秦瑞云+王少凈+劉新鑫+杜亞茹+王冰肖+李忠徽+閆寧寧+李書粉+高武軍+鄧傳良

摘要：以日本大葉菠菜為供試材料，采用溫室內(nèi)盆栽種植的方式，利用赤霉素（GA3）進行處理，探討其對雌雄異株植物菠菜性別分化的影響。結(jié)果表明，試驗組在第1次處理后植株就有明顯的生長，表現(xiàn)為植株莖稈變長、較對照組粗壯、開花期提前。與對照組相比，試驗組雌雄比例（1.33）明顯大于對照組（0.96）。此外，發(fā)生性反轉(zhuǎn)植株中，雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑昱c雄株轉(zhuǎn)變?yōu)榇浦甑谋壤秊?.14。利用Y染色體緊密連鎖的雄性特異T11A分子標記對性反轉(zhuǎn)植株進行檢測，結(jié)果表明，雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑?，雄性特異條帶出現(xiàn)；雄株轉(zhuǎn)變?yōu)榇浦?，雄性特異條帶消失。本研究結(jié)果為進一步研究激素對菠菜性別分化影響的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菠菜；赤霉素（GA3）；T11A分子標記；性反轉(zhuǎn)；性別分化

中圖分類號： S636.101文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0133-02

菠菜（Spinacia oleracea L.）為藜科菠菜屬一年生或二年生草本植物，染色體組成為（2n=2x=12），具有生長周期短、表型豐富、營養(yǎng)價值高等特點，是一種大面積種植的蔬菜作物。菠菜系雌雄異株植物，其性別分化不但受到性別決定基因控制，還受到激素的影響[1]。在早期研究中，Chailakhyan等認為在長日照類型的菠菜中，赤霉素對性別表現(xiàn)的影響為促進雄性化[2]；El-Gizawy等的研究也表明赤霉素處理菠菜具有促雄作用[3-4]；而曹宗巽等則報道赤霉素在菠菜中有促雌作用[1]。由此可見，不同研究學(xué)者利用赤霉素處理菠菜，其誘導(dǎo)結(jié)果是有差異的。赤霉素對其他植物性別分化的影響也不盡相同，赤霉素可以促使某些植物雄性化，但是也可以導(dǎo)致某些植物雌性化，赤霉素對黃瓜雌性系性別分化的影響表現(xiàn)為能促進雄花分化，阻礙雌花分化[5]。在赤霉素對小桐子處理的試驗中，結(jié)果表明外施赤霉素誘導(dǎo)小桐子雌花中原來停止發(fā)育的雄蕊重新正常發(fā)育，進而將其變成兩性花[6]。在玉米不同的發(fā)育階段，對葉面噴施赤霉素，能夠使玉米雄花穗變成雌性、雄性不育或保持雄性可育[7]。赤霉素還可以誘導(dǎo)寬葉慈菇雄株及三性花同株向雌株性別的轉(zhuǎn)換[8]。

盡管前期有不少學(xué)者研究了赤霉素對菠菜性別分化的影響，并得出了不同的結(jié)論，但是其研究結(jié)果只關(guān)注于赤霉素對菠菜外觀形態(tài)特征的影響，至于赤霉素為什么會導(dǎo)致菠菜的性別轉(zhuǎn)化缺乏深入的研究。本研究以日本大葉菠菜為供試材料，采用外源赤霉素處理受試菠菜植株，觀察處理前后菠菜性別變化的情況，并利用菠菜Y染色體緊密連鎖雄性特異標記T11A對性反轉(zhuǎn)植株進行基因組檢測，從分子水平探討其對雌雄異株植物菠菜性別分化的影響，本研究結(jié)果為進一步揭示赤霉素對菠菜性別分化影響的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗材料

供試材料為日本大葉菠菜。2013—2014年連續(xù)在河南師范大學(xué)植物組織培養(yǎng)室種植菠菜。種植前先將種子進行人工春化（4 ℃，7 d左右），然后播種于含有培養(yǎng)土和蛭石（培養(yǎng)土、蛭石體積比為1 ∶[KG-*3]1.5）的土壤中（混合后放入植物組織培養(yǎng)室常用的小型花盆中），并給予充足的水分。培養(yǎng)條件為光照14～16 h、黑暗8～10 h的長日照，均采用日光燈管照明，經(jīng)照度計檢測光照度為3 000 lx，培養(yǎng)溫度（20±2）℃，直至全部正常開花。

1.2試驗方法

1.2.1赤霉素處理

將種植的菠菜隨機分為2組，試驗組和對照組，每組均為100株。對試驗組進行處理，根據(jù)前期學(xué)者研究結(jié)果[1]，將赤霉素處理濃度定為50 mg/L，對每株菠菜植株均勻噴灑赤霉素，對照組則噴水。每隔3 d用同一濃度赤霉素處理1次，處理后觀察植株的變化，隨后均正常澆水。試驗組由于每棵植株開花時間略有差異，因此每隔2 d統(tǒng)計1次，統(tǒng)計時嚴格按照菠菜雌雄植株開花特點，準確區(qū)分絕對雌株、絕對雄株及兩性株，直至試驗組和對照組菠菜植株均全部正常開花。

