤藥物，甲氨蝶呤可線性抑制BSA-AuNCs的熒光從而被檢測，Chen等[38]成功檢測了人體尿液的甲氨蝶呤，檢測限為0.9 ng/mL。Yao等[39]基于BSA-AuNCs熒光檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其實驗原理認(rèn)為是在BSA-AuNCs和木瓜蛋白酶體系中，當(dāng)沒有半胱氨酸蛋白酶抑制劑，木瓜蛋白酶會分解BSA導(dǎo)致Au納米簇?zé)晒獾拟?，反之熒光則不會猝滅，從而檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑，檢測限為4.0 ng/mL。

一些有機(jī)小分子如戊二醛、維生素B12、焦磷酸鹽、多巴胺等也都先后被驗證了對Au納米簇的熒光有響應(yīng)。由于戊二醛與氨基生成希夫堿，Hou等[40]用BSA-AuNCs檢測了水樣中的戊二醛，戊二醛與BSA的結(jié)合使得Au的熒光抑制，檢測限為200 nmol/L。維生素B12能后參與骨髓紅細(xì)胞的制造，防止大腦神經(jīng)被破壞，Shamsipur等[41]報道了用BSA-AuNCs檢測維生素B12，由于兩者發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，可以用來檢測維生素B12，其靈敏性好，可用于醫(yī)藥制劑中維生素B12的檢測。Liu等[42]利用Cu2+與BSA中的甘氨酸結(jié)合實現(xiàn)BSA-AuNCs熒光猝滅，再利用焦磷酸與Cu2+的結(jié)合增強(qiáng)BSA-AuNCs的熒光，可檢測焦磷酸，其檢測限為83 nmol/L。

胰蛋白酶是蛋白酶的一種，作為胰液的成分而分泌，是胰腺獨有的肽鏈內(nèi)切酶，在小腸中對蛋白質(zhì)消化有著無法替代的作用，它在體內(nèi)的數(shù)值與急性胰腺炎、胰腺癌患者和囊性纖維化等胰腺疾病密切相關(guān)。Xu等[43]基于BSA-AuNCs熒光抑制成功檢測了胰蛋白酶的濃度，線性范圍為0.01～100 μg/mL，檢測限為2 ng/mL，并驗證了該方法在尿液樣品中胰蛋白酶的檢測，該方法可應(yīng)用于胰腺疾病的初步篩查，具有潛在的臨床意義。

2.1.3基于BSA-AuNCs模擬酶的檢測近年來，模擬酶特性成為研究熱點。過氧化物酶可高效催化氧化H2O2，而H2O2又是生物反應(yīng)中重要的中間物質(zhì)，對H2O2以及相關(guān)生化物質(zhì)的測定對臨床診斷具有重要的意義[44]。過氧化物模擬酶涉及的物質(zhì)包括Fe3O4納米粒子，血紅蛋白，氯化血紅素，金屬卟啉，金屬酞菁等[45 - 50]。除了熒光特性，BSA-AuNCs被證實具有過氧化物模擬酶活性。

Wang等[51]利用BSA-AuNCs的模擬酶活性，催化底物TMB顯色，選擇性檢測了黃嘌呤，黃嘌呤是一種廣泛分布于人體及其他生物體的器官及體液內(nèi)的一種嘌呤堿，在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)換為尿酸和H2O2，也是心肌缺血、燒傷及痛風(fēng)等疾病的指標(biāo)之一，檢測H2O2的檢測限為20 nmol/L，黃嘌呤的檢測限為500 nmol/L，并成功應(yīng)用在檢測尿液和血清的黃嘌呤。此后，Zhao等[52]研究了利用過氧化物模擬酶檢測尿酸并驗證了其在人體血清中的可行性，檢測限為360 nmol/L。Qu等[53]利用BSA-AuNCs的熒光和模擬酶雙特性構(gòu)建檢測多巴胺的方法。多巴胺是神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，用來幫助細(xì)胞傳送脈沖的化學(xué)物質(zhì)，在Qu的文章中，基于BSA-AuNCs的熒光抑制，并用多巴胺對過氧化物酶活性的抑制選擇性兩種方法檢測了多巴胺，其檢測限都為10 nmol/L，該團(tuán)隊將此方法成功應(yīng)用在鹽酸鹽、人體血清及PC12細(xì)胞的多巴胺檢測上。

