秦瑞云+王少凈+劉新鑫+杜亞茹+王冰肖+李忠徽+閆寧寧+李書粉+高武軍+鄧傳良

摘要：以日本大葉菠菜為供試材料，采用溫室內盆栽種植的方式，利用赤霉素（GA3）進行處理，探討其對雌雄異株植物菠菜性別分化的影響。結果表明，試驗組在第1次處理后植株就有明顯的生長，表現為植株莖稈變長、較對照組粗壯、開花期提前。與對照組相比，試驗組雌雄比例（1.33）明顯大于對照組（0.96）。此外，發(fā)生性反轉植株中，雌株轉變?yōu)樾壑昱c雄株轉變?yōu)榇浦甑谋壤秊?.14。利用Y染色體緊密連鎖的雄性特異T11A分子標記對性反轉植株進行檢測，結果表明，雌株轉變?yōu)樾壑?，雄性特異條帶出現；雄株轉變?yōu)榇浦辏坌蕴禺悧l帶消失。本研究結果為進一步研究激素對菠菜性別分化影響的分子機制奠定了基礎。

關鍵詞：菠菜；赤霉素（GA3）；T11A分子標記；性反轉；性別分化

中圖分類號： S636.101文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0133-02

菠菜（Spinacia oleracea L.）為藜科菠菜屬一年生或二年生草本植物，染色體組成為（2n=2x=12），具有生長周期短、表型豐富、營養(yǎng)價值高等特點，是一種大面積種植的蔬菜作物。菠菜系雌雄異株植物，其性別分化不但受到性別決定基因控制，還受到激素的影響[1]。在早期研究中，Chailakhyan等認為在長日照類型的菠菜中，赤霉素對性別表現的影響為促進雄性化[2]；El-Gizawy等的研究也表明赤霉素處理菠菜具有促雄作用[3-4]；而曹宗巽等則報道赤霉素在菠菜中有促雌作用[1]。由此可見，不同研究學者利用赤霉素處理菠菜，其誘導結果是有差異的。赤霉素對其他植物性別分化的影響也不盡相同，赤霉素可以促使某些植物雄性化，但是也可以導致某些植物雌性化，赤霉素對黃瓜雌性系性別分化的影響表現為能促進雄花分化，阻礙雌花分化[5]。在赤霉素對小桐子處理的試驗中，結果表明外施赤霉素誘導小桐子雌花中原來停止發(fā)育的雄蕊重新正常發(fā)育，進而將其變成兩性花[6]。在玉米不同的發(fā)育階段，對葉面噴施赤霉素，能夠使玉米雄花穗變成雌性、雄性不育或保持雄性可育[7]。赤霉素還可以誘導寬葉慈菇雄株及三性花同株向雌株性別的轉換[8]。

盡管前期有不少學者研究了赤霉素對菠菜性別分化的影響，并得出了不同的結論，但是其研究結果只關注于赤霉素對菠菜外觀形態(tài)特征的影響，至于赤霉素為什么會導致菠菜的性別轉化缺乏深入的研究。本研究以日本大葉菠菜為供試材料，采用外源赤霉素處理受試菠菜植株，觀察處理前后菠菜性別變化的情況，并利用菠菜Y染色體緊密連鎖雄性特異標記T11A對性反轉植株進行基因組檢測，從分子水平探討其對雌雄異株植物菠菜性別分化的影響，本研究結果為進一步揭示赤霉素對菠菜性別分化影響的分子機制奠定了基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

供試材料為日本大葉菠菜。2013—2014年連續(xù)在河南師范大學植物組織培養(yǎng)室種植菠菜。種植前先將種子進行人工春化（4 ℃，7 d左右），然后播種于含有培養(yǎng)土和蛭石（培養(yǎng)土、蛭石體積比為1 ∶[KG-*3]1.5）的土壤中（混合后放入植物組織培養(yǎng)室常用的小型花盆中），并給予充足的水分。培養(yǎng)條件為光照14～16 h、黑暗8～10 h的長日照，均采用日光燈管照明，經照度計檢測光照度為3 000 lx，培養(yǎng)溫度（20±2）℃，直至全部正常開花。

1.2試驗方法

1.2.1赤霉素處理

將種植的菠菜隨機分為2組，試驗組和對照組，每組均為100株。對試驗組進行處理，根據前期學者研究結果[1]，將赤霉素處理濃度定為50 mg/L，對每株菠菜植株均勻噴灑赤霉素，對照組則噴水。每隔3 d用同一濃度赤霉素處理1次，處理后觀察植株的變化，隨后均正常澆水。試驗組由于每棵植株開花時間略有差異，因此每隔2 d統(tǒng)計1次，統(tǒng)計時嚴格按照菠菜雌雄植株開花特點，準確區(qū)分絕對雌株、絕對雄株及兩性株，直至試驗組和對照組菠菜植株均全部正常開花。