1.2.2性反轉(zhuǎn)植株的分子檢測

為了檢測性反轉(zhuǎn)產(chǎn)生的分子機制，進行如下處理：在赤霉素處理之前，剪取培養(yǎng)約2周的菠菜葉片，用改良的2×CTAB法提取每株菠菜的DNA[9-10]，用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異標記T11A分子標記[11]鑒定菠菜的原始性別，引物序列為T11A-F，5′-CCCTAATTAACTCCTCTTTACCCAA-3′；T11A-R，5′-TACAAGCCCCATTATCATAACAGTC-3′。T11A反應(yīng)體系（20 μL）為0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，14.4 μL H2O，2 μL buffer，1.5 μL dNTP，0.1 μL Taq DNA聚合酶；其擴增程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，4 ℃恒溫；另外，對赤霉素處理后的菠菜植株的開花情況進行性別統(tǒng)計，將統(tǒng)計結(jié)果與處理前鑒定的菠菜原始性別進行比較，找出發(fā)生性別反轉(zhuǎn)的植株，保存葉片，提取DNA，并再次利用T11A對性反轉(zhuǎn)植株進行鑒定，并借助瓊脂糖凝膠電泳檢測處理前后條帶變化情況。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1赤霉素處理對菠菜性別分化的影響[HT]

赤霉素處理后菠菜形態(tài)特征產(chǎn)生一些變化，與對照組相比，試驗組在第1次處理后植株有了明顯的生長，表現(xiàn)為植株莖稈變長、明顯粗壯、開花期提前。

赤霉素處理對菠菜性別分化的影響也非常明顯，如表1所示，與對照組相比，試驗組雌雄比例（1.33）明顯大于對照組（0.96）。另外，在發(fā)生性反轉(zhuǎn)植株中，雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑昱c雄株轉(zhuǎn)變?yōu)榇浦甑谋壤秊?.14，結(jié)果表明50 mg/L赤霉素對雌雄異株菠菜的性別分化有明顯的影響，既有利于雌株的分化又有利于雄株的分化。

3討論

關(guān)于植物的性別分化，分子水平上的研究結(jié)果表明，植物的性別分化就是性別決定基因在誘導(dǎo)信號等作用下，發(fā)生去阻遏作用，使特異基因選擇性地表達，從而實現(xiàn)性別分化程序表達的過程[2]。赤霉素作為一種誘導(dǎo)信號，在高等植物的各個生長發(fā)育階段都具有重要的調(diào)控作用[3]。外源赤霉素常常用作調(diào)節(jié)植物生長和性別分化。赤霉素經(jīng)常被認為是男性荷爾蒙，赤霉素處理可以誘導(dǎo)黃瓜和菠菜的雌株雄性化[12]。在番木瓜上噴施赤霉素抑制劑，可以誘導(dǎo)雄株上出現(xiàn)心皮發(fā)育，說明了赤霉素在保持番木瓜雄性特征中的作用[13]。

性反轉(zhuǎn)是指生物個體從一種性別特征轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N相反的性別特征的性別轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。這一現(xiàn)象在動物中比較常見，也研究的比較透徹。李尚偉等利用抑制性差減雜交技術(shù)（SSH），結(jié)合SMART cDNA合成和RACE-PCR方法，從性反轉(zhuǎn)雄魚性腺中克隆到鈣調(diào)蛋白基因（ECaM），進一步分析表明ECaM基因可能是促使石斑魚由雌向雄轉(zhuǎn)變的重要功能基因之一[14]。劉曉翌等探討了人類性反轉(zhuǎn)綜合征發(fā)生與性別分化相關(guān)基因[WTBX][STBX]SRY、SOX9[WTBZ][STBZ]之間的關(guān)系，研究結(jié)果表明SRY易位是導(dǎo)致性反轉(zhuǎn)發(fā)生的重要原因之一，某些性反轉(zhuǎn)的發(fā)生可能與[WTBX][STBX]SOX9[WTBZ][STBZ]基因異常有關(guān)[15]。性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象在植物中也時有發(fā)生，但是對其分子機理研究未見相關(guān)報道。本研究利用菠菜Y染色體緊密連鎖雄性特異的T11A分子標記對菠菜性反轉(zhuǎn)植株進行檢測，結(jié)果表明，赤霉素處理菠菜可以導(dǎo)致雌株轉(zhuǎn)變?yōu)樾壑?，也可以?dǎo)致雄株轉(zhuǎn)變?yōu)榇浦辏淮浦贽D(zhuǎn)變雄株，雄性特異條帶出現(xiàn)；雄株轉(zhuǎn)變?yōu)榇浦?，雄性特異條帶消失。目前，未有決定菠菜性別基因克隆的報道，如果利用抑制性差減雜交技術(shù)篩選到菠菜性反轉(zhuǎn)前后的差異表達基因，將可能會為揭示菠菜發(fā)生性反轉(zhuǎn)的分子機制提供線索。此外，在菠菜性反轉(zhuǎn)過程中，Y染色體緊密連鎖雄性特異的T11A分子標記為什么會出現(xiàn)或者消失，以及其與性別決定基因的關(guān)系還需要進一步進行深入研究。

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