2.2 牛血清白蛋白-Ag復(fù)合納米材料

由于具有熒光、生物相容等特性，Ag納米簇引起了廣泛的興趣，在分析化學(xué)、納米材料科學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都有很重要的研究價值。近年來，Ag納米簇被密集的報道作為熒光納米簇探針[54]，用于檢測多種目標(biāo)物。Schneider等[55]研究了牛血清白蛋白-銀納米簇(BSA-AgNCs)的制備方法，利用BSA為模板，與AgNO3混合后，加入硼氫化鈉生成BSA-AgNCs。Pradeep等[56]發(fā)現(xiàn)在堿性條件下可以生成15個銀原子的BSA-AgNCs，擁有優(yōu)秀的熒光特性。Yang等[57]發(fā)現(xiàn)BSA-AgNCs不僅擁有穩(wěn)定的熒光，并能夠有很好的催化活性，能夠是Ag+在抗環(huán)血酸存在下還原成銀納米粒子。由于銀納米粒子擁有明顯的顏色和等離子共振峰，能夠利用此定量檢測抗環(huán)血酸，其檢測限為160 nmol/L。利用Pradeep的方法制備15個原子的BSA-AgNCs，其擁有兩個發(fā)射波長480 nm和634 nm。Lu等[58]發(fā)現(xiàn)，隨著Hg2+的加入，BSA-AgNCs在480 nm的熒光峰強(qiáng)度會增加，而634 nm處的熒光峰強(qiáng)度減少，通過兩個熒光峰強(qiáng)度的比例可以定量檢測Hg2+，該方法不僅熒光有明顯變化，也可以通過可見光得以區(qū)別，檢測限為48.7 nmol/L。

2.3 牛血清白蛋白-Cu復(fù)合納米材料

目前對亞納米尺度上過渡金屬納米團(tuán)簇研究主要集中于貴金屬Au和Ag，而對處于同族(IB)的Cu納米團(tuán)簇研究相對較少。采用傳統(tǒng)方法得到的Cu納米粒子尺寸較大，且較易氧化。因此穩(wěn)定的Cu納米團(tuán)簇合成方法是金屬團(tuán)簇研究中具有挑戰(zhàn)性的課題之一。Pradeep等[59]利用仿生物礦化法，在堿性條件下合成了牛血清白蛋白-銅納米簇(BSA-CuNCs)，其擁有很好的熒光特性，在420 nm處有發(fā)射波長。該團(tuán)隊利用其熒光特性可以被Pb2+選擇性抑制而用來檢測Pb2+，并驗證了水體中Pb2+的檢測。由蛋白質(zhì)模板的銅納米簇能同時擁有穩(wěn)定性和熒光特性，除此之外，Hu等[60]驗證了BSA-CuNCs的模擬酶活性，利用BSA-CuNCs良好的過氧化物酶活性，催化H2O2顯色底物TMB，從而檢測了H2O2和葡萄糖，H2O2檢測限為10 μmol/L。葡萄糖是由葡萄糖氧化酶選擇性氧化生成目標(biāo)物質(zhì)H2O2，檢測限為100 μmol/L。Cu的穩(wěn)定性相對貴金屬較低，研究熱度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于貴金屬，但由于便宜、易得及獨特的性質(zhì)值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