1.2.2性反轉植株的分子檢測

為了檢測性反轉產生的分子機制，進行如下處理：在赤霉素處理之前，剪取培養(yǎng)約2周的菠菜葉片，用改良的2×CTAB法提取每株菠菜的DNA[9-10]，用菠菜Y染色體緊密連鎖的雄性特異標記T11A分子標記[11]鑒定菠菜的原始性別，引物序列為T11A-F，5′-CCCTAATTAACTCCTCTTTACCCAA-3′；T11A-R，5′-TACAAGCCCCATTATCATAACAGTC-3′。T11A反應體系（20 μL）為0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，14.4 μL H2O，2 μL buffer，1.5 μL dNTP，0.1 μL Taq DNA聚合酶；其擴增程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，4 ℃恒溫；另外，對赤霉素處理后的菠菜植株的開花情況進行性別統(tǒng)計，將統(tǒng)計結果與處理前鑒定的菠菜原始性別進行比較，找出發(fā)生性別反轉的植株，保存葉片，提取DNA，并再次利用T11A對性反轉植株進行鑒定，并借助瓊脂糖凝膠電泳檢測處理前后條帶變化情況。

2結果與分析

[HTK]2.1赤霉素處理對菠菜性別分化的影響[HT]

赤霉素處理后菠菜形態(tài)特征產生一些變化，與對照組相比，試驗組在第1次處理后植株有了明顯的生長，表現為植株莖稈變長、明顯粗壯、開花期提前。

赤霉素處理對菠菜性別分化的影響也非常明顯，如表1所示，與對照組相比，試驗組雌雄比例（1.33）明顯大于對照組（0.96）。另外，在發(fā)生性反轉植株中，雌株轉變?yōu)樾壑昱c雄株轉變?yōu)榇浦甑谋壤秊?.14，結果表明50 mg/L赤霉素對雌雄異株菠菜的性別分化有明顯的影響，既有利于雌株的分化又有利于雄株的分化。

3討論

關于植物的性別分化，分子水平上的研究結果表明，植物的性別分化就是性別決定基因在誘導信號等作用下，發(fā)生去阻遏作用，使特異基因選擇性地表達，從而實現性別分化程序表達的過程[2]。赤霉素作為一種誘導信號，在高等植物的各個生長發(fā)育階段都具有重要的調控作用[3]。外源赤霉素常常用作調節(jié)植物生長和性別分化。赤霉素經常被認為是男性荷爾蒙，赤霉素處理可以誘導黃瓜和菠菜的雌株雄性化[12]。在番木瓜上噴施赤霉素抑制劑，可以誘導雄株上出現心皮發(fā)育，說明了赤霉素在保持番木瓜雄性特征中的作用[13]。

性反轉是指生物個體從一種性別特征轉變?yōu)榱硪环N相反的性別特征的性別轉變現象。這一現象在動物中比較常見，也研究的比較透徹。李尚偉等利用抑制性差減雜交技術（SSH），結合SMART cDNA合成和RACE-PCR方法，從性反轉雄魚性腺中克隆到鈣調蛋白基因（ECaM），進一步分析表明ECaM基因可能是促使石斑魚由雌向雄轉變的重要功能基因之一[14]。劉曉翌等探討了人類性反轉綜合征發(fā)生與性別分化相關基因[WTBX][STBX]SRY、SOX9[WTBZ][STBZ]之間的關系，研究結果表明SRY易位是導致性反轉發(fā)生的重要原因之一，某些性反轉的發(fā)生可能與[WTBX][STBX]SOX9[WTBZ][STBZ]基因異常有關[15]。性反轉現象在植物中也時有發(fā)生，但是對其分子機理研究未見相關報道。本研究利用菠菜Y染色體緊密連鎖雄性特異的T11A分子標記對菠菜性反轉植株進行檢測，結果表明，赤霉素處理菠菜可以導致雌株轉變?yōu)樾壑?，也可以導致雄株轉變?yōu)榇浦?；雌株轉變雄株，雄性特異條帶出現；雄株轉變?yōu)榇浦?，雄性特異條帶消失。目前，未有決定菠菜性別基因克隆的報道，如果利用抑制性差減雜交技術篩選到菠菜性反轉前后的差異表達基因，將可能會為揭示菠菜發(fā)生性反轉的分子機制提供線索。此外，在菠菜性反轉過程中，Y染色體緊密連鎖雄性特異的T11A分子標記為什么會出現或者消失，以及其與性別決定基因的關系還需要進一步進行深入研究。

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