2.4 牛血清白蛋白-MnO2復(fù)合納米材料

Mn氧化物具有良好的氧電還原催化活性,且價格低廉、豐富易得、環(huán)境友好，已作為潛在的金屬空氣電池陰極催化材料得到研究。近年來納米材料的發(fā)展為Mn氧化物提供了新的契機(jī)，水溶性好和分散性好的無機(jī)納米材料作為模擬酶也一直備受關(guān)注。Liu等[61]利用牛血清蛋白為生物模板控制合成MnO2納米粒子，制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，成本低，所需試劑少，對環(huán)境友好，且得到了分散性好、生物相容性好、粒徑較小、尺寸一致、形貌均一的MnO2納米粒子。利用此制備方法，Liu進(jìn)而證明了BSA-MnO2NPs同時擁有模擬氧化酶和過氧化物酶的特性，利用其氧化酶活性和BSA上的交聯(lián)基團(tuán)，成功應(yīng)用在免疫分析羊抗人-IgG的檢測。Liu[62]的團(tuán)隊進(jìn)而利用BSA-MnO2NPs的氧化酶活性催化TMB顯色檢測了谷胱甘肽。該團(tuán)隊認(rèn)為在BSA-MnO2NPs氧化了TMB體系后，加入谷胱甘肽能夠還原已經(jīng)顯色的TMB，從而使顯色效果降低，該方法成功檢測了谷胱甘肽，其檢測限為100 nmol/L。此方法實現(xiàn)了血清樣品中的回收率試驗驗證了方法的可行性。

2.5 牛血清白蛋白-Pt復(fù)合納米材料

He等[63]以BSA為模板模擬生物礦化作用制備核殼結(jié)構(gòu)的牛血清白蛋白-Pt納米粒子(BSA-PtNPs)。蛋白質(zhì)模板控制金屬內(nèi)核的形貌與尺寸，對PtNPs內(nèi)核具有很強(qiáng)的穩(wěn)定作用。BSA-PtNPs擁有良好的過氧化物酶活性，在H2O2和一定的條件下，能夠催化多種不同的過氧化物酶顯色底物顯色，其對TMB的親和力超過了辣根過氧化物酶，其極強(qiáng)的穩(wěn)定性使其能夠在高鹽濃度中保持很好的活性，很好地解決了材料團(tuán)聚沉降的問題。利用強(qiáng)穩(wěn)定性特性，He的團(tuán)隊構(gòu)建了TOPS-4-AAP-BSA-PtNPs-H2O2顯色體系，直接應(yīng)用檢測嬰兒奶粉的膽堿和血漿的乙酰膽堿，紫外吸光度與膽堿濃度在6～400 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為2.5 μmol/L；乙酰膽堿的線性范圍為10～200 μmol/L，檢測限為2.84 μmol/L。該方法靈敏度高且能夠替代現(xiàn)有的方法進(jìn)行檢測，文章并首次提出該材料的蛋白質(zhì)防污染特性，對材料的研究和應(yīng)用奠定很好的基礎(chǔ)[64]。在制備方法方面，Ai等[65]研究了在酸性(pH=3.2)條件下制備另一種BSA-PtNPs，并利用TMB顯色體系檢測了H2O2，檢測限為7.9 μmol/L。蛋白質(zhì)外殼的結(jié)構(gòu)除了使其擁有很好地穩(wěn)定性，也決定了BSA-PtNPs可擁有蛋白質(zhì)的相關(guān)功能，如聯(lián)接標(biāo)記分子，催化功能，識別作用等，結(jié)合Pt的優(yōu)秀穩(wěn)定性和原子特性，擁有誘人的發(fā)展前景。

3 展望

綜上所述，牛血清白蛋白模板法制備的金屬復(fù)合納米材料不僅具有制備簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷、耐高溫和耐酸堿、性質(zhì)穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢，而且在上述的離子檢測、免疫分析、生物分子檢測等方面已經(jīng)顯示出廣闊的應(yīng)用前景，特別是基于納米材料構(gòu)建的疾病診斷、病理組織檢測、藥物篩選等生物和醫(yī)學(xué)的研究方法具有非常重要的現(xiàn)實意義。相信在不久的將來，利用牛血清白蛋白-金屬復(fù)合納米材料構(gòu)建的方法能被廣泛地開發(fā)并應(yīng)用于上述的學(xué)科領(lǐng)域。